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探究病毒的克隆技術(shù)

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探究病毒的克隆技術(shù)

1材料與方法

基因DNA模板、PCMV陽性血清、表達(dá)載體pET32a(+)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心提供,2月齡健康雄性白兔(體重2kg)購(gòu)自雅安市某家兔養(yǎng)殖基地。克隆載體pMD19-TSimple,限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、IPTG、蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;N,N’-亞甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、SDS、TEMED、考馬斯亮藍(lán)R-250、2-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、瓊脂糖、甘油、氨芐青霉素、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、硫酸銨等均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,其他化學(xué)試劑均為分析純。引物的設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用.0b等分子生物信息軟件對(duì)PCMVgB基因及其編碼氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并選擇gB基因2305~2574bp優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)作為目的序列,參照NCBI上的豬巨細(xì)胞病毒gB基因序列(登錄號(hào):FJ844360.1),應(yīng)用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)引物P1、P2,在引物P1、P2的5′端分別引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ,用于PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體的連接,并在引物P1、P2酶切位點(diǎn)后分別引入起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。P1/P2擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)270bp,上述引物送上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成,引物序列如下(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)),下劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn))。PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)的PCR擴(kuò)增以gB基因DNA為模板,分別以P1、P2為上游引物和下游引物,對(duì)PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)進(jìn)行體外擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性,經(jīng)30個(gè)循環(huán)后,于72℃延伸8min?;騼?yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)表達(dá)載體的建立及重組蛋白的表達(dá)與純化將PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳后,利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段,將目的片段連入pMD19-TSimple克隆載體并轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α后抽提質(zhì)粒,進(jìn)行質(zhì)?;蚪M測(cè)序,并使用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切,將酶切后的目的片段連接入pET32a(+)載體,并命名重組質(zhì)粒為pET32a(+)-gB,轉(zhuǎn)化入E.后將重組表達(dá)菌命名為E.。使用濃度為0.2mg/L的IPTG誘導(dǎo)E.重組表達(dá)菌表達(dá)后,將表達(dá)產(chǎn)物通過組氨酸標(biāo)簽融合蛋白純化柱進(jìn)行純化,并測(cè)定純化后的蛋白質(zhì)濃度。PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白的反應(yīng)原性分析以純化的PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原,PCMV陽性血清為一抗,以HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗進(jìn)行試驗(yàn),并設(shè)置PCMV陰性血清對(duì)照組,鑒定PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白的反應(yīng)原性。多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)的測(cè)定使用純化后的PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白與弗氏佐劑按1∶1體積比進(jìn)行乳化后制成油乳劑,對(duì)健康家兔進(jìn)行免疫,第4次免疫完成后對(duì)試驗(yàn)家兔采取心血,將血液收集至離心管中,先于常溫傾斜放置30min,再轉(zhuǎn)至37℃培養(yǎng)箱中放置1h,最后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中放置過夜,于4000r/min離心15min分離血清。將分離的血清無菌進(jìn)行分裝后于-20℃保存?zhèn)溆?,并避免反?fù)凍融。以純化后的PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白(質(zhì)量濃度為0.62μg/mL)作為抗原,以瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)驗(yàn)證經(jīng)PBS緩沖液稀釋后的多克隆抗體效價(jià)。鑒定以純化的PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原,制備的多克隆抗體作為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western-blot鑒定,以免疫前的家兔血清作為陰性對(duì)照,鑒定該多克隆抗體的反應(yīng)性。

2討論

自1950年P(guān)CMV在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來,該病毒就因?yàn)槠涿庖咭种铺匦砸约澳軌蛲ㄟ^跨物種器官移植而感染人與其他動(dòng)物而備受關(guān)注,但由于該病毒分離困難,導(dǎo)致了對(duì)該病毒的研究一直落后于其他皰疹病毒科病毒。囊膜糖蛋白B(gB)是PCMV重要的跨膜糖蛋白,也是特定細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的主要靶蛋白,是淋巴因子激活的自然殺傷細(xì)胞的識(shí)別對(duì)象,且gB蛋白具有良好的免疫原性,并在誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫中起著重要作用,對(duì)該蛋白進(jìn)行研究有助于了解PCMV的感染機(jī)制,為該病毒感染的防治奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)構(gòu)建了pET32a(+)-gB高效重組表達(dá)質(zhì)粒,應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)以可溶性形式高效表達(dá)了PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白,成功表達(dá)并純化了PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白,并驗(yàn)證了其具有良好的反應(yīng)原性,可以作為間接ELISA檢測(cè)的包被抗原,通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和Western-blot試驗(yàn),也證實(shí)了制備的多克隆抗體可以與gB蛋白特異性結(jié)合。本研究為進(jìn)一步分析PCMVgB蛋白的生物學(xué)特性,建立PCMV抗體血清學(xué)診斷方法奠定了重要基礎(chǔ),為制備早期檢測(cè)PCMV抗體的檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

作者:江一帆劉驍單位:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

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