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一、試劑

單抗（抗vWFA3區(qū)）及SZ－34（抗vWFA2區(qū)）為本研究所研制；正常健康人全血由蘇州大學附屬第一醫(yī)院和本研究所志愿者提供；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原為Sigma公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標記的兔抗人vWF抗體為；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液為美國Thermo公司產(chǎn)品；乙酸為國產(chǎn)分析純試劑。主要緩沖液：TBS緩沖液：；洗滌緩沖液：；包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液；封閉緩沖液：1％牛血清白蛋白（BSA）－TBS；樣品稀釋緩沖液：同封閉緩沖液；終止液：硫酸；均由本實驗室制備。

二、方法

1．vWF膠原結(jié)合抑制實驗乙酸酸化的人胎盤Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原濃度均為20μg／ml，以100μl／孔包被在96孔板上4℃過夜，經(jīng)洗滌后，每孔用含10g／LBSA的TBS以200μl／孔封閉過夜。經(jīng)TBS－0．1％Tween再次洗滌后，每孔分別加入正常人混合血漿50μl和SZ－12350μl共計100μl／孔，單抗SZ－123濃度依次倍比稀釋，空白對照孔為100μl1％BSA－TBS。37℃孵育2h，用洗滌緩沖液洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗人vWF抗體于37℃孵育2h，洗滌3次，用TMB顯色10min，硫酸3mol／ml終止反應(yīng)，酶標儀450nm檢測。單抗SZ－34作陰性對照，方法同上。每次實驗重復3次，取均值。2．平板流動小室內(nèi)血小板黏附實驗用75％酒精消毒載玻片，自然晾干，將100μg／ml乙酸酸化的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原分別包被在載玻片上，4℃過夜，經(jīng)0．9％生理鹽水洗滌后用2％BSA－PBS封閉過夜，經(jīng)0．9％生理鹽水洗滌后，備用。應(yīng)用剪切力為1000s－1的FlowChamber實驗，整個灌注過程均在37℃小室中進行，經(jīng)肝素（40U／ml）抗凝的人全血2管，1管加單抗SZ－123，另1管為SZ－34陰性對照，均在37℃孵育10min，然后全血在包被有膠原的載玻片表面小室中灌注，將經(jīng)血小板黏附的載玻片表面用生理鹽水灌注2次后，在倒置顯微鏡下觀察血小板的黏附情況。

三、平板流動小室內(nèi)血小板黏附實驗

在高條件下，SZ－123抑制人血小板在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原上的；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原表面血小板黏附率分別為90％、95％、60％，加有單抗SZ－123的全血血小板表面黏附率分別為11％、4％、28％。一討論血栓形成過程中，血管內(nèi)皮細胞受到損傷時內(nèi)皮下膠原等細胞外基質(zhì)暴露，與循環(huán)血液中vWF結(jié)合，使vWF構(gòu)型發(fā)生改變，或者在高剪切力條件下vWF構(gòu)型發(fā)生改變，暴露了血小板膜糖蛋白GPⅠb的結(jié)合位點，vWF在血小板和血管壁之間形成橋梁介導血小板黏附到受損的血管壁或病變的血管部位，使血小板黏附、聚集和活化，引起活化血小板釋放進一步放大，最終引起血液的凝固和血栓的形成。膠原是激活血小板的重要物質(zhì)，能誘導血小板呈不可逆聚集。在內(nèi)皮損傷后，膠原首先激活血小板，從而啟動凝血鏈鎖反應(yīng)產(chǎn)生凝血酶，血小板繼續(xù)被活化，并不斷釋放出ADP和血栓素A2，導致血小板在局部不斷地被激活。膠原與血小板之間的相互作用是保證血小板發(fā)生牢固黏附和聚集反應(yīng)、并形成血小板血栓的關(guān)鍵步驟。vWF主要通過A1和A3區(qū)與血小板GPⅠb和膠原結(jié)合，A1區(qū)主要參與GPⅠb和Ⅳ型膠原的結(jié)合，A3區(qū)則主要參與Ⅰ、Ⅲ型膠原的結(jié)合，在不同情況下（如不同流體動力學或不同細胞外基質(zhì)），A1和A3區(qū)將發(fā)揮不同程度的作用。我們之前報道了1株特異性針對vWFA3區(qū)的單抗SZ－123，該單抗不僅能抑制vWF與Ⅲ型膠原的結(jié)合，還能抑制vWF與血小板的結(jié)合，這一結(jié)果提示vWFA3區(qū)膠原結(jié)合部位可能動態(tài)調(diào)節(jié)vWFA1區(qū)的功能。本研究的各型膠原結(jié)合抑制實驗再次驗證了這種猜測，SZ－123對A3區(qū)結(jié)合的Ⅰ、Ⅲ型膠原抑制率達到95％和96％，而對A1區(qū)結(jié)合的Ⅳ型膠原也有一定的抑制功能，且說明了單抗SZ－123對血管內(nèi)皮下各型膠原均有抑制作用，驗證了單抗SZ－123的抗血栓作用。血管損傷后，血管剪切力誘導vWF發(fā)生自發(fā)性聚集，并募集血液循環(huán)中的血小板，使血小板黏附于受損內(nèi)皮下的膠原纖維中，從而啟動血栓形成FlowChamber模擬了體內(nèi)血管剪切力、溫度等環(huán)境，通過這種方式來檢驗單抗SZ－123的抗血栓作用，證實SZ－123具有很好的抗血小板聚集功能。綜上所述，本研究通過體外的膠原結(jié)合抑制實驗及模擬體內(nèi)血管環(huán)境的FlowChamber實驗驗證了SZ－123作為新一代抗血小板藥物的效能，為SZ－123成為新一代的抗血小板藥物臨床使用提供更充分的實驗數(shù)據(jù)支持。

作者：姚拾秀江淼趙益明單位：蘇州大學