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音標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第1篇

【關(guān)鍵詞】 高血壓 趨化因子 單核細(xì)胞 基因表達(dá) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是常見(jiàn)的心血管疾病，也是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為EH是一種與遺傳、環(huán)境、代謝極為相關(guān)的復(fù)雜疾病[1～3]，當(dāng)EH與其他相關(guān)危險(xiǎn)因素并存時(shí)，單純的血壓控制只能使不到60%的患者獲益，而危險(xiǎn)因素的干預(yù)才能獲得更大的益處。因此，積極探討EH的發(fā)病機(jī)制及其影響因素，對(duì)更有效的控制EH，減輕其危害已成為醫(yī)務(wù)工作者的共識(shí)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，炎癥可能在EH的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[4]，2007年2月～12月實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EH患者外周血單核細(xì)胞趨化因子1（monocyte chemotactic protein1，MCP1）蛋白水平及單個(gè)核細(xì)胞MCP1 mRNA的表達(dá)，探討外周血MCP1的變化與EH的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象及分組

按《中國(guó)高血壓防治指南（2005年修訂版）》[5]制定的標(biāo)準(zhǔn)，選取心血管科住院和門(mén)診新診斷或未經(jīng)正規(guī)降壓治療的EH患者62例，同時(shí)選取血壓正常的30例健康體檢者作為對(duì)照組。排除繼發(fā)性高血壓、血栓出血性疾病、糖尿病、高脂血癥、感染、嚴(yán)重肝腎疾病、自身免疫性疾病及腫瘤性疾病，排除近期有手術(shù)或外傷史等影響MCP1的因素。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液（上海捷瑞），Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen），焦炭酸二乙酯（瑞興），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega），PCR試劑盒（Promega），100 bp DNA Ladder Marker、D2000 DNA Marker（天根生化），人MCP1 ELISA 試劑盒（美國(guó)R＆D公司）；ULT13863三洋-80 ℃低溫冰箱(日本)，5745臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó))，Eppendorff centrifuge 5810R 高速離心機(jī)，Amersham核酸蛋白分析儀，PCR儀（PE geneAmp PCR System 2400）（Perkin Elmer），DNA成像分析儀（Gel Doc EQ，BioRad），酶標(biāo)儀（ELx800，BioTek公司）。MCP1引物設(shè)計(jì)由上海生工合成，上游引物5' AGGAAGATCTCAGTGCAGAGG 3'，下游引物5' – AGTCTTCGGAGTTTGGGTTTG 3'；βaction：上游引物5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT 3'，下游引物5'GGGCACGAAGGCTCATCATT 3'。

1.2.2 標(biāo)本采集 受檢者空腹12 h，于次日清晨6∶00～7∶00采集肘正中靜脈血8 ml，其中4 ml置普通生化管中，室溫靜置2 h，自然凝固后予離心10 min，1 000 r/min收集上清液置于-80℃冰箱保存待測(cè)；另4 ml置于EDTA抗凝試管中搖勻后即刻置40 ℃冰箱冷存，于6 h內(nèi)提取RNA用。

1.2.3 外周血MCP1蛋白含量測(cè)定 用保存待測(cè)的血清，依照MCP1 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟操作。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下各孔吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算標(biāo)本中MCP1的濃度。

1.2.4 人血單個(gè)核細(xì)胞中RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR） 淋巴細(xì)胞分離液提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞后，按照說(shuō)明書(shū)的步驟提取總RNA；按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟合成cDNA，并用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠跑電泳，溴乙錠顯色。測(cè)定各條帶灰度值，以βactin為內(nèi)參，用MCP1與βactin的灰度比值定量MCP1。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

EH組及對(duì)照組的一般資料見(jiàn)表1。兩組研究對(duì)象的年齡、性別、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇、空腹血糖和外周血白細(xì)胞比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表1 EH組及對(duì)照組的基本資料注：TC示總膽固醇，TG示甘油三酯，F(xiàn)BG示空腹血糖，LDL示低密度脂蛋白，HDL示高密度脂蛋白，WBC示白細(xì)胞。

2.2 MCP1水平及MCP1 mRNA表達(dá)

見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，EH組外周血MCP1蛋白水平及單個(gè)核細(xì)胞MCP1mRNA表達(dá)均顯著增高（P＜0.01)。表2 外周血MCP1水平及單個(gè)核細(xì)胞MCP1mRNA表達(dá)注：（1）與對(duì)照組比較， P＜0.01。

3 討論

EH是最常見(jiàn)的心血管疾病之一。傳統(tǒng)觀(guān)念認(rèn)為，EH是多種因素引起的血液流變學(xué)異常，表現(xiàn)為心搏出量和（或）外周阻力增加，治療目標(biāo)也僅限于用藥物控制血壓。隨著對(duì)EH發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)在EH發(fā)生發(fā)展的不同階段，血管炎癥是一個(gè)主要的、共同的病理特征，提示EH與炎癥關(guān)系密切[6]。

MCP1為堿性蛋白，屬于趨化因子超家族，可由炎癥介質(zhì)刺激的單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分泌。MCP1在體內(nèi)及體外均有強(qiáng)大的誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞聚集、附壁、游走的功能，是炎癥的始動(dòng)因子及標(biāo)志[7]。研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓患者外周血MCP1蛋白含量升高，認(rèn)為EH可能是一種慢性炎癥過(guò)程[8]。本研究顯示，EH患者外周血MCP1蛋白水平顯著升高，提示MCP1可能參與了EH的病理生理過(guò)程。因此，積極探索控制炎癥的方法可能是高血壓乃至冠心病具有前景的治療策略之一。

EH患者外周血MCP1升高的機(jī)制尚不十分明了，可能來(lái)源于與內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等上調(diào)表達(dá)MCP1 mRNA有關(guān)，但外周血MCP1蛋白的升高是否與外周血單個(gè)核細(xì)胞中MCP1 mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示，與對(duì)照組比較，單純EH組外周血單個(gè)核細(xì)胞中MCP1 mRNA表達(dá)顯著增高，提示外周血單個(gè)核細(xì)胞的MCP1 mRNA表達(dá)上調(diào)可能是導(dǎo)致EH患者外周血MCP1蛋白含量升高的一個(gè)因素，但是否與內(nèi)皮細(xì)胞等其它因素有關(guān)，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。由于MCP1蛋白可能進(jìn)一步激活CCR2趨化因子受體，介導(dǎo)趨化活性，使單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生移行，黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步損傷血管內(nèi)皮[9]，使其產(chǎn)生更多的炎癥因子，加速血管重構(gòu)，使血管壁順應(yīng)性下降，從而使血壓升高。因此，針對(duì)炎癥的治療，或許對(duì)控制血壓有一定意義。

參考文獻(xiàn)

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音標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第2篇

【摘要】 目的 構(gòu)建細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白基因的重組表達(dá)質(zhì)粒ferritin/pET-28a，表達(dá)、純化出重組蛋白，并對(duì)重組蛋白的免疫學(xué)特性進(jìn)行初步研究。方法 將目的基因亞克隆至表達(dá)載體pET-28a，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)plysS，加入IPTG對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)Ni2+的His-bind樹(shù)脂柱純化出重組蛋白，用50μg/100μL免疫ICR小鼠，獲得抗血清，通過(guò)western-blot及ELISA對(duì)重組鐵蛋白的免疫學(xué)特性進(jìn)行初步研究。結(jié)果 表達(dá)并純化出分子量約19kD重組鐵蛋白，western-blot顯示重組蛋白免疫制備的抗血清可識(shí)別純化的重組蛋白及抗原囊液、原頭蚴，位置大致相同，約19kD。ELISA結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組小鼠血清中IgG的OD值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論 細(xì)粒棘球蚴重組鐵蛋白Eg.ferritin具有較好的抗原性及免疫原性，具有成為包蟲(chóng)疫苗候選分子的潛能。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)粒棘球蚴；重組鐵蛋白；純化；免疫特性

鐵蛋白(ferritin)是普遍存在于生物體內(nèi)的一種保守性較高的多功能多亞基蛋白，其作用是儲(chǔ)存鐵，對(duì)生物體內(nèi)鐵含量進(jìn)行調(diào)控，在生物體內(nèi)鐵含量過(guò)多時(shí)起到解毒作用［1-2］，它的存在保證了生命體的正常活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)中心已構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒ferritin/pGEX-6p-1，但由于重組蛋白ferritin/GST以包涵體形式存在于細(xì)胞中，無(wú)法通過(guò)親和層析柱純化出單一的Eg.ferritin［3］。只能通過(guò)切膠純化的方法獲得融合蛋白Ferritin/GST，雖然試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該融合蛋白具有較好的抗原性及免疫原性，但影響蛋白特性的因素較多，不能很好的反映蛋白的實(shí)際特性，因此本次試驗(yàn)將鐵蛋白基因重組到表達(dá)質(zhì)粒pET-28a中，pET-28a是個(gè)高效表達(dá)載體，能純化變性及非變性的蛋白，通過(guò)表達(dá)純化可獲得較純的Eg.ferritin，以便更好地研究蛋白的特性，為鐵蛋白能成為包蟲(chóng)病候選疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌種 Eg.ferritin/pGEM-T/JM109及E.coli BL21(DE3)plysS由本室保存；pET-28a表達(dá)載體購(gòu)自Novagen公司。

1.2 試劑 T4連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、Not I、IPTG、N'N'N'N-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自Promega公司；β-巰基乙醇、二甲基亞砜、弗氏完全(不完全)佐劑、過(guò)硫酸銨、Tween-20等試劑購(gòu)自于SIGMA公司；考馬斯亮藍(lán)購(gòu)自BIOMOL公司；酵母提取物、蛋白提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司；蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自北京賽百盛；卡那霉素、TMB、4-氯-1-奈酚購(gòu)自AMRESCO；羊抗鼠HRP-IgG、質(zhì)粒DNA提取試劑盒等購(gòu)自北京華美公司；DNA純化回收試劑盒購(gòu)自北京賽百盛生物有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所；含Ni2+的His-bind樹(shù)脂純化試劑盒購(gòu)自Novagen公司；其它常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，6～8周，(18±2)g，雌性，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 Eg.ferritin/pET-28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 取Eg.ferritin/pGEM-T/JM109菌株劃板接菌［4］，并挑單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)堿裂解法提取重組質(zhì)粒；同時(shí)取適量的表達(dá)載體pET-28a，將兩者分別用BamH I，Not I進(jìn)行雙酶切處理，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離帶有雙黏性末端的目的片段和表達(dá)載體，切膠，經(jīng)DNA回收試劑盒純化目的片段及載體。目的片段與表達(dá)載體在T4連接酶的作用下，16℃連接過(guò)夜。繼而將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到已制備好的感受態(tài)菌BL21(DE3)plysS中［5］，經(jīng)含卡那霉素終濃度為50μg/mL的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性菌株［6］。挑取陽(yáng)性菌株含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒純化重組質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I，Not I進(jìn)行酶切鑒定。

1.5 重組鐵蛋白的表達(dá)、純化

1.5.1 重組蛋白的表達(dá) 將重組菌接種于含卡那霉素(終濃度為50μg/mL)的3mL 的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，按1∶50接種于50mL培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.05mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h，4℃ 4000r/min 離心15min，棄上清，收集細(xì)菌沉淀，SDS-PAGE觀(guān)察表達(dá)情況。

1.5.2 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 將樣本與2×SDS-PAGE樣本緩沖液混合，經(jīng)12% SDS-PAGE，180V電壓，電泳至溴酚蘭指示劑到膠底為止，用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色2h，用含7%冰醋酸5%甲醇的脫色液脫色至本底無(wú)色。

1.5.3 重組抗原的純化及制備 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式存在，按照Novagen公司His-bind樹(shù)脂純化試劑盒說(shuō)明書(shū)中的包涵體大量純化方法進(jìn)行純化，然后將純化好的包涵體蛋白放入透析袋中，用1×PBS透析去除尿素。

1.6 動(dòng)物免疫及特異性抗血清的制備

1.6.1 動(dòng)物免疫 ICR小鼠分兩組，即免疫組與對(duì)照組，每組10只。1)免疫組每只注射弗氏佐劑與重組抗原Eg.ferritin的乳化劑50μg/100μL。對(duì)照組注射弗氏佐劑和PBS的乳化劑100μL。根據(jù)Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝膠分析系統(tǒng)對(duì)純化的抗原進(jìn)行定量。2)免疫方法 每組小鼠在0、2、4周各免疫1次，共3次，第1次基礎(chǔ)免疫用弗氏完全佐劑，以后2次為加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑。采用背部皮下多點(diǎn)注射免疫，每次注射量為100μL/只。分別于0、2、4、6周斷尾采血，共4次，8周眼眶取血并處死小鼠。

1.6.2 特異性抗血清的制備 將血液4000r/min 離心 10min，提取血清，-20℃保存。

1.7 血清特異性識(shí)別 純化的重組抗原Eg.ferritin、天然可溶性抗原囊液、原頭蚴通過(guò)10%分離膠及5%的濃縮膠，180V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE電泳 1h。在30mA下對(duì)硝酸纖維膜進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移1h。然后將硝酸纖維膜浸入5%的脫脂奶粉溶液中，37℃ 封閉1h，以PBS-T(PBS中含0.5‰ Tween-20)溶液洗3次，每次5min。再將硝酸纖維膜剪開(kāi)分別浸泡于1∶100稀釋的Eg.ferritin免疫的特異性小鼠抗血清及對(duì)照組鼠血清中，4℃ 過(guò)夜。次日將膜用PBS-T溶液洗3次，每次5min，然后與1∶1000稀釋的羊抗鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合，37℃反應(yīng)1h。再以PBS-T溶液洗4次，每次10min。加入新配制的底物液(6mg 4-氯-1-奈酚，2mL冷甲醇，10mL的TBS，12μL的H2O2)37℃顯色5min，最后用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。

1.8 抗血清中IgG的測(cè)定 采用ELISA法，用純化的Eg.ferritin 5μg/mL包被酶標(biāo)板100μL/孔，4℃過(guò)夜。次日，PBS-T洗3次，5％牛奶封閉100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗3次，取0～8周的免疫組及對(duì)照組小鼠血清作為一抗，按1∶100稀釋?zhuān)?00μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，羊抗鼠HRP-IgG為二抗，按1∶1000稀釋?zhuān)?00μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，加入顯色劑100μL/孔，待對(duì)照孔顯色時(shí)，加入2M H2SO4 50μL/孔 終止反應(yīng)。以包被抗原及進(jìn)行牛奶封閉的孔為空白調(diào)零，置酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，采用兩樣本t檢驗(yàn)的方法對(duì)測(cè)定的OD值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)質(zhì)粒Eg.ferritin/pET-28a的酶切鑒定

將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒Eg.ferritin/pET-28a 用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Not I 雙酶切后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到插入片斷大小約560bp，與目的基因片段相符。M1.Lambda DNA/HindⅢMarker；1.pET-28a空質(zhì)粒；2.Eg·ferritin/

2.2 Eg.ferritin 的純化

含Ni2+的His-bind樹(shù)脂親合柱純化Eg.ferritin/pET-28a表達(dá)的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量可知，純化蛋白的分子量約19kD.

2.3 特異性抗血清識(shí)別純化蛋白和天然抗原

純化Eg.ferritin免疫小鼠制備的抗血清可特異性識(shí)別未純化的重組Eg.ferritin，純化的Eg.ferritin 及天然抗原(原頭蚴、囊液)，識(shí)別蛋白條帶的位置大致相同約19kD(見(jiàn)圖3)。

2.4 小鼠血清IgG水平變化

根據(jù)對(duì)小鼠血清IgG水平在0～8周變化趨勢(shì)的檢測(cè)及對(duì)免疫組和對(duì)照組小鼠血清IgG的比較發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中IgG的水平隨著免疫次數(shù)及時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，免疫4周以后同一時(shí)期的免疫組小鼠血清中的IgG水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。表1 兩組小鼠免疫不同時(shí)間血清IgG水平變化

3 討論

本實(shí)驗(yàn)將細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白基因重新克隆到表達(dá)載體pET-28a上，主要考慮：① pET-28a表達(dá)載體具有高效表達(dá)的能力［7］；② pET28a質(zhì)粒在插入目的DNA后表達(dá)的蛋白N 末端含6個(gè)組氨酸，它作為His標(biāo)簽蛋白，可與Ni2+鰲合，使得重組融合蛋白在變性或非變性狀態(tài)下均可被含Ni2+的His-band 樹(shù)脂親合柱純化，即使被純化的重組蛋白含量很低也能被有效地純化出來(lái)?？朔吮局行囊呀?jīng)構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒ferritin/pGEX-6p-1表達(dá)的重組蛋白ferritin/GST不能通過(guò)GSTTrapTMFF親和層析柱純化的弊端［3］；③重組蛋白是標(biāo)簽蛋白His和目的蛋白共同組成的融合蛋白，為獲取目的蛋白，本應(yīng)通過(guò)相應(yīng)的剪切酶將標(biāo)簽蛋白剪切下來(lái)，但由于N-末端組氨酸所表達(dá)的蛋白分子量很小，它的存在不改變目的蛋白的活性，所以無(wú)須去除。這不僅能減少實(shí)驗(yàn)步驟，降低純化蛋白在酶切過(guò)程中的損失，同時(shí)還可節(jié)省用來(lái)購(gòu)買(mǎi)剪刀酶的費(fèi)用，為后續(xù)研究提供了較好的實(shí)驗(yàn)材料?；诖宋覀兊玫搅艘粋€(gè)高效表達(dá)且易于純化重組蛋白的基因工程菌株，并得到了較純的重組蛋白，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Eg.ferritin作為抗原可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生較強(qiáng)的的體液免疫應(yīng)答，證明其有良好的抗原性；免疫血清與細(xì)粒棘球蚴天然抗原(囊液和原頭蚴)的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫血清能夠較好地識(shí)別天然抗原中位于19kD處的條帶，說(shuō)明Eg.ferritin具有較好免疫原性，由此推測(cè)中國(guó)大陸株細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白基因具有作為包蟲(chóng)疫苗候選分子的潛能，為進(jìn)行重組鐵蛋白對(duì)宿主的免疫保護(hù)性及保護(hù)性機(jī)制等方面研究的可能性提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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音標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第3篇

【關(guān)鍵詞】癌；肝細(xì)胞；NF-κB；免疫組織化學(xué)；表達(dá)

文章編號(hào)：1009-5519（2008）12-1746-03 中圖分類(lèi)號(hào)：R73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB是與免疫球蛋白κ輕鏈增強(qiáng)子B區(qū)結(jié)合，具有和某些基因上啟動(dòng)子區(qū)固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)該基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。NF-κB是具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種基因(免疫、炎癥反應(yīng)、病毒和原癌基因)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[1]。激活的NF-κB參與癌癥的啟動(dòng)、發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，在炎癥性相關(guān)的肝癌（HCC）發(fā)生發(fā)展中呈高表達(dá)，在肝細(xì)胞炎癥與癌變間起橋梁作用，其中包括肝臟免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)基因、肝炎病毒相關(guān)基因和原癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在肝癌組織中異常激活，可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞存活，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。本文采用免疫組織化學(xué)方法，分析了按自身配對(duì)法留取的肝癌患者術(shù)后肝癌的癌灶組織和癌周組織標(biāo)本中NF-κB表達(dá)、胞內(nèi)分布及其臨床病理特征。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象：于2005～2007年間，按自身配對(duì)法收取南通大學(xué)附屬醫(yī)院原發(fā)性肝癌患者35例(男29例，女6例)術(shù)后新鮮肝臟組織，分別留取肝癌切除后的癌灶組織、癌周組織(距癌灶邊緣5 cm)各35份(每份約200 mg)，除部分作組織病理學(xué)檢查外，其余置組織-85℃保存。35份標(biāo)本中肝癌腫塊直徑≥5 cm 7例，

1.2 試劑與標(biāo)本切片：兔抗人NF-κB多克隆抗體及S-P免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。新鮮肝組織標(biāo)本經(jīng)取材，以10％中爾馬林固定，石蠟包埋，制成厚度4 μm的組織切片。

1.3 免疫組織化學(xué)分析NF-κB（S-P法）：NF-κB在癌組織和癌周組織中的表達(dá)均采用免疫組織化學(xué)S-P法。4 μm厚的組織切片按常規(guī)脫蠟、水化；雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；高壓加熱法修復(fù)抗原；正常動(dòng)物血清封閉非特異性結(jié)合；滴加NF-κB抗體，4 ℃過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗；滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育10 min，PBS漂洗；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶，室溫孵育10 min，PBS沖洗；滴加新鮮配制的四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液，室溫顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素復(fù)染。無(wú)水乙醇脫水透明、封片。OLYMPUS BX 50光學(xué)顯微鏡觀(guān)察、攝像。以0.01 mol/L PBS液(pH=7.5)分別替代一抗、二抗和SP試劑作陰性對(duì)照，已知表達(dá)NF-κB的肝癌組織作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 NF-κB判斷標(biāo)準(zhǔn)：肝組織中NF-κB表達(dá)強(qiáng)度，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率分為NF-κB表達(dá)弱陽(yáng)性(+)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為10%～25%；NF-κB表達(dá)陽(yáng)性(++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為26%～75%；NF-κB表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：以stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件分析和處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析和處理，以P

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中NF-κB表達(dá)的胞內(nèi)分布與定位：肝癌組織及其癌周組織中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色。癌組織中NF-κB表達(dá)呈巢狀分布，深染，細(xì)胞胞漿和細(xì)胞胞核均呈陽(yáng)性；而它對(duì)應(yīng)的癌周組織NF-κB陽(yáng)性表達(dá)，主要定位于胞漿，而細(xì)胞核無(wú)明顯的陽(yáng)性著色。鏡下定性觀(guān)察肝癌組織中NF-κB表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌周組織。

2.2 肝癌與癌周組織中NF-κB表達(dá)差異：肝癌的癌灶組織與癌周組織中NF-κB表達(dá)差異見(jiàn)表1。

2.3 肝癌組織NF-κB表達(dá)的病理學(xué)特征分析：見(jiàn)表2。NF-κB在癌組織的陽(yáng)性率為100%，其N(xiāo)F-κB表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的分化程度、腫瘤數(shù)目、HBsAg和腫瘤大小間的關(guān)系，經(jīng)確切概率法分析，各組間均差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.4 癌旁組織NF-κB表達(dá)的病理學(xué)特征分析：癌旁組織中NF-κB表達(dá)與癌灶組織相比，表達(dá)強(qiáng)度低，有近1/3的癌旁組織中未見(jiàn)NF-κB的表達(dá)。NF-κB表達(dá)的病理學(xué)特征見(jiàn)表3，NF-κB在癌旁組織的陽(yáng)性率為68.6%(24/35)，NF-κB表達(dá)強(qiáng)度與分化程度、腫瘤數(shù)目、HBsAg、腫瘤直徑間的關(guān)系，經(jīng)確切概率法分析，各組差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

3 討論

NF-κB是一個(gè)具有廣泛生物活性的轉(zhuǎn)錄因子，受多種信號(hào)途徑調(diào)控，同時(shí)也調(diào)控多種信號(hào)途徑，作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的一個(gè)樞紐參與多種生理過(guò)程的調(diào)控，其表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的多種病理改變[3]。NF-κB主要存在于胞質(zhì)中，與NF-κB抑制蛋白(IκB)家族成員結(jié)合，形成無(wú)活性的三聚體。當(dāng)其受到細(xì)胞因子、有絲分裂原、病毒等刺激后，IκBα通過(guò)磷酸化、泛素化而降解，從而使NF-κB的核定位信號(hào)暴露，NF-κB進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[4]。NF-κB在炎癥與腫瘤的聯(lián)系中起作用，是調(diào)控癌細(xì)胞凋亡的主要因子，能調(diào)節(jié)腫瘤的血管生成與侵襲能力[5]。我們采用免疫組織化學(xué)方法，分析了人肝癌及癌周組織中NF-κB的組織分布及其臨床病理特征。在眾多被感染和炎癥所活化的信號(hào)途徑中，NF-κB也許是腫瘤促進(jìn)機(jī)制中最重要的一環(huán)，因?yàn)镹F-κB是抗凋亡基因表達(dá)的主要激活子。研究中發(fā)現(xiàn)NF-κB的表達(dá)陽(yáng)性率在肝癌組織明顯高于癌周組織，且陽(yáng)性強(qiáng)度亦明顯高于癌周組織，對(duì)照臨床資料分析發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中NF-κB的陽(yáng)性率及強(qiáng)度與分化程度、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，是否與病例選擇有關(guān)，還有待探討。NF-κB表達(dá)的定位分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中有點(diǎn)灶狀的胞核陽(yáng)性，而在癌周組織未發(fā)現(xiàn)有胞核陽(yáng)性，提示NF-κB在激活后進(jìn)入胞核發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性，從而參與肝癌的發(fā)生發(fā)展[6]。

HCC是由病毒、化學(xué)致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相關(guān)基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新復(fù)活等諸多因素引起肝細(xì)胞生長(zhǎng)失控而致癌變，經(jīng)啟動(dòng)、促進(jìn)、演變多階段的發(fā)病過(guò)程，并與基因調(diào)控和表達(dá)等密切相關(guān)[7]。肝炎病毒(HBV和HCV)的慢性持續(xù)感染是肝癌發(fā)生的主要背景[8]。文獻(xiàn)報(bào)道HBV病毒感染誘導(dǎo)和激活NF-κB表達(dá)，但在本組資料中僅分析NF-κB表達(dá)與HBsAg之間的關(guān)系，結(jié)果顯示HBsAg陽(yáng)性的病例癌組織與癌周組織NF-κB強(qiáng)度均有高于HBsAg陰性病例的趨勢(shì)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上未見(jiàn)有明顯差異。在肝癌組織中NF-κB表達(dá)與HBV復(fù)制的關(guān)系待進(jìn)一步研究。

多基因、多階段癌基因或抑癌基因變異，構(gòu)成肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子基礎(chǔ)[9]。NF-κB表達(dá)，受多種信號(hào)途徑調(diào)控，同時(shí)也調(diào)控多種信號(hào)途徑，作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的一個(gè)樞紐參與多種生理過(guò)程的調(diào)控。肝癌發(fā)生過(guò)程中NF-κB過(guò)度表達(dá)，參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。NF-κB通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)等作用抑制細(xì)胞凋亡，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其在調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展及凋亡的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中處于中心環(huán)節(jié)，在肝細(xì)胞炎癥與癌變間起橋梁的關(guān)鍵作用，因此有望成為臨床上肝癌基因治療的理想靶點(diǎn)。

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音標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第4篇

【摘要】

目的探討川芎嗪對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC，以 10-7mol/L AngⅡ刺激作為AngⅡ組 ，AngⅡ刺激前分別應(yīng)用不同濃度川芎嗪預(yù)處理做為高、中、低劑量組，以正常的VSMC為對(duì)照組，測(cè)定VSMC增殖活度，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)培養(yǎng)24h時(shí)VSMC PDGF-B的表達(dá)。結(jié)果AngⅡ組VSMC增殖活度與 PDGF-B表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P

【關(guān)鍵詞】 川芎嗪 血管緊張素Ⅱ 血管平滑肌細(xì)胞 血小板源生長(zhǎng)因子

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）后再狹窄一直是冠心病治療領(lǐng)域的一大難題，血管平滑肌細(xì)胞(vascular　smooth　muscle　cell，VSMC)異常增殖是PTCA術(shù)后再狹窄的一個(gè)重要病理改變［1］。有文獻(xiàn)報(bào)道，血管緊張素II(angiotensin II，AngⅡ)、血小板源生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor， PDGF）在VSMC增殖中作用明顯［2，3］。本研究以體外原代培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為模型，觀(guān)察AngⅡ與PDGF-B表達(dá)的關(guān)系以及川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)對(duì)其影響，探討TMP對(duì)VSMC增殖的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

體重120～150 g的健康雄性SD大鼠 （河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。鹽酸川芎嗪注射液（無(wú)錫市第七制藥公司），DMEM培養(yǎng)基干粉（Sigma）、細(xì)胞培養(yǎng)器材、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自華美生物工程公司；AngⅡ（Merck公司），PDGF-B抗體（博士德），sm-actin免疫試劑盒（Santa Cruz），其它試劑為分析純產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

將大鼠斷頭處死，無(wú)菌條件下迅速打開(kāi)胸腔，取出胸主動(dòng)脈，按組織貼塊法在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)以含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。光鏡下以及倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞呈梭形，生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)呈現(xiàn)特有的峰與谷特點(diǎn)，同時(shí)經(jīng)sm-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，細(xì)胞純度達(dá)95%以上。選擇4-6代VSMC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

①對(duì)照組(control)：不加特殊試劑，僅給予無(wú)血清DMEM培養(yǎng)；②AngII組：AngII 10-7mol/L培養(yǎng)；③TMP低劑量組：20 mg/L TMP預(yù)孵育30 min后，加AngⅡ培養(yǎng)；④TMP中劑量組：200 mg/LTMP預(yù)孵育30 min，加AngⅡ培養(yǎng)；⑤TMP高劑量組：2 000 mg/L TMP預(yù)孵育30 min，加AngⅡ培養(yǎng)。

1.4 檢測(cè)細(xì)胞增殖活度

采用MTT法。按上述方法接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h后終止，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24 h，分組（同前）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT溶液20 μl，吸去培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜振蕩；選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值（A值）。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)

PDGF-B的表達(dá)0.25%胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/L，接種于內(nèi)置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)24 h，分組（同前）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)細(xì)胞爬片用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.3%過(guò)氧化氫中孵育10 min；滴加復(fù)合消化液后滴加封閉血清，37℃，30 min，滴加PDGF-B一抗（1∶200），4℃過(guò)夜，滴加二抗工作液，37℃孵育30 min；滴加SABC，37℃孵育30 min。DAB 顯色，中性樹(shù)膠封片。

1.6 計(jì)算機(jī)圖像分析

每一張涂片400倍顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算其平均灰度值，數(shù)值越大表示抗原表達(dá)量越小。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用±s表示

計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件分析SPSS11.0，采用One-way ANOVA分析，兩兩比較LSD檢驗(yàn)。

轉(zhuǎn)貼于

2 結(jié) 果

2.1 TMP對(duì)AngⅡ刺激的VSMC增殖活度的影響

AngⅡ組細(xì)胞增殖活度明顯高于對(duì)照組（P

2.2 TMP對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC PDGF-B表達(dá)的影響

顯微鏡下觀(guān)察，PDGF-B陽(yáng)性表達(dá)為VSMC胞漿與胞核呈棕黃色反應(yīng)，主要為胞漿表達(dá)。與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激24h后，VSMC表達(dá)PDGF-B顯著增強(qiáng)(P

3 討論

TMP是從中藥川芎中分離提純的有效成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪。廣泛用于高血壓病、冠心病等的防治。研究表明TMP具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗凝、抗血小板聚集、抗心肌缺血/再灌注損傷降低血壓、降低肺動(dòng)脈高壓以及抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等多種心血管藥理作用［4］。TMP可能通過(guò)抑制VSMC增殖發(fā)揮抗血管再狹窄作用，但其具體分子機(jī)制尚不清楚。

我們先前的研究表明［5］，血管損傷后再狹窄時(shí)血漿AngⅡ水平顯著升高，血管壁PDGF-B表達(dá)顯著增強(qiáng)。PDGF是由血小板、平滑肌細(xì)胞等分泌的一種糖蛋白，其家族目前至少有4個(gè)亞基，即PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D。其中由PDGF-A，PDGF-B形成的同源二聚體具有強(qiáng)烈的促進(jìn)有絲分裂及細(xì)胞趨化作用，在體外可刺激心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種類(lèi)型細(xì)胞的肥大或增殖。PDGF與其膜表面受體結(jié)合，激活受體的內(nèi)源性酪氨酸激酶活性，通過(guò)磷酸化胞漿中的信號(hào)分子，最終將信息傳遞到核內(nèi)，導(dǎo)致VSMC增殖［6］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC PDGF-B表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，同時(shí)VSMC增殖活度增強(qiáng)。提示AngⅡ可以通過(guò)上調(diào)PDGF-B表達(dá)、增強(qiáng)PDGF-B介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)一步促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖；不同劑量的TMP作用后，AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC PDGF-B表達(dá)水平顯著下調(diào)，VSMC增殖活度顯著減弱。說(shuō)明TMP能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，該效應(yīng)與抑制PDGF-B表達(dá)有關(guān)；在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，隨著TMP濃度增加，細(xì)胞增殖活度及PDGF-B表達(dá)水平逐漸降低，說(shuō)明TMP的抑制作用具有量效關(guān)系。

綜上所述，川芎嗪對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖有顯著抑制作用，其作用機(jī)制與抑制PDGF介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

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音標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第5篇

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類(lèi)風(fēng)關(guān)巴布劑；大鼠；核轉(zhuǎn)錄因子-κβ；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是慢性全身性自身免疫性疾病，其病理基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)滑膜的過(guò)度增生，誘導(dǎo)異常增生的滑膜組織發(fā)生凋亡可能成為治療RA的有效途徑。滑膜的增生與凋亡之間的平衡受多種因素的制約，細(xì)胞因子是其因素之一。在眾多細(xì)胞因子中，腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β扮演著重要的角色。研究表明，TNF-α抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制受核轉(zhuǎn)錄因子-κβ(Nuclear factor-κβ，NF-κβ)的調(diào)控[1]， Yamasaki等[2]研究認(rèn)為NF-κβ可能是治療RA的目標(biāo)分子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)牛Ⅱ型膠原(BcⅡ)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠不同組合穴位貼敷類(lèi)風(fēng)關(guān)巴布劑，觀(guān)察其對(duì)大鼠滑膜細(xì)胞NF-κβ表達(dá)的影響，并初步探討經(jīng)絡(luò)腧穴在其中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

Wistar大鼠，清潔級(jí)健康雄性，80只，體重(120±15)g，購(gòu)

于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，正常飼養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

雷公藤、白花蛇舌草、乳香、沒(méi)藥；BcⅡ，Chondrex公司(美國(guó))；完全弗氏佐劑，Sigma公司(美國(guó))；IL-1βELISA kit購(gòu)于Biosource公司(美國(guó))；TNF-α ELISA kit購(gòu)于Biosource公司(美國(guó))；NF-κβ購(gòu)于santa cruz Biotechnology，inc(美國(guó))；多聚賴(lài)氨酸玻片100張，EiVision＋PolymerHRP(Ms/Rb) IHC Kit 6 mL。

1.3 儀器

顯微鏡OLYMPUS(日本)，低溫高速離心機(jī)BECKMEN(美國(guó))，酶標(biāo)儀Bio-rad680(美國(guó))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 類(lèi)風(fēng)關(guān)巴布劑的組成及制作方法

雷公藤、白花蛇舌草、乳香、沒(méi)藥等，共12味，按固定劑量配伍(其中雷公藤占總藥量的28%)，曬干，研粉，過(guò)20目篩，用80%乙醇滲漉提取，然后過(guò)濾取液，經(jīng)低溫低壓(50 ℃，-0.8個(gè)大氣壓)蒸餾去乙醇后得浸膏。將浸膏按一定比例加入事先配制的巴布劑基質(zhì)(主要成分明膠、甘油、聚丙烯酸鈉等)中，并加入0.5%的促滲劑(氮酮)、一定比例的乳化劑及防腐劑等，充分溶合，均勻涂布于無(wú)紡布上，覆蓋聚乙烯薄膜，切成3 cm×3 cm的方塊(重量1 g)，密封包裝，陰涼處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 造模和分組

隨機(jī)從100只大鼠中選出10只為正常對(duì)照，其余90只用于造模，參照文獻(xiàn)[3]方法配制成Ⅱ型膠原乳劑。具體方法為：在無(wú)菌條件下，用0.1 mol/L冰醋酸充分溶解BcⅡ，濃度為4 mg/mL，置4 ℃冰箱過(guò)夜后，與弗氏完全佐劑等體積混合、振蕩乳化，制成BcⅡ乳劑(即每0.5 mL含1 mg BcⅡ)。置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。注射方法：于大鼠背部及尾根?點(diǎn)行皮內(nèi)注射，每點(diǎn)0.1 mL，總量0.5 mL(含1 mg BcⅡ型膠原)。15 d后同法分2點(diǎn)皮內(nèi)激發(fā)注射。正常對(duì)照組予以生理鹽水同法注射。初次免疫25 d后參照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[1]對(duì)造模效果進(jìn)行評(píng)估，評(píng)分達(dá)6分以上的大鼠被用于繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組，即類(lèi)風(fēng)關(guān)巴布劑局部穴位貼敷組(局部組)、類(lèi)風(fēng)關(guān)巴布劑遠(yuǎn)道穴位貼敷組(遠(yuǎn)道組)、類(lèi)風(fēng)關(guān)巴布劑系統(tǒng)穴位貼敷組(系統(tǒng)組)和模型對(duì)照組(模型組)各10只。

2.3 給藥

根據(jù)臨床及有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的取穴方案[4]取穴。系統(tǒng)組：大椎、雙側(cè)腎俞、雙側(cè)太溪，共5個(gè)穴點(diǎn)；遠(yuǎn)道組：大椎、雙側(cè)腎俞，共3個(gè)穴點(diǎn)；局部組：雙側(cè)太溪，共2個(gè)穴點(diǎn)。根據(jù)貼敷總面積相同(劑量相等)的原則，系統(tǒng)組每穴貼敷面積為0.15 cm2的圓形巴布劑(半徑0.22 cm)；遠(yuǎn)道組每穴貼敷面積為0.25 cm2(半徑0.28 cm)；局部組每穴貼敷面積為0.375 cm2 (半徑0.35 cm)。在穴位處脫毛后貼敷，每3 d貼敷1次，共5次，每次雷公藤甲素劑量約為3.8 μg[5]。正常組和模型組模仿局部組貼敷不含藥物的巴布劑基質(zhì)。15 d后各組同時(shí)處死取標(biāo)本。

2.4 取材

大鼠稱(chēng)重，用2%戊巴比妥納腹腔麻醉，仰位固定，沿著左側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開(kāi)皮膚直至暴露出膝關(guān)節(jié)位中心約3 cm×3 cm的區(qū)域。沿髕骨上緣約0.3～0.4 cm處向下切割至股骨，再分別沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨，此時(shí)即打開(kāi)了膝關(guān)節(jié)腔，可見(jiàn)由髕骨下極向下延續(xù)有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織。用眼科直鑷輕輕夾住其中央，用眼科剪完整剪下，置10%的中性甲醛中固定，用于檢測(cè)NF-κβ的免疫組織化學(xué)染色。同法取右側(cè)滑膜，滑膜取出之后，用生理鹽水1 mL沖洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)腔液和關(guān)節(jié)滑膜組織，用于IL-1β、TNF-α的檢測(cè)。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)

2.5.1 細(xì)胞因子的檢測(cè)

IL-1β、TNF-α活性測(cè)定采用ELISA法，按照所附說(shuō)明書(shū)測(cè)定關(guān)節(jié)滑膜組織溶漿的活性。先加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，設(shè)置陰性對(duì)照，加入生物素結(jié)合的一抗(IL-1β、TNF-α)，37 ℃溫箱孵育2 h，然后用洗滌液充分洗滌4次，向?yàn)V紙印干。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液25 ℃孵育1 h，再用洗滌液充分洗滌4次，向?yàn)V紙印干。加入顯色液25 ℃孵育30 min后加入終止液。上機(jī)檢測(cè)吸光度值。

2.5.2 滑膜組織核轉(zhuǎn)錄因子-κβ的免疫組化ABC染色

準(zhǔn)備組織切片(石蠟切片脫蠟至水，冰凍切片和細(xì)胞培養(yǎng)片用適當(dāng)方法固定)；抗原修復(fù)(微波加熱法，適用石蠟切片)，將切片置于耐高溫容器中，注入抗原修復(fù)液，使切片位于液面以下。置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92～98 ℃之間并持續(xù)5 min，取出容器，室溫冷卻，30～50 min后降至室溫。用TBS 沖洗切片4～5次，甩干，擦凈，加20 μL 3% H2O2-甲醇溶液(Reagent F)，于室溫濕盒中封閉30 min。取出切片，用TBS沖洗4～5次，甩干，擦凈。用封閉液(Reagent B)20 μL覆蓋，室溫濕盒孵育30 min。用吸水紙將封閉液吸去，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗。37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過(guò)夜。TBS沖洗4～5次，甩干，擦凈。滴加生物素標(biāo)記二抗(Reagent C)20 μL，室溫濕盒孵育1～2 h。TBS沖洗4～5次，甩干，擦凈。滴加酶標(biāo)親和素(Reagent D)20 μL，室溫濕盒孵育30 min。TBS沖洗4～5次，滴加DAB工作液(Reagent E)約30 μL/片，著色后迅速(約1 min內(nèi))沖洗干凈。20 μL蘇木精(Reagent G)復(fù)染。沖洗干凈脫水封片，鏡檢。

2.5.3 核轉(zhuǎn)錄因子-κβ積分[6]

在滑膜組織中NF-κβ表達(dá)陽(yáng)性的滑膜組織細(xì)胞核呈橘黃色或棕黃色，每張切片沿滑膜組織帶計(jì)算400倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞的占有率，計(jì)數(shù)3個(gè)視野，標(biāo)出每個(gè)視野平均陽(yáng)性細(xì)胞占有率，并按陽(yáng)性細(xì)胞占有率分為5級(jí)：“0”為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，“+”為陽(yáng)性細(xì)胞0～25%，“++”為陽(yáng)性細(xì)胞25%～50%，“+++”為陽(yáng)性細(xì)胞50%～75%，“++++”為陽(yáng)性細(xì)胞75%～100%。0級(jí)積分為0，“+”積分為1，以此類(lèi)推。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布總體比較采用多組單因素方差分析，組間比較用q檢驗(yàn)(Newman- Keuls法)，否則用秩和檢驗(yàn)的Kruskal-Wallis法和Nemenyi法，P

3 結(jié)果

(見(jiàn)表1、表2)表1 各組大鼠滑膜細(xì)胞NF-κβ的表達(dá)(略)注：與模型組比較，P

轉(zhuǎn)貼于

4 討論

NF-κβ是1986年由Sen和Baltimore首先報(bào)道[7]，并發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞核提取物中有一種核蛋白能與免疫球蛋白K輕鏈基因增強(qiáng)子κβ序列特異結(jié)合，促進(jìn)了K輕鏈的表達(dá)，被稱(chēng)為NF-κβ。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在RA發(fā)病的過(guò)程中，NF-κβ做為轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與了滑膜組織的過(guò)度增生和炎癥過(guò)程[8]。NF-κβ在胞漿中與其抑制亞單位Ⅰ-κβ結(jié)合而處于未活化狀態(tài)，并可被TNF-α、IL-1β等不同的信號(hào)所激活，其活化則有賴(lài)于胞漿中Ⅰ-κβ的降解。在正?；?，NF-κβ的表達(dá)量很低[9]。在RA的滑膜中，免疫活性NF-κβ蛋白p50和p65大量表達(dá)于襯里層細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中[10]。NF-κβ的活化在RA早期滑膜炎癥和增生的過(guò)程中起中心罪犯作用[11]。

在正常細(xì)胞構(gòu)成性表達(dá)活化的NF-κβ僅見(jiàn)于成熟B細(xì)胞、漿細(xì)胞和某些神經(jīng)元中，而其他大多數(shù)細(xì)胞的NF-κβ需在外界的刺激誘導(dǎo)下發(fā)生激活。許多細(xì)胞外因素可誘導(dǎo)NF-κβ的活化，如炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β等，但最終都通過(guò)IKK使Ⅰ-κβ降解而與NF-κβ解離，暴露NF-κβ的NLS，使NF-κβ經(jīng)核孔進(jìn)入核內(nèi)，與DNA靶序列結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控效應(yīng)；而NF-κβ的活化導(dǎo)致了許多基因的表達(dá)，以直接或間接的方式調(diào)節(jié)機(jī)體的生理和病理反應(yīng)。在此過(guò)程中，TNF-α、IL-1β等前炎細(xì)胞因子在NF-κβ作用下生成增加，它們作為外界刺激因子進(jìn)一步活化NF-κβ信號(hào)通路，產(chǎn)生正反饋放大作用，這是NF-κβ迅速動(dòng)員、反應(yīng)靈敏的重要條件。然而，由于NF-κβ活化導(dǎo)致大量細(xì)胞因子、酶等生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生，它的過(guò)度活化必然導(dǎo)致機(jī)體的病理反應(yīng)和損傷，正常細(xì)胞內(nèi)NF-κβ的活化是在細(xì)胞內(nèi)外通路的正、負(fù)反饋的精細(xì)調(diào)節(jié)下，使NF-κβ的活化保持在適當(dāng)?shù)乃?。正、?fù)兩種反饋調(diào)節(jié)往往同時(shí)進(jìn)行，NF-κβ是否處于活化狀態(tài)則取決于何種調(diào)節(jié)占優(yōu)勢(shì)。

CIA的產(chǎn)生和發(fā)展與RA有著很多的相似性，二者都依賴(lài)于自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活，并能產(chǎn)生類(lèi)似類(lèi)風(fēng)濕因子的抗體。Seetharaman等[12]在CIA大鼠的研究表明，對(duì)于Ⅰ型和Ⅱ型T細(xì)胞依賴(lài)的免疫應(yīng)答而言，抗體誘導(dǎo)NF-κβ的活化主要導(dǎo)致T細(xì)胞依賴(lài)的免疫應(yīng)答，抑制NF-κβ信號(hào)通路，使血清TNF-γ、IgG2a抗Ⅱ型膠原(CⅡ)抗體水平明顯下降而IgG1水平不變，CD8+T細(xì)胞減少，CIA發(fā)病率及嚴(yán)重性明顯減少和減輕。因此，本實(shí)驗(yàn)選用CIA大鼠為模型。

RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，近年來(lái)，大量研究認(rèn)為雷公藤對(duì)CIA大鼠有效，并有采用含雷公藤的復(fù)方中藥穴位貼敷治療CIA大鼠的研究[13]。我們將以雷公藤為主藥的復(fù)方中藥制劑與針灸穴位有機(jī)結(jié)合，研制類(lèi)風(fēng)關(guān)巴布劑，并進(jìn)行了毒理、制劑學(xué)及臨床的研究，在大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎穴位貼敷研究中，證明相同的給藥劑量(貼敷面積)不同的穴位組合作用有差異，以系統(tǒng)組(遠(yuǎn)近配穴)最佳[14]。另?yè)?jù)研究，雷公藤甲素可以下調(diào)CIA大鼠滑膜細(xì)胞TNF-α的表達(dá)，同時(shí)還可以有效抑制NF-κβ的表達(dá)與活性[15]。本實(shí)驗(yàn)中，造模后NF-κβ積分水平明顯升高，治療后各組都有所下降，以系統(tǒng)組最接近正常，同時(shí)治療后各組滑膜浸液的TNF-α、IL-1β水平也有明顯下降。因此，類(lèi)風(fēng)關(guān)巴布劑穴位貼敷能夠有效打破NF-κβ與TNF-α、IL-1β之間的正反饋調(diào)節(jié)的惡性循環(huán)。

在本次實(shí)驗(yàn)中，除了藥物的療效外，合理用穴也是關(guān)鍵要素，一方面，通過(guò)經(jīng)絡(luò)腧穴給藥對(duì)藥效的放大作用來(lái)提高療效，另外，遠(yuǎn)近配穴可能通過(guò)標(biāo)本兼治，多靶點(diǎn)起效，使其整體療效優(yōu)于單純遠(yuǎn)道取穴或局部取穴。

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