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本文作者：呂琦1吳峰1，2林潔1譚仲夏3秦西云3夏振遠(yuǎn)3莫笑晗3馬嵐2作者單位：1云南大學(xué)2清華大學(xué)3云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院

抗原的制備

經(jīng)工程菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)并純化所得的rTMV－CP－F蛋白經(jīng)過SDS－PAGE電泳分析，rTMV－CP－F蛋白相對分子質(zhì)量為31ku(圖3)，符合目的蛋白的大小，最終所得的rTMV－CP－F蛋白純度為95%，滿足免疫實驗要求．

免疫小鼠抗血清分析

4只Balb/c免疫小鼠的血清抗體滴度都在10－5～10－6間，表明免疫效果比較好．

單抗細(xì)胞株的制備

4只免疫小鼠分2次進(jìn)行細(xì)胞融合，融合細(xì)胞經(jīng)篩選培養(yǎng)、有限稀釋法單克隆化篩選培養(yǎng)后，共獲得14株能穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株．用質(zhì)量濃度5mg/L的rTMV－CP和5mg/L的TMV病毒顆粒分別包被酶標(biāo)檢測板，并用脫毒煙葉提取液包被作為陰性對照，間接ELISA法檢測14株細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，結(jié)果表明這14株細(xì)胞所分泌抗體與rTMV－CP和TMV病毒顆粒均有特異性反應(yīng)，與脫毒煙葉提取液無特異性反應(yīng)(圖4)．

抗體的亞類及輕鏈型

獲得的14株細(xì)胞所分泌的抗體都經(jīng)間接法ELISA分析后，抗體亞類都為IgG1、輕鏈型都為κ型(表1)．

抗體制備和鑒定

將14株細(xì)胞進(jìn)行腹水制備和抗體純化，腹水的抗體滴度都在1∶106～1∶107范圍內(nèi)，腹水經(jīng)ProteinA一步法純化后，抗體純度在80%以上，其相對分子質(zhì)量在150～160ku．

抗體的特異性分析

選取感染TMV煙葉的提取物作為陽性對照，表觀正常的土壤培育植株及其土壤樣本、實驗室脫毒的植株及其培養(yǎng)物樣本作為陰性對照，同樣用間接ELISA的方法來檢測抗體的特異性，包被濃度為1∶500．用質(zhì)量濃度5mg/L的ToMV包板，檢測其與抗TMV抗體的交叉反應(yīng)．14株抗體與染毒煙葉都有特異反應(yīng)．在陰性對照中，田間土壤栽培煙葉提取物、實驗室栽培的脫毒煙葉提取物與12株TMV單克隆抗體無特異反應(yīng)，只有2對抗體(3D7a、3D7b)有微弱的反應(yīng)．14株抗體與ToMV無交叉反應(yīng)(圖5)．

討論

TMV－CP在引起煙草花葉中起決定性的作用，感染TMV的煙草葉綠體中存在大量的TMV－CP［16］，因此將TMV－CP作為免疫原制備抗TMV抗體對于提高其準(zhǔn)確性和特異性都具有重要意義．rTMV－CP和天然TMV病毒顆粒存在類似的表位［17］，但是由于rTMV－CP的原核表達(dá)導(dǎo)致其構(gòu)象多樣，在單獨免疫小鼠時會造成表位的混亂，導(dǎo)致抗體不能識別天然TMV病毒顆粒，因此本研究采用將2種抗原混合后共同免疫，再用2種抗原同時篩選所得抗體，這樣所得到的抗體即能同時識別TMV－CP和天然TMV病毒顆粒．通過將TMV－CP和天然TMV病毒顆粒混合免疫，最終得到14株可以穩(wěn)定分泌抗TMV抗體的雜交瘤細(xì)胞．所制備腹水經(jīng)ProteinA一步法親和層析純化所得抗體，抗體效價在1∶106～1∶107范圍，抗體純度在80%以上．14株抗體均與TMV－CP重組蛋白和TMV病毒有良好特異反應(yīng)．同時，針對將來抗體的應(yīng)用范圍選取了測試抗體特異性的實驗．所制備的抗體的特異性高與ToMV無交叉反應(yīng)，為下一步研制免疫檢測試劑盒提供了重要材料．