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1實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑LB962型化學(xué)發(fā)光分析儀

（德國(guó)伯托公司）；白色96孔板（美國(guó)康寧公司）。魯米諾（Sigma-aldrich公司）；8-羥基喹啉（Sig－ma-aldrich公司）；FeCl3（Sigma-aldrich公司）；過(guò)氧化氫（30%，Sigma-aldrich公司）；ATP生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒（ENLITEN，美國(guó)普洛麥格公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)Milli-Q（Millipore公司）純化的超純?nèi)ルx子水。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1儲(chǔ)備液的配制

魯米諾儲(chǔ)備溶液：稱取一定量的魯米諾溶于1mol/L的NaOH溶液中，配制成1×10-2mol/L的魯米諾儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存在棕色瓶中，避光4℃保存。8-羥基喹啉儲(chǔ)備溶液：稱取一定量的8-羥基喹啉溶于0.1mol/L的HCl溶液中，配制成1×10-2mol/L的8-羥基喹啉儲(chǔ)備液，4℃保存。Fe（III）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取一定量的烘干恒重的FeCl3溶于pH2.5的HCl溶液中，配制成1×10-3mol/L的Fe（III）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，其摩爾濃度通過(guò)硫代硫酸鈉滴定法準(zhǔn)確確定，通過(guò)GBW(E)081235硫代硫酸鈉滴定溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行溯源。ATP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取一定量的ATP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物溶于無(wú)ATP水（ATP生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒自帶）中，配制成1×10-7mol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃保存。作為實(shí)驗(yàn)室研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，需要按照ISO導(dǎo)則35要求，摩爾濃度經(jīng)過(guò)8家單位聯(lián)合驗(yàn)證，并經(jīng)過(guò)一系列均勻性、穩(wěn)定性的考查。

1.2.2工作溶液的配制

魯米諾工作溶液：用純水將魯米諾儲(chǔ)備液稀釋成1×10-3mol/L的魯米諾工作溶液（其中NaOH的摩爾濃度為0.1mol/L）。8-羥基喹啉工作溶液：用純水將8-羥基喹啉儲(chǔ)備溶液稀釋成1×10-3mol/L的8-羥基喹啉工作液（其中HCl的摩爾濃度為0.01mol/L）。Fe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用pH2.5的HCl溶液將Fe（III）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋成Fe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1×10-4mol/L，3×10-5mol/L，1×10-5mol/L，3×10-6mol/L，1×10-6mol/L）。過(guò)氧化氫溶液：取一定量體積分?jǐn)?shù)為30%的過(guò)氧化氫，用水稀釋至1%，用時(shí)現(xiàn)配。ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用檢測(cè)緩沖液（ATP生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒自帶）將ATP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋成ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1×10-8mol/L，1×10-9mol/L、1×10-10mol/L，1×10-11mol/L），現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3實(shí)驗(yàn)方法

1）化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系的建立

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：在1.5mL離心管中分別依次加入以下溶液，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，每秒取一個(gè)點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間共100s。①10μL魯米諾工作溶液、100μL過(guò)氧化氫溶液、10μLpH2.5的HCl溶液（相當(dāng)于10μLFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液）、85μLpH2.0的HCl溶液（相當(dāng)于85μL8-羥基喹啉工作溶液）；②10μL魯米諾工作溶液、100μL過(guò)氧化氫溶液、10μLFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3×10-5mol/L）、85μLpH2.0的HCl溶液（相當(dāng)于85μL8-羥基喹啉工作溶液）；③10μL魯米諾工作溶液、100μL過(guò)氧化氫溶液、10μLpH2.5的HCl溶液（相當(dāng)于10μLFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液）、85μL8-羥基喹啉工作溶液；④10μL魯米諾工作溶液、100μL過(guò)氧化氫溶液、10μLFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液。8-羥基喹啉的用量對(duì)體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響：在10μL魯米諾工作溶液、100μL過(guò)氧化氫溶液、10μLFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3×10-5mol/L）中分別加入不同體積的8-羥基喹啉工作溶液，并用pH2.0的HCl溶液將體系補(bǔ)足205μL，立即檢測(cè)當(dāng)前發(fā)光值。pH對(duì)體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響：在1.5mL離心管中依次加入10μL魯米諾工作溶液、100μL過(guò)氧化氫溶液、10μLFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液，利用HCl或NaOH調(diào)整體系的pH值，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)當(dāng)前發(fā)光值。反應(yīng)介質(zhì)對(duì)體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響：在1.5mL離心管中分別加入50μL的Tris-HCl、H3BO3-KOH、Na2CO3-NaHCO3和B-R緩沖溶液，然后分別依次加入10μL魯米諾工作溶液、100μL過(guò)氧化氫溶液、10μLFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)當(dāng)前發(fā)光值。

2）生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系的建立

用ATP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)代替ATP生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒中的ATP校準(zhǔn)溶液，采用試劑盒中的其他溶液建立生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系：首先，將10μL檢測(cè)緩沖液加入有100μL熒光素/熒光素酶試劑的1.5mL離心管中，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中進(jìn)行檢測(cè)，作為背景信號(hào)；然后，將10μLATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入有100μL熒光素/熒光素酶試劑的1.5mL離心管中，立刻將該離心管放到化學(xué)發(fā)光分析儀中進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與討論

2.1化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系的建立

魯米諾（3-氨基鄰苯二甲酰肼）是最常見的化學(xué)發(fā)光試劑之一，具有發(fā)光效率高、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、容易合成、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)；在堿性條件下，魯米諾被氧化劑（如過(guò)氧化氫）氧化后能發(fā)出波長(zhǎng)425nm的藍(lán)光。在不同體系中，魯米諾發(fā)光形式不同：金屬離子-過(guò)氧化氫-魯米諾體系是閃光型發(fā)光；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）-過(guò)氧化氫-魯米諾體系[9-10]是輝光型發(fā)光。HRP-魯米諾體系雖是輝光型發(fā)光，但生物酶的活性很難控制和復(fù)現(xiàn)，不適用于儀器的計(jì)量校準(zhǔn)。本文將8-羥基喹啉（8-Ox）引入魯米諾-過(guò)氧化氫-金屬離子體系中，實(shí)現(xiàn)發(fā)光方式由閃光型到輝光型的轉(zhuǎn)變，建立了發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定的魯米諾-過(guò)氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系。

2.1.1添加8-羥基喹啉

初步實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定輝光型信號(hào)魯米諾在堿性溶液中，與OH-反應(yīng)生成陰離子，該陰離子被某些氧化劑氧化產(chǎn)生氨基鄰苯二甲酸根離子，氧化過(guò)程中產(chǎn)生的化學(xué)能被氨基鄰苯二甲酸根離子吸收，使其處于激發(fā)態(tài)，回到基態(tài)時(shí)發(fā)出波長(zhǎng)為425nm的光，F(xiàn)e（III）可以催化該反應(yīng)過(guò)程，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，而8-羥基喹啉可以與Fe（III）絡(luò)合，從而起到穩(wěn)定劑的作用。不同體系中魯米諾-H2O2的發(fā)光情況，其縱坐標(biāo)為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（RLU）。曲線a說(shuō)明魯米諾與H2O2混合后，被H2O2氧化并發(fā)光，剛開始發(fā)光值緩慢上升，隨著反應(yīng)物的消耗，發(fā)光值開始緩慢下降，發(fā)光形式呈現(xiàn)一個(gè)較平緩的閃光；曲線b說(shuō)明在魯米諾-H2O2體系中加入了Fe（III）之后，加速了魯米諾與H2O2反應(yīng)，因此一開始體系的發(fā)光就達(dá)到了最大值，之后隨著反應(yīng)物的快速消耗，發(fā)光值也急速下降；曲線c說(shuō)明當(dāng)在這個(gè)體系中加入8-羥基喹啉，F(xiàn)e（III）與其絡(luò)合，保證了在堿性條件下Fe（III）的穩(wěn)定性，使化學(xué)發(fā)光反應(yīng)變成非常平穩(wěn)的輝光型，在100s內(nèi)發(fā)光值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為1.1%。曲線d是沒有Fe（III）的空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2.1.2優(yōu)化反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

為獲得穩(wěn)定且容易操作的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系，選擇了10μL魯米諾工作溶液（摩爾濃度為1×10-3mol/L）和100μL過(guò)氧化氫溶液（體積分?jǐn)?shù)濃度為1%）的基礎(chǔ)上，考察8-羥基喹啉的用量、反應(yīng)體系最終pH和反應(yīng)介質(zhì)3個(gè)方面的因素，最終確定了該化學(xué)發(fā)光體系優(yōu)化濃度比例。

1）8-羥基喹啉的用量對(duì)體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響

隨著向體系中加入8-羥基喹啉工作溶液的增多，體系的發(fā)光值持續(xù)降低，直到當(dāng)加入50μL8-羥基喹啉工作溶液，體系的發(fā)光值不再隨著8-羥基喹啉加入量的增加而降低。在儀器計(jì)量工作中，可以選擇加入50~85μL8-羥基喹啉工作溶液，此時(shí)8-羥基喹啉的體積對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響最小。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇65μL作為優(yōu)化的8-羥基喹啉加入量。

2）反應(yīng)體系最終pH對(duì)體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響

魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)需要OH-的參與，因此體系的pH也是影響發(fā)光值的重要因素之一。當(dāng)pH＞10.0，體系的發(fā)光值會(huì)隨著pH增大而呈指數(shù)增加，體系不容易控制；當(dāng)pH值在8.80~9.60范圍內(nèi)，體系的發(fā)光值增長(zhǎng)比較穩(wěn)定，可以滿足儀器計(jì)量檢定中操作方便的需求。

3）緩沖體系對(duì)體系發(fā)光值穩(wěn)定性的影響

考察了相同濃度的Tris-HCl、H3BO3-KOH、Na2CO3-NaHCO3和B-R緩沖溶液對(duì)魯米諾-過(guò)氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學(xué)發(fā)光體系的影響，發(fā)現(xiàn)Tris-HCl中化學(xué)發(fā)光信號(hào)最為穩(wěn)定，故選擇Tris-HCl緩沖溶液；最終體系定為：加入50μL0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液，pH=9.10。通過(guò)對(duì)8-羥基喹啉的用量、反應(yīng)體系最終pH和反應(yīng)介質(zhì)3個(gè)方面的考查，確定了化學(xué)發(fā)光分析儀計(jì)量用魯米諾-過(guò)氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉體系，其用量分別為：10μL摩爾濃度為1×10-3mol/L魯米諾工作溶液（pH13.0）、100μL體積分?jǐn)?shù)為1%過(guò)氧化氫溶液、65μL摩爾濃度為1×10-3mol/L8-羥基喹啉工作溶液（pH2.0）、和50μL0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH=9.10）。此時(shí)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與Fe（III）的摩爾濃度具有很好的線性關(guān)系。

2.2生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系的建立

在眾多生物發(fā)光體系中，ATP-熒光素-熒光素酶發(fā)光體系應(yīng)用最為廣泛，ATP檢測(cè)也經(jīng)常被業(yè)內(nèi)用于化學(xué)發(fā)光分析儀靈敏度的衡量指標(biāo)。其原理是：熒光素酶在有氧條件下，可以和熒光素結(jié)合后催化ATP轉(zhuǎn)化成AMP（磷酸腺苷），同時(shí)釋放出光子（波長(zhǎng)562nm），發(fā)光效率高，而且發(fā)光強(qiáng)度與ATP含量呈很好的線性關(guān)系。為了統(tǒng)一儀器靈敏度的評(píng)價(jià)方法，我們研制了ATP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并結(jié)合商品化ATP檢測(cè)試劑盒，建立了一套穩(wěn)定可靠的ATP生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系，用于化學(xué)發(fā)光分析儀的計(jì)量校準(zhǔn)。

2.3生物化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系

在儀器計(jì)量校準(zhǔn)中的應(yīng)用最終將化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系和生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系聯(lián)合，共同對(duì)化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行計(jì)量校準(zhǔn)研究，對(duì)儀器的計(jì)量性能進(jìn)行全面的考察：采用魯米諾-過(guò)氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系對(duì)伯托LB962型化學(xué)發(fā)光分析儀的測(cè)量重復(fù)性、交叉污染和線性相關(guān)系數(shù)的計(jì)量特性進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用ATP生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系作為標(biāo)準(zhǔn)光源對(duì)伯托LB962型化學(xué)發(fā)光分析儀的靈敏度的計(jì)量特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.3.1測(cè)量重復(fù)性

以1×10-5mol/LFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)測(cè)量6次，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值分別為302579，298800，321145，299523，338856，356041，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.4%，即為儀器的測(cè)量重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明儀器測(cè)量重復(fù)性較好；同時(shí)也說(shuō)明建立的化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系發(fā)光值穩(wěn)定，完全可以用于儀器測(cè)量重復(fù)性的計(jì)量特性的評(píng)價(jià)。

2.3.2交叉污染測(cè)量中心孔

（樣品位置，1×10-5mol/LFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液）發(fā)光值I0和周圍孔發(fā)光值I0i，如表1所示，周圍孔發(fā)光值的平均值與中心孔發(fā)光值之比的百分?jǐn)?shù)即為化學(xué)發(fā)光分析儀的交叉污染。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，中心孔的發(fā)光對(duì)周圍孔發(fā)光影響很小，儀器的交叉污染僅為0.02%，與儀器的出廠指標(biāo)無(wú)明顯差異；同時(shí)證明了我們建立的化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系可以用來(lái)評(píng)價(jià)儀器的交叉污染的計(jì)量特性。

2.3.3線性相關(guān)系

數(shù)采用化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系對(duì)0，1×10-6，3×10-6，1×10-5，3×10-5，1×10-4mol/LFe（III）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)量，考察儀器測(cè)量線性相關(guān)系數(shù)，以檢測(cè)發(fā)光值信號(hào)減去本底信號(hào)得到的相對(duì)發(fā)光值ΔI為縱坐標(biāo)（本底信號(hào)為Fe（III）摩爾濃度為0時(shí)的發(fā)光值），F(xiàn)e（III）的摩爾濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，F(xiàn)e（III）在1×10-6~1×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系：ΔI=2×1010C-22396，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9986。使用ATP生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒對(duì)0，1×10-11，1×10-10，1×10-9，1×10-8，1×10-7mol/LATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，考察儀器測(cè)量線性相關(guān)系數(shù)，以相對(duì)發(fā)光值Δ（IΔI為檢測(cè)發(fā)光值信號(hào)減去本底信號(hào)，本底信號(hào)為ATP濃度為0時(shí)的發(fā)光值）為縱坐標(biāo)，ATP的摩爾濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ATP在1×10-11~1×10-7mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系：ΔI=7×1012C+550，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9999。采用化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系和生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)反應(yīng)體系評(píng)價(jià)儀器的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9986和0.9999，說(shuō)明儀器的線性相關(guān)系數(shù)的性能指標(biāo)較好；這兩種反應(yīng)體系均能評(píng)價(jià)儀器的線性相關(guān)系數(shù)的計(jì)量特性。

2.3.4靈敏度使用

ATP生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒對(duì)空白溶液的本底信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，平行檢測(cè)11次，本底信號(hào)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度分別為29，34，32，34，40，47，37，42，34，39，32，計(jì)算檢出限（3×S/N）為2.24×10-16molATP（100μL樣品體積），即為化學(xué)發(fā)光分析儀的靈敏度，達(dá)到儀器的出廠指標(biāo)，說(shuō)明ATP生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系可以用來(lái)評(píng)價(jià)儀器的靈敏度的計(jì)量特性，統(tǒng)一了化學(xué)發(fā)光分析儀靈敏度的表示方法。

3結(jié)束語(yǔ)

本文模擬化學(xué)發(fā)光分析儀的實(shí)際工作狀態(tài)，建立了可溯源的魯米諾-過(guò)氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系和ATP-熒光素-熒光素酶生物發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)體系，并將這兩種標(biāo)準(zhǔn)體系聯(lián)合，應(yīng)用到化學(xué)發(fā)光分析儀的計(jì)量校準(zhǔn)工作中，對(duì)儀器測(cè)量重復(fù)性、交叉污染、線性相關(guān)系數(shù)和靈敏度計(jì)量特性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)現(xiàn)了對(duì)化學(xué)發(fā)光分析儀計(jì)量性能的全面考察，為化學(xué)發(fā)光分析儀日常的校準(zhǔn)工作以及國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范的制訂提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

作者：李蘭英徐勤許麗聞艷麗武利慶任淑貞劉剛單位：上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院