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細(xì)胞生物學(xué)的研究范文第1篇

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞生物學(xué)；研究性教學(xué)；探索與實(shí)踐

[中圖分類號(hào)] G424.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1005-4634（2013）06-0065-03

0 引言

21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)的重要基礎(chǔ)學(xué)科，具有較強(qiáng)的理論性和實(shí)驗(yàn)性[1]，同時(shí)也是近年來(lái)發(fā)展迅速的前沿學(xué)科。綜觀2012、2013年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)不難看出，這些對(duì)生命科學(xué)有重大推動(dòng)作用的杰出成就都是細(xì)胞生物學(xué)研究的領(lǐng)域。因此，深入探究細(xì)胞這個(gè)生命活動(dòng)基本單位對(duì)于理解生命活動(dòng)的基本規(guī)律、探究生命科學(xué)領(lǐng)域的基本問(wèn)題、解決醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大問(wèn)題有重要的意義。但在傳統(tǒng)的教學(xué)中，往往采用“灌輸”式教學(xué)，使學(xué)生處于非常被動(dòng)的地位，這種接受型的教學(xué)方式忽視了學(xué)生自主學(xué)習(xí)、自主探究能力的培養(yǎng)，抑制了學(xué)生的研究興趣與創(chuàng)造性，與21世紀(jì)日益加劇的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)對(duì)創(chuàng)新人才的強(qiáng)烈需求形成尖銳矛盾。因此，發(fā)展新的教學(xué)模式迫在眉睫。研究性教學(xué)模式要求教學(xué)過(guò)程中要充分發(fā)揮學(xué)生的主體地位和教師的主導(dǎo)作用，學(xué)生在教師指導(dǎo)下，通過(guò)以“自主、合作、探究”為特征的學(xué)習(xí)方式較好達(dá)到課程教學(xué)目標(biāo)。本文從研究性教學(xué)模式的角度對(duì)細(xì)胞生物學(xué)理論教學(xué)的教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)教學(xué)的優(yōu)化改革提出了幾點(diǎn)思考。

1 在理論教學(xué)中培養(yǎng)學(xué)生的研究性思維

1.1 調(diào)整和優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容

《細(xì)胞生物學(xué)》是高等院校生物學(xué)各專業(yè)開(kāi)設(shè)的一門必修課，其內(nèi)容迎合了不同層次學(xué)習(xí)者和研究者的需求。要在理論教學(xué)過(guò)程中培養(yǎng)學(xué)生的研究性思維，則不能拘泥于教材的內(nèi)容及其編排，需要調(diào)整和優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容，為學(xué)生形成研究性思維習(xí)慣做好鋪墊?；诖?，可以根據(jù)理論知識(shí)的難易程度、學(xué)生的知識(shí)儲(chǔ)備和接受新知的能力、《細(xì)胞生物學(xué)》課程教學(xué)大綱、學(xué)科發(fā)展現(xiàn)狀等對(duì)課程內(nèi)容做適當(dāng)?shù)膭h減、增添和整合，調(diào)整和優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容。

1）刪減。刪減學(xué)生已經(jīng)耳熟能詳?shù)膬?nèi)容。學(xué)生在長(zhǎng)期的知識(shí)儲(chǔ)備和經(jīng)驗(yàn)積累過(guò)程中已經(jīng)習(xí)得的基礎(chǔ)知識(shí)，應(yīng)在課堂上避免贅述。例如，關(guān)于“細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位” 這一概念，其涵義學(xué)生從中學(xué)就已經(jīng)有所了解，可引導(dǎo)學(xué)生從生命活動(dòng)的不同方面舉例來(lái)證明這一結(jié)論，并與最近的研究進(jìn)展相聯(lián)系，培養(yǎng)學(xué)生歸納總結(jié)知識(shí)的能力并激發(fā)學(xué)習(xí)興趣。

刪減某些學(xué)科交叉內(nèi)容。由于細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科，與生物化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)等學(xué)科有著深刻的相互滲透與結(jié)合，很多理論知識(shí)在不同學(xué)科中重復(fù)出現(xiàn)，因此應(yīng)做適當(dāng)?shù)膭h減，化重復(fù)理論為知識(shí)遷移。例如，學(xué)生已經(jīng)在生物化學(xué)中對(duì)線粒體的氧化磷酸化有了系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，在本課程可以著重從氧化磷酸化的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其細(xì)胞生物學(xué)定位來(lái)理解其作用機(jī)制，從而在細(xì)胞這一層次上對(duì)這個(gè)過(guò)程有全面理解并形成結(jié)構(gòu)決定功能的生物學(xué)思想。

刪減識(shí)記類課程內(nèi)容。研究性學(xué)習(xí)的目的不僅在于知道是什么，而且在于明白為什么和怎么做，以提高解決問(wèn)題的能力。把識(shí)記類理論知識(shí)放至課前或課后，在課堂上注重方法習(xí)得不失為好的舉措。例如，細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑和細(xì)胞對(duì)信號(hào)的整合與控制應(yīng)是課堂上探討的重點(diǎn)，而細(xì)胞通訊、信號(hào)分子、受體等基本概念應(yīng)由學(xué)生自主習(xí)得。除此之外，關(guān)于細(xì)胞生物學(xué)研究方法的內(nèi)容可以移接至實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。

2）增添。注入研究方法，滲透研究性思維。在《細(xì)胞生物學(xué)》中，對(duì)生命現(xiàn)象探究的內(nèi)容雖有不少涉及，但很少展示具體的研究思路，因此要求教師要擁有豐富的教學(xué)資源和素材，適時(shí)在課堂教學(xué)中滲透科學(xué)研究方法。

引入科研成果，把握學(xué)科前沿。教師需要時(shí)刻關(guān)注國(guó)內(nèi)外的科學(xué)研究動(dòng)態(tài)和成果，擷取精華介紹給學(xué)生[2]，拓寬學(xué)生視野；教師應(yīng)提煉學(xué)術(shù)會(huì)議上各專家的新理念、新思路，以活躍學(xué)生的思維，便于研究性學(xué)習(xí)，推陳出新；學(xué)生也要利用書(shū)籍、期刊、網(wǎng)絡(luò)、電視等多種途徑豐富見(jiàn)聞，在合作和交流中兼收并蓄，思維碰撞。

適時(shí)插入科學(xué)家的故事。必要時(shí)，以科學(xué)家艱辛的探索事跡進(jìn)行科學(xué)態(tài)度和科學(xué)精神教育，適時(shí)引入科學(xué)家的逸聞趣事，以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

3）整合。細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，“一切生命的關(guān)鍵問(wèn)題都要到細(xì)胞中去尋找”。為了系統(tǒng)而深刻地理解生命的本質(zhì)，必須避免片段化教學(xué)，應(yīng)對(duì)教學(xué)內(nèi)容適當(dāng)整合，以符合學(xué)生的認(rèn)知規(guī)律。

知識(shí)點(diǎn)間的整合。例如，錨定連接需要細(xì)胞骨架系統(tǒng)的參與，因此可把錨定連接的相關(guān)內(nèi)容安排在細(xì)胞骨架后，以便新舊知識(shí)的聯(lián)接。

調(diào)整課程內(nèi)容的順序。細(xì)胞生物學(xué)的研究重點(diǎn)已不再限于細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能方面，而是明顯轉(zhuǎn)向細(xì)胞重大生命活動(dòng)及其分子機(jī)制的探秘，因此建議將細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能等章節(jié)內(nèi)容整合、將細(xì)胞重大生命活動(dòng)及其分子機(jī)制等章節(jié)內(nèi)容整合，掌握前者是揭示后者的基礎(chǔ)。

1.2 改變教學(xué)方法，改進(jìn)評(píng)價(jià)體系

在研究性教學(xué)中強(qiáng)調(diào)，學(xué)生是教學(xué)過(guò)程的主體，學(xué)生要在研究中學(xué)習(xí)和成長(zhǎng)，發(fā)展學(xué)習(xí)主動(dòng)性和養(yǎng)成獨(dú)立思考的習(xí)慣；教師則在整個(gè)教學(xué)過(guò)程中起組織者、指導(dǎo)者、幫助者和促進(jìn)者的作用[3]。在教學(xué)方法上，建議采用問(wèn)題教學(xué)方式，在確定了研究課題的前提下，通過(guò)創(chuàng)設(shè)問(wèn)題情境，引導(dǎo)學(xué)生質(zhì)疑，并恰當(dāng)引入科研成果。

1）建立激勵(lì)機(jī)制，確定研究課題。采用研究性教學(xué)模式會(huì)增加學(xué)生的課前準(zhǔn)備負(fù)擔(dān)，對(duì)于每個(gè)學(xué)期要上近10門課程的學(xué)生來(lái)說(shuō)，如何激勵(lì)學(xué)生主動(dòng)學(xué)習(xí)是非常重要的。學(xué)生的積極參與僅僅靠老師語(yǔ)言上的激勵(lì)是不夠的，必須建立相應(yīng)的激勵(lì)機(jī)制，比如可在教學(xué)質(zhì)量的評(píng)價(jià)體系中加入“課堂發(fā)言”這一項(xiàng)，并在最終成績(jī)考核中占一定的比例，如可設(shè)定課堂發(fā)言∶實(shí)驗(yàn)成績(jī)∶理論成績(jī)=3∶3∶4，課堂發(fā)言由教師當(dāng)場(chǎng)打分，整個(gè)學(xué)期成績(jī)累計(jì)，取其平均值。

研究性教學(xué)模式并不在于形式上以學(xué)生為主，而在于學(xué)生在實(shí)質(zhì)上的主體地位。因此，在教學(xué)方式上，既可以采用老師提問(wèn)、學(xué)生討論的方式，也可以采用教師講授、學(xué)生隨時(shí)質(zhì)疑的方式。在第一種方式中，老師需要精心組織并向?qū)W生提供研究課題，鼓勵(lì)學(xué)生主動(dòng)參與，由于學(xué)生準(zhǔn)備的是否充分直接決定了其在課堂上的參與度和思維的拓展度，因此在確定研究課題后，要留給學(xué)生一定的時(shí)間準(zhǔn)備相關(guān)材料。同時(shí)，為避免要探究的問(wèn)題因龐雜而止于膚淺，可將研究課題分成若干子課題。在實(shí)踐中，將學(xué)生分成小組（每組3～5人），問(wèn)題到組，每小組負(fù)責(zé)闡述1～2個(gè)子課題。這樣既保證了學(xué)生探究問(wèn)題有一定的深度，又有效地激發(fā)了他們的參與熱情。

在確定課題及課堂討論中要注意掌握研究課題的廣度與深度。為達(dá)到既使學(xué)生掌握理論知識(shí)又能訓(xùn)練其思維的目的，在確定研究課題時(shí)，應(yīng)注意課題的廣度，不能任意發(fā)散、偏離重點(diǎn)；同時(shí)，也要考慮到課題的深度，難度適中，有效激發(fā)學(xué)生的興趣。例如，在《細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)》課題中，要求學(xué)生理解并掌握細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑、細(xì)胞對(duì)信號(hào)的整合和控制，教學(xué)活動(dòng)應(yīng)圍繞這兩方面展開(kāi)，在掌握基本的幾條途徑的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行歸納，繪制網(wǎng)絡(luò)圖，找出其交叉點(diǎn)，從而理解其整合性。同時(shí)可通過(guò)查閱文獻(xiàn)進(jìn)行知識(shí)的擴(kuò)展，了解近年來(lái)這些基本的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的新進(jìn)展。

2）創(chuàng)設(shè)問(wèn)題情境，引導(dǎo)學(xué)生質(zhì)疑。在研究性教學(xué)中，師生應(yīng)是平等的探索者的關(guān)系，教學(xué)過(guò)程就是解決問(wèn)題的過(guò)程，因此應(yīng)以問(wèn)題研究[4]為主線，教師要善于提出啟發(fā)性、針對(duì)性的問(wèn)題[2]，問(wèn)題的設(shè)置要有層次感，遵循學(xué)生的認(rèn)識(shí)規(guī)律。開(kāi)場(chǎng)問(wèn)題要設(shè)計(jì)巧妙，順利促使學(xué)生進(jìn)入學(xué)習(xí)情境；教學(xué)過(guò)程中，教師要做好學(xué)生活動(dòng)的組織者、幫助者和促進(jìn)者，指導(dǎo)和總結(jié)提升到位；對(duì)于抽象復(fù)雜的機(jī)制需要結(jié)合多媒體等手段，化繁為簡(jiǎn)；探討完理論知識(shí)后，要引導(dǎo)學(xué)生思考和分析與生產(chǎn)生活緊密相關(guān)的問(wèn)題，學(xué)以致用。學(xué)生可以采用獨(dú)立思考、小組討論等多種形式的學(xué)習(xí)方法多角度調(diào)動(dòng)思維，也可以在解決問(wèn)題的同時(shí)提出有研究?jī)r(jià)值的新問(wèn)題，進(jìn)行課堂外的延伸，拓展思維的深度。例如，在《細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)》課題中，教師可借此課題引導(dǎo)學(xué)生掌握相關(guān)前沿。如教師可提出：生物對(duì)光的響應(yīng)是通過(guò)其受體來(lái)完成的，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種光的受體，分別是什么？UV-B的受體是什么？受體如何傳遞這一信號(hào)？細(xì)胞對(duì)這一信號(hào)產(chǎn)生什么樣的響應(yīng)？當(dāng)諸如小麥等植物接受UV-B后，會(huì)產(chǎn)生哪些響應(yīng)？這樣學(xué)生就會(huì)通過(guò)閱讀文獻(xiàn)掌握這一領(lǐng)域的最新發(fā)現(xiàn)，了解UVR8這一剛剛發(fā)現(xiàn)的紫外線的受體，通過(guò)了解其機(jī)理，聯(lián)系實(shí)際，就可以自然而然地提出：可以通過(guò)人為增強(qiáng)紫外線輻射來(lái)刺激植物產(chǎn)生更多的類黃酮，從而提高某些植物尤其是藥用植物的保健作用。這樣，理論就和實(shí)踐很好地結(jié)合到了一起。

3）恰當(dāng)?shù)匾肟蒲谐晒?。?xì)胞生物學(xué)是一門迅猛發(fā)展的學(xué)科，尤其是分子生物學(xué)的概念與方法的引入，將其迅速推向分子細(xì)胞生物學(xué)水平。細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀和成果如何，教師可以在課堂上適時(shí)介紹給學(xué)生，尤其是重點(diǎn)闡述研究方法、實(shí)施步驟等內(nèi)容，對(duì)學(xué)生進(jìn)行科研方法與思路的指導(dǎo)。例如，在《細(xì)胞分化與基因表達(dá)調(diào)控》這一章節(jié)中，可以引入2012年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者日本京都大學(xué)教授山中伸彌和英國(guó)的約翰戈登將細(xì)胞核重新編程的成果（即將成年體細(xì)胞重新誘導(dǎo)回早期干細(xì)胞狀態(tài)，以用于形成各種類型的細(xì)胞，這一技術(shù)的實(shí)現(xiàn)免除了使用人體胚胎提取干細(xì)胞的倫理道德制約，將能避免異體移植產(chǎn)生的排異反應(yīng)，為某些嚴(yán)重疾病的治療提供了契機(jī)）。領(lǐng)域的杰出成果能夠?qū)ΜF(xiàn)有課本知識(shí)進(jìn)行補(bǔ)充，學(xué)生也可以通過(guò)專題文獻(xiàn)查閱報(bào)告的形式交流科學(xué)界的新理念、新發(fā)現(xiàn)。

2 在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中鍛煉學(xué)生的科研技能

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生技能的重要途徑，也是學(xué)生研究性學(xué)習(xí)的具體體現(xiàn)。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)技能的學(xué)習(xí)和實(shí)踐操作，學(xué)生將對(duì)所學(xué)的基礎(chǔ)理論知識(shí)有更深刻更直觀的理解，同時(shí)還可了解有關(guān)細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞工程領(lǐng)域常用的研究手段和方法，為進(jìn)一步深造和獨(dú)立開(kāi)展科研工作奠定基礎(chǔ)。

2.1 合理安排實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)程

實(shí)驗(yàn)課的進(jìn)程應(yīng)該與理論課的進(jìn)程相輔相成，教學(xué)建立在科研基礎(chǔ)上，科研促進(jìn)教學(xué)的提高。

2.2 改建實(shí)驗(yàn)課

1）通過(guò)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生基本的實(shí)驗(yàn)技能。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，學(xué)生可以掌握相差顯微鏡、偏光顯微鏡、暗視野顯微鏡、熒光顯微鏡等各類顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理及其操作；通過(guò)對(duì)細(xì)胞組分的分離及觀察，學(xué)生可以學(xué)會(huì)分離、純化、活體染色等技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)前，學(xué)生應(yīng)該通過(guò)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、網(wǎng)絡(luò)等了解相關(guān)儀器設(shè)備，并了解其原理及操作，指導(dǎo)教師對(duì)所出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行指導(dǎo)，規(guī)范操作。

2）通過(guò)設(shè)計(jì)性和綜合性實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生分析和解決問(wèn)題的能力。設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)、綜合性實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生以本課程的相關(guān)理論知識(shí)為基礎(chǔ)，在具備一定的實(shí)驗(yàn)操作技能的前提下，通過(guò)查閱資料等富有創(chuàng)造力地獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方案，這對(duì)學(xué)生的素質(zhì)要求較高，因此也是培養(yǎng)學(xué)生分析和解決問(wèn)題能力的良好手段。設(shè)計(jì)性和綜合性實(shí)驗(yàn)的題目可以結(jié)合教師的科研項(xiàng)目擬定，從而不僅將教學(xué)與科研融為一體，而且可以集結(jié)眾多人的智慧，推進(jìn)教師的科研進(jìn)程。

2.3 撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和科研論文

實(shí)驗(yàn)報(bào)告具有情報(bào)交流、保留資料的作用，學(xué)生在撰寫(xiě)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)的報(bào)告時(shí)要如實(shí)地把實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄下來(lái)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析討論時(shí)要加入自己的理解，拓展科研思維，也可以寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)中遇到的問(wèn)題、解決的方法、誤差分析，并提出改進(jìn)意見(jiàn)。

對(duì)于設(shè)計(jì)性和綜合性的實(shí)驗(yàn)，撰寫(xiě)科研論文是學(xué)生展示科研能力、提高科研水平的重要手段，是需具備的基本功之一。

3 教學(xué)改革效果

目前所使用的理論課教材為翟中和院士等主編的《細(xì)胞生物學(xué)》（第三版），本著研究性教學(xué)的理念，首先對(duì)部分章節(jié)如“細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換——線粒體和葉綠體”嘗試采用了研究性教學(xué)模式，學(xué)生利用課外時(shí)間積極查閱資料，認(rèn)真思考，充分準(zhǔn)備；課堂上以小組為單位首先提出自己的問(wèn)題，然后講解，各小組討論、提問(wèn)，最后總結(jié)。通過(guò)這樣的方式，不僅學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情高漲，對(duì)知識(shí)的理解更為透徹，更重要的是，學(xué)生能發(fā)現(xiàn)問(wèn)題并知道如何解決問(wèn)題。接下來(lái)，又把一些問(wèn)題留給學(xué)生，如在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，G蛋白耦聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)通路廣泛參與生命活動(dòng)的諸多方面，而且該領(lǐng)域是一個(gè)正在迅速發(fā)展的領(lǐng)域，不斷有新的發(fā)現(xiàn)。所以鼓勵(lì)學(xué)生充分利用高校的期刊數(shù)據(jù)庫(kù)獲取相關(guān)研究進(jìn)展，課堂上小組交流討論，通過(guò)這樣的方式學(xué)生獲取了大量的信息，對(duì)該領(lǐng)域的前沿動(dòng)態(tài)也有了一定的了解，極大地激發(fā)了學(xué)生的科研熱情。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)方面，將細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了課堂外的延伸，與大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，鼓勵(lì)學(xué)生利用細(xì)胞生物學(xué)的知識(shí)去解決或探究某一問(wèn)題，目前已有部分成果被國(guó)內(nèi)重要的核心期刊所接受。研究性教學(xué)的采用，使細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)質(zhì)量有了顯著提高。學(xué)生不僅在課前養(yǎng)成了獨(dú)立思考的習(xí)慣，提高了自主學(xué)習(xí)能力，而且能在課堂上廣泛參與討論，交流思想，合作學(xué)習(xí)；學(xué)生對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能掌握得較為扎實(shí)，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的科學(xué)前沿有較敏銳的把握，利用細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)、基本技能開(kāi)展相關(guān)領(lǐng)域研究的能力得到了提高?？傊?，研究性教學(xué)模式從根本上發(fā)展了學(xué)生學(xué)習(xí)的主體性，為培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)、發(fā)展學(xué)生的科研思維能力提供了條件。教師應(yīng)積極開(kāi)展研究性教學(xué)的嘗試與探討，培養(yǎng)創(chuàng)新型人才。

參考文獻(xiàn)

[1]翟中和，王喜忠，丁明孝.細(xì)胞生物學(xué)（第4 版）[M].北京：高等教育出版社，2011.

[2]盧曉梅，楊艷燕，居超明.生物學(xué)研究性教學(xué)的探索與實(shí)踐 [J]. 生物學(xué)雜志，2005，（3）：47-49.

細(xì)胞生物學(xué)的研究范文第2篇

[關(guān)鍵詞] CIK細(xì)胞;擴(kuò)增;殺傷活性

[中圖分類號(hào)] R392.12 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)]1673-7210（2007）12（c）-019-03

The study of the expansion in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells

WANG Jia-lie, MA Guo-qiang, BAO Li-qing, LIU Yan-ru

(Study Center of Respiratory Disease, Inner Mongolia Hospital, Huhhot010017,China)

[Abstract] Objective: To observe the proliferation ability in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells. Methods: PBMCs were isolated with successive non-adhere method fromvenous blood ,then were induced to be cytokine-induced killer cells by ficoll density gradient centrifugation in the presence of IFN-γ，IL-1β，IL-2 and anti-CD3 antibody. LAK (lymphokine activated killer) cells were prepared as control. The proliferation ability of CIK cells was measured by calculation , the phenotype of CIK cells was analyzed by flow cytometry（FCM）and the killing tumor cell activity of CIK cells was tested with MTT method. Results: After 16 days of induction the proliferation rate of CIK cells reached a high peak, possessing strong proliferate ability with over 100 times expansion after 21 days culture; In comparison with LAK, CIK cells had no difference in early stage, but onday 18,21 the multiplicationability of CIK cells was higher than that of LAK cells markedly (P

[Key words] Cytokine-induced killer cells; Multiplication ability; Killing ability

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer，CIK)是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)在體外經(jīng)過(guò)多種細(xì)胞因子作用后培養(yǎng)獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。它同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子[1，2]，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點(diǎn)，被認(rèn)為是增殖速度最快，殺瘤活性最強(qiáng)，殺瘤譜最廣的效應(yīng)細(xì)胞。過(guò)繼性免疫治療是治療惡性腫瘤的一個(gè)重要輔助治療方法，用于過(guò)繼性免疫治療的免疫活性細(xì)胞必須具有較強(qiáng)的擴(kuò)增力和殺傷性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究，以尋求用于過(guò)繼免疫治療的高效免疫活性細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人外周血樣品取自中心血站12例健康成人自愿者的靜脈血50 ml。男6名，女6名，年齡20～50歲。人肺腺癌細(xì)胞株A-549購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展公司。

1.2主要試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；特級(jí)無(wú)支原體無(wú)熱源胎牛血清(美國(guó)TBD公司)；人淋巴細(xì)胞分離液(密度：1.077 g/cm3 ，TBD生物技術(shù)發(fā)展中心，天津)；二巰基乙醇(美國(guó)TBD公司)；臺(tái)盼藍(lán)（美國(guó)Sigma公司）；二甲亞砜（美國(guó)Sigma公司）；青霉素，鏈霉素（華北制藥有限公司）；胰蛋白酶（南京凱基生物科技發(fā)展公司）；乙醇、谷氨酰胺、PBS、EDTA等購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；MTT試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展公司）；重組人白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(PEPROTECH公司)、CD3mAb（美國(guó)Stem Cell Technologies公司）；CD3-FITC（異硫氰酸熒光素）、CD4-PE（藻紅阮熒光素）、CD8-PE、CD3-FITC、CD56-PE和鼠抗人IgG熒光抗體（美國(guó)eBioscienc公司）；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；550酶標(biāo)儀（美國(guó)Biorad公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PBMC的分離(密度梯度離心法)及LAK、CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)將人外周抗凝血用淋巴細(xì)胞分離，吸取白膜層細(xì)胞即PBMC，PBS洗滌3遍，加入含10%無(wú)熱源胎牛血清RPMI1640（1 mmol/L丙酮酸鈉、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巰基乙醇、0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素培養(yǎng)基），調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，1.0×107個(gè)/（10 ml?瓶)，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2 h，可見(jiàn)分為黏附于瓶壁的細(xì)胞和非黏附細(xì)胞。取非黏附細(xì)胞分成2組。LAK組:加入500 U/ml IL-2，每3天換液1次并補(bǔ)加500 U/ml IL-2。CIK組:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d換液1次，并補(bǔ)加IL-2及CD3mAb。

1.3.2LAK、CIK細(xì)胞表型的檢測(cè)在培養(yǎng)1，4，7，10，13，16，19，22 d取培養(yǎng)的細(xì)胞，用PBS洗滌兩遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×106個(gè)/ml，取100 μl懸液加入流式專用試管中，加入FITC、PE標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，對(duì)照為IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗滌3遍，洗去多余的抗體。并用同型無(wú)關(guān)陰性抗體做對(duì)照，在流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）上檢測(cè)分析，至少分析1.0×105個(gè)細(xì)胞。

1.3.3 LAK、CIK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞A-549作為靶細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成1.0×105個(gè)/（100 μl?孔），接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，然后取出培養(yǎng)兩組效應(yīng)細(xì)胞，把效應(yīng)細(xì)胞加入靶細(xì)胞孔中混合，另設(shè)單獨(dú)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)測(cè)儀于570 nm處測(cè)OD值，按下面公式計(jì)算各組LAK的殺傷活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)均數(shù)間使用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞的增殖情況

實(shí)驗(yàn)表明PBMC在細(xì)胞因子作用下均能增殖，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞飽滿透亮、聚集成團(tuán)，呈集落樣生長(zhǎng)。與LAK比較，在前期無(wú)明顯差異，至19、22 d時(shí)擴(kuò)增能力顯著高于LAK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)(P

表1不同培養(yǎng)天數(shù)LAK、CIK細(xì)胞的增殖情況(x±s，倍)

2.2 CIK細(xì)胞的表型分析

用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型，結(jié)果顯示CIK細(xì)胞培養(yǎng)后，其主要效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+ 細(xì)胞較培養(yǎng)前顯著增加(P

與培養(yǎng)前比較，*P

2.3 CIK細(xì)胞的殺瘤活性

CIK細(xì)胞在培養(yǎng)至第13天即有較高的殺瘤活性，為61.17%，顯著高于LAK細(xì)胞的41.02%(P

與單純的LAK對(duì)照組比較，*P

3 討論

近年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，隨著細(xì)胞免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞免疫治療成為除化療、放療之外的又一重要輔助治療手段，副作用輕微，安全性較好[3]。過(guò)繼免疫治療(ALT)是惡性腫瘤生物治療的一個(gè)重要手段，是通過(guò)直接向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫活性細(xì)胞，在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用，以此來(lái)達(dá)到治療腫瘤的目的。淋巴因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（lymphokine activated killer，LAK）是由IL-2激活的殺傷細(xì)胞，具有廣譜殺傷腫瘤的細(xì)胞活性，其較早用于臨床腫瘤免疫治療并取得了一定療效。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer，CIK)是一種非MHC限制性的高效溶解腫瘤的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞表面既有T細(xì)胞表面標(biāo)志CD3，也有NK細(xì)胞表面標(biāo)志CD56[4，5]，因而兼有T淋巴細(xì)胞抗瘤活性和NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤的特點(diǎn)。CIK 細(xì)胞是一類非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)和非T細(xì)胞受體(TCR)限制性的免疫活性細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程中，一些非活性細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的共同刺激下，激活為有細(xì)胞毒作用的CIK 細(xì)胞。這些活性細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制很可能是通過(guò)黏附分子LFA-1/I、CAM-1相互結(jié)合后，能夠分泌大量的BLT 酯酶的細(xì)胞質(zhì)顆粒，這些顆粒能夠直接穿透封閉的靶細(xì)胞膜進(jìn)行胞吐，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的裂解[6]；同時(shí)，CIK細(xì)胞自身還能分泌IL-2、IL-6、TNF-α和GM-CSF等一些細(xì)胞因子，提高細(xì)胞毒作用。是目前最新、殺傷腫瘤效果最佳的生物免疫治療方法。Lanier于1986年首次發(fā)現(xiàn)這種異質(zhì)細(xì)胞群(主要是CD3+CD56+細(xì)胞)，其在外周血淋巴細(xì)胞中的比例為1%～5%[7]。經(jīng)過(guò)多年的實(shí)踐，科學(xué)家們找到了體外大量擴(kuò)增CIK細(xì)胞的方法，即應(yīng)用細(xì)胞因子IL-1β，IL-2，IFN- γ和CD3單抗共同培養(yǎng)產(chǎn)生CIK。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中采取此方法，在分離外周血單個(gè)核細(xì)胞中先加IFN-γ，24 h后加入抗CD3單抗、IL-1β與IL-2，培養(yǎng)22 d，每3天換液和補(bǔ)加細(xì)胞因子，培養(yǎng)13 d時(shí)即有25%左右的細(xì)胞是CD3+CD56+細(xì)胞，具有典型的CIK細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)性狀。CIK具增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，目前自體及異體外周血CIK細(xì)胞已被用于一些實(shí)體瘤和惡性血液病的治療，并取得了較好的療效。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與LAK 細(xì)胞相比，CIK細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，培養(yǎng)至22 d時(shí)體系中總的細(xì)胞數(shù)可增加100多倍。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型， 結(jié)果顯示CIK細(xì)胞培養(yǎng)后， 其主要效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+ 細(xì)胞較培養(yǎng)前顯著增加(P

綜上所述，本研究采用IFN-γ、抗CD3單抗、IL-1β和IL-2等多種細(xì)胞因子成功從健康人非貼壁PBMCs中誘導(dǎo)出大量的具有典型形態(tài)和免疫表型的CIK細(xì)胞，且具有較高的殺傷活性，為下一步臨床治療腫瘤奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

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[2]Lu PH, Negrin RS. Anovel population of expanded human CD3+CD56+cells derived from T cells with potent in vivo anti-tumor activity in mice with sever combined immunodeficiency[J]. Immunol,1994,153(6):1687-1696.

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細(xì)胞生物學(xué)的研究范文第3篇

關(guān)鍵詞：糖基轉(zhuǎn)移酶 探針 腫瘤 耐藥

Annual Report-Effect and Mechanism of Sugar Chains on the Biological Behavior

of Tumor Cells

Zhang Jianing1 Zhang Yan2 Yan Qiu1 Jia Li1 Wang Shujing1

（1.Dalian Medical University；2.Shanghai Jiao Tong University）

Abstract：This study suggests that the new Y subfamily of ppGalNAc-Ts plays an important role in protein glycosylation； characterizing their functions will provide new insight into the role of ppGalNAc-Ts. Disulfide- and terminal alkyne-modified magnetic silica particles （DA-MSPs） were synthesized and used to covalently capture and reductively release azido glycopeptides via click chemistry and dithiothreitol treatment. Using DA-MSPs， an efficient and specific enrichment method for separating azido glycopeptides has been developed. The alterations of integrin glycosylation play a crucial role in tumor metastasis. Our previous studies indicated that caveolin-1 promoted the expression of the key a2，6-sialytransferase ST6Gal-I and fibronectin-mediated adhesion of mouse hepatocarcinoma cell. Herein， we investigated the role of a2，6-sialylated a5-integrin in the adhesion of mouse hepatocarcinoma H22 cell. We demonstrated that caveolin-1 up-regulated cell surface a2，6-linked sialic acid via stimulating ST6Gal-I transcription. Cell surface a2，6-sialylation was required for integrin a5b1-dependent cell adhesion to fibronectin， and an increase in a2，6-linked sialic acid on a5-subunit facilitated fibronectin-mediated focal adhesion kinase phosphorylations， suggesting that a2，6-sialylated a5-subunit promoted integrin a5b1-dependent cell adhesion. B4GALT family consists of seven members， which encode corresponding enzymes known as type II membrane-bound glycoproteins. These enzymes catalyze the biosynthesis of different glycoconjugates and saccharide structures， and have been recognized to be involved in various diseases. In this study， we sought to determine the expressional profiles of B4GALT family in four pairs of parental and chemoresistant human leukemia cell lines and in bone marrow mononuclear cells （BMMC） of leukemia patients with multidrug resistance （MDR）. The results revealed that B4GALT1 and B4GALT5 were highly expressed in four MDR cells and patients， altered levels of B4GALT1 and B4GALT5 were responsible for changed drug-resistant phenotype of HL60 and HL60/adriamycin-resistant cells. Thus， we propose that B4GALT1 and B4GALT5， two members of B4GALT gene family， are involved in the development of MDR of human leukemia cells， probably by regulating the activity of Hh signaling and the expression of P-gp and MRP1.

細(xì)胞生物學(xué)的研究范文第4篇

【摘要】 為進(jìn)一步提高臍血造血細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)并達(dá)到臨床規(guī)模，本研究中利用自主開(kāi)發(fā)的有溶氧和pH控制的攪拌式生物反應(yīng)器進(jìn)行了臍血造血細(xì)胞的換液培養(yǎng)。結(jié)果表明，培養(yǎng)中總細(xì)胞、CD34+細(xì)胞、各系集落形成細(xì)胞(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，CFU-Mk)的擴(kuò)增倍數(shù)均高于方瓶培養(yǎng)，而且由于控制了較低的溶氧，所培養(yǎng)細(xì)胞中干/祖細(xì)胞含量顯著高于方瓶培養(yǎng)。該反應(yīng)器中培養(yǎng)的臍血造血細(xì)胞達(dá)到了臨床應(yīng)用的規(guī)模。結(jié)論：反應(yīng)器中培養(yǎng)環(huán)境更有利于干/祖細(xì)胞的維持和擴(kuò)增，而且可達(dá)到成人造血干細(xì)胞移植所需細(xì)胞量。

【關(guān)鍵詞】 臍血

Ex vivo Culture of Umbilical Cord Blood Hematopoietic Cells in Stirred Tank Bioreactor with feeding protocol

Abstract To increase the expansion multiple of cord blood (CB) hematopoietic cells and to reach a scale for clinical application，the mononuclear cells from CB were cultured in a autonomously developed stirred tank bioreactor with dissolved oxygen (DO) and pH controlling. The result showed that the expansion multiple of total cells，CD34+ cells，and progenitors cells (CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，and CFU-Mk) in bioreactor were greater than that in T-flasks. The rate of progenitors to total cells in bioreactor culture was also greater than that in T-flasks. The good results in bioreactor should be attributed to the controlled，optimized DO. Clinical-scale culture was realized from one sample of CB in this bioreactor. These results suggested that the culture environment in bioreactor with optimal DO and pH controlling is more favorable for stem/progenitor cell maintenance and expansion，and the expanded cells from one sample of CB is enough to transplant for an adult patient.

Key words cord blood；hematopoietic cell；bioreactor；stirred culture

臍血細(xì)胞中富含造血干細(xì)胞，從而成為除骨髓和外周血之外一個(gè)重要造血干細(xì)胞來(lái)源，在臨床上有著廣泛應(yīng)用，但臍血中造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量少，無(wú)法滿足成人的移植要求，而通過(guò)體外培養(yǎng)和擴(kuò)增有望克服這一矛盾。體外擴(kuò)增骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞、臍血細(xì)胞的臨床實(shí)驗(yàn)都已有所報(bào)道［1，2］，證明了體外擴(kuò)增后細(xì)胞用于臨床的安全性和可行性。目前開(kāi)發(fā)的體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)主要有平板灌注腔反應(yīng)器、固定床和流化床反應(yīng)器、攪拌式反應(yīng)器等［3］。其中攪拌式生物反應(yīng)器能提供均一的培養(yǎng)環(huán)境，而且取樣和數(shù)據(jù)采集簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制，因此，在造血細(xì)胞臨床規(guī)模培養(yǎng)中有較好的應(yīng)用前景［3，4］。本研究應(yīng)用自主開(kāi)發(fā)的攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，進(jìn)行臍血造血細(xì)胞的換液培養(yǎng)研究。

材料和方法

臍血(CB)和單個(gè)核細(xì)胞(MNC)的分離

臍血由上海國(guó)際和平婦嬰保健院提供。供者要求是身體健康、發(fā)育良好的非高齡產(chǎn)婦。臍血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)密度梯度離心后，收集單個(gè)核細(xì)胞，并以IMDM培養(yǎng)液洗滌2次。

培養(yǎng)基和細(xì)胞因子

體外培養(yǎng)液用IMDM（Gibco公司），使用時(shí)添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF（50 ng/ml）、IL-3（5 ng/ml）、IL-6（20 ng/ml）、G-CSF（2.0 ng/ml）和GM-CSF（2.0 ng/ml），其中SCF、IL-6購(gòu)于北京寶賽生物技術(shù)公司，IL-3購(gòu)于Pepro-Tech公司，G-CSF購(gòu)于上海三維制藥廠，GM-CSF購(gòu)于上海海濟(jì)生物技術(shù)有限公司。

造血細(xì)胞的反應(yīng)器換液培養(yǎng)

將分離得到的臍血單個(gè)核細(xì)胞以2×106 cells/ml的密度在 T-175方瓶中培養(yǎng)4天后，再接種到反應(yīng)器中或T-25型方瓶（Nunc公司）中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行的2次實(shí)驗(yàn)中接種密度均為0.8×106 cells/ml。反應(yīng)器為自主開(kāi)發(fā)產(chǎn)品，其中反應(yīng)器中所用材料經(jīng)過(guò)造血細(xì)胞的生物相容性檢驗(yàn)，反應(yīng)器工作體積為300-500 ml，攪拌系統(tǒng)為磁力攪拌，轉(zhuǎn)速控制為30 r/min。反應(yīng)器的溫度控制為37℃，溶氧和pH通過(guò)調(diào)節(jié)空氣、氮?dú)?、氧氣和二氧化碳的流量?lái)控制，通氣方式為表面通氣。pH控制在7.15，溶氧控制為飽和溶解空氣的25％。細(xì)胞接種到反應(yīng)器后，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至2.0×106 cells/ml后進(jìn)行換液，即取出50％的細(xì)胞液，并加入相同體積含有相同細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)中以T-25方瓶作對(duì)照，每瓶裝液7 ml，置于37℃、5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，方瓶與反應(yīng)器中換液比例和頻率相同。

細(xì)胞計(jì)數(shù)及活性分析

臺(tái)盼藍(lán)染色后利用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行活細(xì)胞和總細(xì)胞的計(jì)數(shù)，由于實(shí)驗(yàn)中很少能見(jiàn)到被染成藍(lán)色的細(xì)胞（死細(xì)胞），因此，未進(jìn)一步計(jì)算細(xì)胞活性。

造血細(xì)胞的集落檢測(cè)

集落的檢測(cè)體系為IMDM培養(yǎng)液，添加20％胎牛血清（FBS），4 mmol/ml谷氨酰胺（Sigma），含0.9％甲基纖維素(4 000cp，Sigma)，以及人重組造血生長(zhǎng)因子SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、 EPO，其濃度分別為50、20、20、20、20 ng/ml和2 U/ml，并添加1％牛血清白蛋白（BSA）。取(1-3)×104培養(yǎng)或沒(méi)培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞加入0.5 ml集落培養(yǎng)液中，置于37℃、5％ CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12天后，進(jìn)行CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix計(jì)數(shù)，其中CFU-Mix為至少含有粒細(xì)胞和紅細(xì)胞的集落。

CFU-Mk的檢測(cè)采用血漿塊法，細(xì)胞以1×105 cells/ml的接種密度接種于24孔板中，每孔加50 μl臍血漿，50 μl 3.4 g/L的CaCl2溶液，另加入含有TPO （20 ng/ml）、IL-3（10 ng/ml）、IL-6（10 ng/ml）的α培養(yǎng)基（Gibco公司），混勻后靜置凝固。培養(yǎng)10-12天后，用1∶3的甲醇/丙酮溶液原位脫水，并固定30分鐘，然后按次序加入1% BSA、鼠抗人CD41抗體、生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、抗生物素蛋白-堿性磷酸酯酶復(fù)合物（加入后都要作用一定時(shí)間，然后用0.05 mol/L Mtris/NaCl緩沖液淋洗3遍，再加入其它試劑），染色后在40×目鏡下觀測(cè)呈紅色的集落。

細(xì)胞表型分析

流式細(xì)胞儀分析中所用抗體為PharMingen公司產(chǎn)品。取1.0×106未擴(kuò)增或擴(kuò)增后的細(xì)胞加入1.5 ml離心管中，用PBS洗2遍，離心后倒掉上清液，加PE偶聯(lián)的小鼠抗人CD34單克隆抗體和FITC偶聯(lián)的小鼠抗人CD45單克隆抗體各10 μl，4℃孵育30分鐘。PBS洗2遍，離心后，每管加1 ml FACS保存液；標(biāo)記抗體后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）分析，結(jié)果用Lysis II軟件處理。

結(jié)

果

總細(xì)胞的擴(kuò)增

由圖1可見(jiàn)，換液培養(yǎng)時(shí)，總細(xì)胞在18天的培養(yǎng)中一直維持?jǐn)U增，在開(kāi)始的14天中反應(yīng)器和方瓶中總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)相差不大，14天后開(kāi)始有所差別，說(shuō)明培養(yǎng)到后期方瓶中細(xì)胞增殖潛力不如反應(yīng)器。擴(kuò)增到18天時(shí)，兩批實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器中總細(xì)胞分別擴(kuò)增37.2倍和26.3倍，方瓶低于反應(yīng)器中擴(kuò)增倍數(shù)。

干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增

CFU-Mix由于具有多向分化潛能，代表了較原始的干/祖細(xì)胞，換液培養(yǎng)中CFU-Mix擴(kuò)增情況如圖2所示，兩次實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器中CFU-Mix的擴(kuò)增分別在第10天和第9天達(dá)到最大，擴(kuò)增倍數(shù)分別為7.7和8.9，方瓶中第7-8天達(dá)到最大，而后逐漸下降，其擴(kuò)增倍數(shù)明顯低于反應(yīng)器中。反應(yīng)器中培養(yǎng)至14天仍可檢測(cè)到CFU-Mix，而方瓶中10天后僅能檢測(cè)到很少的CFU-Mix。

CFU-GM的擴(kuò)增在14天左右達(dá)到最大，而后維持?jǐn)?shù)天，或有所下降，而方瓶中擴(kuò)增倍數(shù)在第10天達(dá)到最大，而后開(kāi)始較快下降，而反應(yīng)器中CFU-GM擴(kuò)增倍數(shù)一直高于方瓶，最大擴(kuò)增倍數(shù)分別為27.4和23.6，顯著高于方瓶（圖2）。

BFU-E達(dá)到最大擴(kuò)增倍數(shù)的時(shí)間較早，在7天左右，由于本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有添加EPO，所以BFU-E的擴(kuò)增倍數(shù)不高，由圖2可以看出，反應(yīng)器中擴(kuò)增倍數(shù)一直高于方瓶。

反應(yīng)器中CFU-Mk的擴(kuò)增倍數(shù)在10天時(shí)達(dá)到最大，而后逐漸下降，14天后基本檢測(cè)不到CFU-Mk，而方瓶中第7-9天達(dá)到最大后就開(kāi)始較快地下降。擴(kuò)增最大時(shí)，兩次實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器中分別擴(kuò)增10.3倍和14.4倍（圖2）。

培養(yǎng)中CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增如圖3所示，反應(yīng)器擴(kuò)增倍數(shù)一直上升，至14天時(shí)達(dá)到最大，方瓶培養(yǎng)到第7天時(shí)與反應(yīng)器相差不大，第10天開(kāi)始有較大差異，第14天的擴(kuò)增倍數(shù)比第10天時(shí)提高不大。由圖看見(jiàn)最終反應(yīng)器中CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)高于方瓶培養(yǎng)。

反應(yīng)器培養(yǎng)的規(guī)模

附表顯示了2次實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)器培養(yǎng)的規(guī)模，由附表可見(jiàn)，如果不取出細(xì)胞而采用流加方式培養(yǎng)細(xì)胞，則培養(yǎng)到12天時(shí)，第1次實(shí)驗(yàn)中可得到2.44×109總細(xì)胞、4.88×106 CFU-Mix、11.9×106 CFU-GM和59.5×106 CD34+細(xì)胞，第2次實(shí)驗(yàn)可得到2.03×109總細(xì)胞、3.53×106 CFU-Mix、9.0×106 CFU-GM、和36.7×106 CD34+細(xì)胞。

造血干細(xì)胞移植中細(xì)胞需要達(dá)到的理想量是總細(xì)胞3.7×107 cells/kg，和CFU-GM 2.0×105 cells/kg，CD34+細(xì)胞2.5×106 cells/kg。按此計(jì)算，對(duì)于1個(gè)50公斤體重的病人總細(xì)胞、CFU-GM、CD34+細(xì)胞必須分別達(dá)到1.85×109、 10×106、和125×106 個(gè)。我們的檢測(cè)中是作同一集落分析而分別計(jì)數(shù)CFU-GM 和CFU-Mix，而CFU-Mix是比CFU-GM更原始的細(xì)胞，因此，這兩個(gè)數(shù)字應(yīng)該相加再與文獻(xiàn)中所述的CFU-GM量相比才是科學(xué)的，從總細(xì)胞和集落形成細(xì)胞數(shù)來(lái)說(shuō)，反應(yīng)器培養(yǎng)所得細(xì)胞可達(dá)到理想量的要求。CD34+細(xì)胞數(shù)雖然小于理想量，但也可滿足最低量25×106細(xì)胞的要求。因此，如果利用該反應(yīng)器一直補(bǔ)料培養(yǎng)，可以從一份臍血培養(yǎng)得到足夠用于臨床的細(xì)胞量。

討 論

造血干/祖細(xì)胞移植目前在臨床中主要用于造血干/祖細(xì)胞缺陷性血液病、先天性免疫病、各類自身免疫病、及實(shí)體瘤的治療，是一種重要的細(xì)胞治療手段。臍血造血干/祖細(xì)胞作為一種造血干/祖細(xì)胞來(lái)源，

由于數(shù)量較少，在臨床上只能用于兒童患者，要應(yīng)用于成人患者則必須通過(guò)體外擴(kuò)增增加其數(shù)量，其中培養(yǎng)環(huán)境中的溶氧、pH、細(xì)胞因子、培養(yǎng)方式等對(duì)擴(kuò)增效果有重要影響。因此，要實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)在臨床上應(yīng)用，需要開(kāi)發(fā)出足夠大規(guī)模、標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)系統(tǒng)以及相應(yīng)的擴(kuò)增工藝。本研究采用攪拌式生物反應(yīng)器在臨床規(guī)模擴(kuò)增了臍血單個(gè)核細(xì)胞，擴(kuò)增得到的細(xì)胞中代表造血干/祖細(xì)胞的CD34+細(xì)胞、CFU-GM、CFU-Mk等細(xì)胞的含量均較常規(guī)的靜態(tài)培養(yǎng)高，更適于臨床應(yīng)用。而且，其培養(yǎng)規(guī)模達(dá)到了臨床應(yīng)用中所需移植細(xì)胞量的要求。

溶氧是造血細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)控因子，很多報(bào)道都表明，低氧分壓（1％-5％）比正常氧分壓（20％）有利于造血干/祖細(xì)胞的維持和擴(kuò)增［6］，因此，我們?cè)谏锓磻?yīng)器中控制的溶氧為飽和空氣的25%，這與5％氧分壓相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)器培養(yǎng)中不但細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)高，所得細(xì)胞中CFU-GM、CFU-Mix、CFU-Mk，CD34+細(xì)胞的含量都高于方瓶培養(yǎng)的結(jié)果，而且維持時(shí)間比方瓶中長(zhǎng)，這應(yīng)該與反應(yīng)器中所維持的低溶氧有關(guān)。

值得注意的是，在本系統(tǒng)中雖然在一定程度上可以減緩造血干/祖細(xì)胞的分化速度，但并不能從根本上解決培養(yǎng)過(guò)程中造血干/祖細(xì)胞的分化問(wèn)題。另外，本實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)的各類集落形成細(xì)胞及CD34+細(xì)胞都僅能代表造血祖細(xì)胞，因此其擴(kuò)增情況只能代表祖細(xì)胞的擴(kuò)增，如果要確定造血干細(xì)胞是否真正實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增，則需要進(jìn)行SCID小鼠體內(nèi)造血重建實(shí)驗(yàn)才能夠確定。

Collins等［3］也用400 ml的有pH和溶氧控制的反應(yīng)器進(jìn)行了臍血造血細(xì)胞的培養(yǎng)，其2次實(shí)驗(yàn)中總細(xì)胞分別擴(kuò)增了約35倍和200倍，而CFU-GM分別擴(kuò)增了約23倍和30倍，我們的結(jié)果與之相比相差不大。Kim等［7］在不控制pH和溶氧的轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行了骨髓造血細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)中只添加細(xì)胞因子組合IL-3、SCF、GM-CSF和EPO，結(jié)果總細(xì)胞和CFU-GM只擴(kuò)增了8倍和5倍。在此基礎(chǔ)上添加基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基顯著提高了總細(xì)胞的擴(kuò)增，CFU-GM擴(kuò)增也提高到了17倍，CFU-GM含量大大增加。我們的實(shí)驗(yàn)中所添加的細(xì)胞因子為IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF和G-CSF，其中促分化的IL-3、GM-CSF和G-CSF添加量都較小，分別為5 ng/ml、2 ng/ml、2 ng/ml，這對(duì)防止細(xì)胞過(guò)早分化有一定作用。如果在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基，如添加基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基或FL和TPO等能促進(jìn)干細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子等，有望進(jìn)一步提高造血干/祖細(xì)胞的增殖。

除造血干/祖細(xì)胞外，為縮短粒細(xì)胞和血小板的恢復(fù)期，以及為放療和化療提供輔助治療，臨床中對(duì)粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、紅細(xì)胞等成熟細(xì)胞的需求也很大，因此，培養(yǎng)成熟細(xì)胞也是造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的重要內(nèi)容之一。Neildez-Nguyen等［8］在體外培養(yǎng)紅細(xì)胞前體細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中所培養(yǎng)的總細(xì)胞數(shù)達(dá)1010個(gè)，這些前體細(xì)胞在輸入小鼠體內(nèi)后可分化為成熟的紅細(xì)胞，對(duì)于如此大規(guī)模的成熟細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)用攪拌式生物反應(yīng)器將更有優(yōu)勢(shì)。

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細(xì)胞生物學(xué)的研究范文第5篇

1 細(xì)胞機(jī)械應(yīng)力響應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)

1．1　細(xì)胞結(jié)構(gòu)的張力完整性：張力完整性結(jié)構(gòu)(stress integrality structure，SIS)由承受壓力構(gòu)件和一系列連續(xù)的張力構(gòu)件相互連接組成。這種結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性取決于結(jié)構(gòu)內(nèi)部完整性的保持，因而被稱為張力完整性。生物學(xué)研究表明，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)符合張力完整性原理，而且細(xì)胞骨架(cellularframework，CF)的張力完整性影響細(xì)胞的形狀及功能。細(xì)胞骨架的張力完整性是細(xì)胞形變的主要決定因素。有關(guān)研究表明扁平細(xì)胞比圓形細(xì)胞DNA合成更為旺盛，說(shuō)明細(xì)胞的變形是信息傳遞的重要環(huán)節(jié)。在機(jī)械應(yīng)力的作用下細(xì)胞骨架的所有構(gòu)件為了分散張力和壓力而發(fā)生整體重排，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生形變，細(xì)胞形狀調(diào)節(jié)發(fā)出的調(diào)節(jié)信息以力的形式傳遞。因此，機(jī)械應(yīng)力的變化可以通過(guò)細(xì)胞及其骨架內(nèi)的力平衡而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和生化性質(zhì)產(chǎn)生影響，即細(xì)胞受到來(lái)自體外的直接的力學(xué)刺激時(shí)，它的形態(tài)和功能都會(huì)發(fā)生改變。由于張力完整性結(jié)構(gòu)中存在預(yù)應(yīng)力，若對(duì)該結(jié)構(gòu)中的某一構(gòu)件施加應(yīng)力，所有相互連接的構(gòu)件包括距離很遠(yuǎn)的構(gòu)件就會(huì)整體重排，從而導(dǎo)致線性硬化響應(yīng)，即結(jié)構(gòu)硬度的增加與施加應(yīng)力的增加成正比?；罴?xì)胞線性硬化以響應(yīng)通過(guò)細(xì)胞表面受體傳遞的應(yīng)力，力學(xué)信號(hào)再通過(guò)細(xì)胞骨架的幾何形狀或分子結(jié)構(gòu)依賴于力的變化而轉(zhuǎn)變?yōu)樯憫?yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，骨架重排可引起細(xì)胞形態(tài)的改變，細(xì)胞骨架作為細(xì)胞內(nèi)的張力框架，通過(guò)與細(xì)胞膜上分子的直接聯(lián)系，將力學(xué)受體上的分子扭曲力在細(xì)胞內(nèi)傳遞分布，再經(jīng)過(guò)效應(yīng)分子的扭曲力將力學(xué)信號(hào)最終表現(xiàn)在效應(yīng)點(diǎn)上。

1．2　整合素：細(xì)胞整合素是一類重要的細(xì)胞表面受體，其配體主要為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellularmatrix，ECM)，如膠原蛋白、纖粘連蛋白、層粘連蛋白等。整合素通過(guò)識(shí)別這些胞外基質(zhì)蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM的粘附反應(yīng)并接受傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)信號(hào)，在多種基本的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其β亞單位的胞內(nèi)區(qū)不僅能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)如vinculin、talin、paxillin及－actinin反應(yīng)，而且還能與聚焦粘附激酶(focaladhesion kinase，F(xiàn)AK)的氨基端反應(yīng)，F(xiàn)AK進(jìn)一步與各種信號(hào)分子反應(yīng)，如C－Src、Graf(與FAK有關(guān)的GTP酶調(diào)控因子)、IP－3激酶等，這些信號(hào)分子又可進(jìn)一步激活各種下游蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括促有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen－activitatedprotein kinase，MAPK)，蛋白激酶c(proteinkinase C，PKC)和PIP－5激酶等。

目前，越來(lái)越多的研究表明整合素具有機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，并且主要集中于整合素聚焦粘附區(qū)域，起到變機(jī)械力學(xué)信號(hào)為化學(xué)信號(hào)的作用。采用裱襯了纖粘連蛋白或含RGD肽的微球?qū)?xì)胞進(jìn)行剪切加載，發(fā)現(xiàn)力信號(hào)可以直接傳入細(xì)胞骨架(表現(xiàn)為細(xì)胞硬度指數(shù)隨應(yīng)變?cè)龃蠖龈?，而若微球未裱襯或裱襯其他非整合素的配體，則力信號(hào)不能直接傳入細(xì)胞骨架。利用磁扭轉(zhuǎn)細(xì)胞計(jì)，將機(jī)械應(yīng)力直接作用于細(xì)胞表面受體證實(shí)，β1整合素能將力信號(hào)傳遞至細(xì)胞骨架，誘導(dǎo)聚焦粘附的形成，支持應(yīng)力依賴性細(xì)胞硬度反應(yīng)，這說(shuō)明整合素是外力傳向細(xì)胞骨架的通道，細(xì)胞通過(guò)其表面的整合素受體及時(shí)響應(yīng)，以張力整和的形式將響應(yīng)的機(jī)械力信號(hào)有選擇地轉(zhuǎn)換到細(xì)胞和核內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)部件上，如聚焦粘附絡(luò)合物中的信號(hào)分子、細(xì)胞膜中的離子通道、核糖體、核膜孔、染色體、甚至可能是單個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)力化學(xué)轉(zhuǎn)化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理機(jī)能，對(duì)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和影響細(xì)胞的功能產(chǎn)生調(diào)控作用。

1．3　第二信使系統(tǒng)：細(xì)胞感受機(jī)械應(yīng)力之后可生成一系列的第二信使分子，比如Ca2+，cAMP、PKC和IP3等。機(jī)械牽拉或剪應(yīng)力作用可使成骨細(xì)胞和一些力敏感細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增高，Duncan等人的工作表明，應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度增高，至少部分通過(guò)應(yīng)力敏感離子通道，且牽拉可使其電導(dǎo)增加并變得對(duì)機(jī)械刺激更為敏感。機(jī)械應(yīng)變和剪應(yīng)力亦均可誘導(dǎo)胞內(nèi)IP3濃度增高，而IP3可以動(dòng)員胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放，從而使胞內(nèi)Ca2+十濃度增高。機(jī)械牽拉和剪應(yīng)力均可使胞內(nèi)cAMP濃度增高，而cAMP濃度的增高與力刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成密切相關(guān)。機(jī)械刺激可在20s內(nèi)增高IP3水平，并使IP3水平和PKC活性在2min內(nèi)達(dá)到峰值。另外應(yīng)力也可直接激活磷脂酶A－2參與力的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程?？梢?jiàn)，Ca2+,cAMP．PKC和IP3等第二信使系統(tǒng)可在應(yīng)力作用下發(fā)生變化。

1．4　應(yīng)力反應(yīng)元件：應(yīng)力反應(yīng)元件(stressresponsive element，SRE)是存在于細(xì)胞基因的啟動(dòng)子內(nèi)并且能夠被應(yīng)力所誘導(dǎo)的啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)控元件，能夠特異性地上調(diào)或下調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)。目前已知的機(jī)械應(yīng)力反應(yīng)元件至少涉及4種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及10余種受應(yīng)力調(diào)控的相關(guān)基因。轉(zhuǎn)錄因子又稱“第三信使”，是一類位于胞漿或胞膜上的蛋白質(zhì)，被“第二信使”在轉(zhuǎn)錄后水平激活向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與特定的DNA序列結(jié)合，選擇性地調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。目前在細(xì)胞上已發(fā)現(xiàn)至少有4種轉(zhuǎn)錄因子可被應(yīng)力激活，它們分別是：①基因結(jié)合核因子(nuclear factor－gene binding，NF－xB)；②激活蛋白(activator protein－1，AP－1)；⑧早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白(early growthresponse－1，Egr－1)；④刺激蛋白(stimulatoryprotein－1，SP1)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的10余種受機(jī)械應(yīng)力調(diào)控的相關(guān)基因，根據(jù)它們的生物學(xué)特性，大致可以分為血管活性物質(zhì)基因、生長(zhǎng)因子基因、粘附分子基因、趨化因子基因、凝血因子基因和原癌基因等。

2　細(xì)胞機(jī)械應(yīng)力響應(yīng)可能機(jī)制

具有應(yīng)力感受功能的細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)感受力學(xué)微環(huán)境的變化，可將力信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)一系列生物化學(xué)信號(hào)，最終導(dǎo)致基因表達(dá)變化。細(xì)胞外基質(zhì)、整合素、局部粘附蛋白和細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)

相互聯(lián)系，彼此之間構(gòu)成了一個(gè)完善的張力整合系統(tǒng)。在機(jī)械應(yīng)力傳入細(xì)胞的過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞膜均可能參與了信息傳遞，細(xì)胞上存在的整合素等機(jī)械應(yīng)力感受器可直接將信息傳入細(xì)胞內(nèi)，再通過(guò)細(xì)胞骨架的傳遞將信息傳入細(xì)胞核。

業(yè)已證明，在細(xì)胞中有好幾種轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞膜離子通道(特別是牽拉激活的陽(yáng)離子選擇性通道，如SA－cat)、與G蛋白偶聯(lián)的磷脂酶C通路、細(xì)胞內(nèi)鈣離子和細(xì)胞骨架等都參與了細(xì)胞的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(mechanical stress－initiatedsignal transduction，MSIST)。胞外基質(zhì)－整合素－細(xì)胞骨架復(fù)合體是主要的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以傳遞作用在細(xì)胞表面上的應(yīng)力到細(xì)胞內(nèi)各區(qū)。此外已有一些證據(jù)，包括使用不同的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及成骨細(xì)胞，表明在肌動(dòng)蛋白肌絲與整合素的細(xì)胞質(zhì)區(qū)部分之間起介導(dǎo)作用的a－輔肌動(dòng)蛋白是一個(gè)關(guān)鍵分子結(jié)構(gòu)，干擾肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成可阻止信號(hào)向細(xì)胞核的傳遞。G蛋白為常見(jiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子，大G蛋白通過(guò)對(duì)其亞基上氨基酸殘基的脂化修飾作用而錨定在細(xì)胞膜上，從而為其接受細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)信號(hào)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而小G蛋白則通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)―整合素―細(xì)胞骨架接受細(xì)胞外機(jī)械信號(hào)。Gudi等證實(shí)G蛋白的活化是早期心肌成纖維細(xì)胞應(yīng)力刺激的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)。細(xì)胞膜離子通道主要為力敏感陽(yáng)離子通道，如Ca2+K+、Na+等，其激活無(wú)需第二信使分子的參與。細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放也可能在力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起一定作用。鈣離子的升高起始于細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放，隨即伴有鈣離子內(nèi)流。細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放的機(jī)制可能與細(xì)胞骨架和磷脂酶c通路有關(guān)，應(yīng)變所導(dǎo)致的細(xì)胞變形可以使與細(xì)胞骨架相連的一種磷脂酶c抑制子脫離原位，抑制子的解除可以允許磷脂酶c的激活。磷脂酶C又可激活蛋白激酶c通路，后者又產(chǎn)生三磷酸肌醇和甘油二脂，三磷酸肌醇則促使鈣離子從細(xì)胞內(nèi)的貯存處釋放。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的途徑則是通過(guò)SA－cat通道。

一旦機(jī)械應(yīng)力被感知，PKC以及MAPKS即被活化，導(dǎo)致c－fos、c－jun基因表達(dá)。Sadoshima等證實(shí)機(jī)械應(yīng)力可以活化磷脂酶c、磷脂酶A2、磷脂酶D、IP3以及DAG，同時(shí)細(xì)胞膜上磷脂被磷脂酶C分解，能產(chǎn)生肌糖磷酸化以及diacylglycerol，而導(dǎo)致PKC活化，IP3激酶在細(xì)胞骨架參予的應(yīng)力作用過(guò)程中扮演著關(guān)鍵的角色。機(jī)械應(yīng)力還可直接活化酪氨酸激酶途徑并將機(jī)械信號(hào)傳遞給鳥(niǎo)嘌呤核苷接合蛋白(ras)，也可直接活化MAPK、MAPKK以及raf－1激酶。

盡管存在著多條不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但它們之間是密切聯(lián)系的，這表明在感受應(yīng)力刺激的過(guò)程中需要的是整個(gè)細(xì)胞的參與，而不可能只依賴于單一的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。不同的力學(xué)信號(hào)可能通過(guò)這些內(nèi)在聯(lián)系而又相互調(diào)控的信號(hào)通路以不同的方式來(lái)影響細(xì)胞的反應(yīng)。