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摘要：目的：研究唑來膦酸（Zoledronateacid）和異戊烯焦磷酸（IPP）體外擴(kuò)增前列腺癌患者外周血中γδT細(xì)胞的效率。方法：密度梯度離心法分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），分別加入5．0μmol／LZol或10．0μg／mlIPP聯(lián)合1000IU／ml的rhIL－2于含10％自體血漿的AIM－V培養(yǎng)體系培養(yǎng)，觀察并收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)刺激后CD3＋Vγ9＋的γδT細(xì)胞數(shù)量和比例，并計(jì)算其擴(kuò)增效率。結(jié)果：經(jīng)14天擴(kuò)增培養(yǎng)后，兩種磷酸抗原均能在體外擴(kuò)增前列腺癌患者外周血中的γδT細(xì)胞，Zol組的γδT細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中最高含量達(dá)64．7％，IPP組最高達(dá)55．9％，且擴(kuò)增培養(yǎng)至第9天的γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷活性，但Zol組的擴(kuò)增效率以及細(xì)胞的殺傷活性均明顯強(qiáng)于IPP組（P＜0．05）。結(jié)論：Zol具有與IPP體外擴(kuò)增外周血中γδT細(xì)胞的能力，Zol刺激法可能成為體外擴(kuò)增前列腺癌患者外周血中γδT細(xì)胞更為經(jīng)濟(jì)安全的選擇。

關(guān)鍵詞：前列腺癌；γδT細(xì)胞；唑來膦酸；異戊烯焦磷酸

γδT細(xì)胞是其T細(xì)胞受體（Tcellreceptor，TCR）由γ鏈和δ鏈構(gòu)成的一類具有獨(dú)特生物學(xué)特征的T淋巴細(xì)胞亞群［1，2］，它能迅速識(shí)別外源性病原體和內(nèi)源性應(yīng)激誘導(dǎo)的配體并啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，故γδT細(xì)胞被視為人體免疫防御和免疫監(jiān)視的第一道重要防線［3］。γδT細(xì)胞兼具T輔助細(xì)胞（Th）和細(xì)胞毒T細(xì)胞的雙重細(xì)胞效應(yīng)，當(dāng)其發(fā)揮作用后，可通過自身抗原遞呈細(xì)胞（APC）樣效應(yīng)或通過所分泌的細(xì)胞因子效應(yīng)進(jìn)一步誘導(dǎo)或促進(jìn)特異性T細(xì)胞應(yīng)答［4－6］。因而γδT細(xì)胞被認(rèn)為可能是介于獲得性免疫與天然免疫之間的特殊免疫細(xì)胞類型，具有抗原特異性識(shí)別功能而無MHC限制，并在機(jī)體抗感染和自身免疫疾病及抗腫瘤等過程中起重要作用［3，7］。但γδT細(xì)胞在人外周血中的含量僅0．5％～10％左右，因此如何有效擴(kuò)增腫瘤患者外周血中γδT細(xì)胞是其應(yīng)用于臨床治療的先決條件。磷酸抗原體外特異性擴(kuò)增健康人外周血中的γδT細(xì)胞能力已經(jīng)得到反復(fù)證實(shí)，其中報(bào)道比較多的是異戊烯焦磷酸（IPP）對(duì)γδT細(xì)胞的擴(kuò)增方法［8，9］，IPP體外刺激擴(kuò)增效率的確有效，但其價(jià)格較昂貴，且對(duì)細(xì)胞毒性較大，不利于臨床推廣應(yīng)用，近期有文獻(xiàn)報(bào)道將骨質(zhì)疏松的治療藥物唑來磷酸（Zoledronateacid，Zol）用于體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞也取得了良好的效果［10，11］。為了建立一種經(jīng)濟(jì)有效、安全簡(jiǎn)便體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究兩種磷酸抗原Zol和IPP在體外對(duì)前列腺癌患者外周血中的γδT細(xì)胞特異性的擴(kuò)增能力和方法。

1材料與方法

1．1標(biāo)本來源本試驗(yàn)所采用前列腺癌患者外周血來自深圳市人民醫(yī)院。

1．2主要儀器與試劑AIM－VCTSTM培養(yǎng)基購自Gibco公司（GrandIsland，NY，USA），重組人白細(xì)胞介素2（rhIL－2）購自雙鷺?biāo)帢I(yè)；淋巴細(xì)胞分離液購自NycomedPharma公司（NycomedPharmaAS，Oslo，Norway），唑來磷酸注射液購自諾華公司，IPP購自Sigma公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗Vγ9（Vγ9－FITC）、PE標(biāo)記的CD4（CD4－PE）、PerCP標(biāo)記的CD3（CD3－PerCP）、APC－H7標(biāo)記的CD8（CD8－APC－H7）單克隆抗體均購自BD／Pharmingen公司，流式細(xì)胞分析儀為FACSCantoⅡ（美國BD），分析軟件為BDCellQuest。

1．3方法

1．3．1細(xì)胞培養(yǎng)抽取前列腺癌患者的靜脈外周血至含有肝素鈉的離心管中，離心獲得血清和全血細(xì)胞，將全血細(xì)胞經(jīng)密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。收集的PBMC重懸于含10％自體滅活血漿的AIM－VCTSTM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度（1～2）×106／ml左右，加入不同濃度的Zol和IPP，每組3個(gè)重復(fù)，并加入rhIL－2至終濃度1000IU／ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)于37℃，5％CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。1．3．2γδT細(xì)胞表型分析取加不同濃度的磷酸抗原因子誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞，1000r／min離心5min后用1×PBS洗1次，在1500r／min下離心5min，調(diào)整細(xì)胞數(shù)大約（5～10）×105每管每100μl，加Vγ9－FITC，CD4－PE，CD3－PerCP，CD8－APC－H7各2μl，吹勻，避光孵育20min，PBS洗1次，最后以PBS400μl重懸，上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)磷酸抗原誘導(dǎo)前后γδT細(xì)胞的比例，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果使用BDCellQuest軟件進(jìn)行分析。

1．3．3γδT細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)以CellCountingKit－8測(cè)定γδT細(xì)胞殺傷活性，以前列腺癌DU145細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按效靶細(xì)胞比5∶1、10∶1、20∶1的比例加入培養(yǎng)至第9天的γδT細(xì)胞，37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中過夜，加入20μl／孔的CCK－8在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度（A）值。殺傷率（％）＝1－［（實(shí)驗(yàn)組OD值－單獨(dú)的效應(yīng)細(xì)胞組OD值）］／單獨(dú)的靶細(xì)胞組OD值×100％。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用GraphPadPrism6統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以珋x±s表示，組間比較采用t－test，檢驗(yàn)分析P＜0．05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1Zol／IPP刺激γδT細(xì)胞的增殖效率比較經(jīng)磷酸抗原聯(lián)合rhIL－2刺激前列腺癌患者外周血PBMCs第三天開始可見細(xì)胞成集落生長，與IPP相比，經(jīng)Zol刺激擴(kuò)增γδT細(xì)胞生長狀態(tài)較好，且集落多，大（圖1）。細(xì)胞培養(yǎng)至第5天開始γδT細(xì)胞增殖成對(duì)數(shù)生長，利用不同磷酸抗原刺激γδT細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)至14天后，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定其γδT細(xì)胞的增殖情況（圖2），結(jié)果顯示在培養(yǎng)的前五天，二者刺激擴(kuò)增的γδT細(xì)胞增殖效果相當(dāng)，但在培養(yǎng)至第5天后，Zol刺激γδT細(xì)胞的增殖效率明顯高于IPP組，且在第九天時(shí)γδT細(xì)胞含量最高，Zol組最高達(dá)64．7％，IPP組最高達(dá)55．9％（P＜0．05）。

2．2Zol／IPP刺激γδT細(xì)胞的殺傷活性比較以前列腺癌Du145細(xì)胞作為靶細(xì)胞，取培養(yǎng)至第9天的γδT細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，按效靶比為5∶1，10∶1，20∶1混合，比較Zol和IPP刺激培養(yǎng)的γδT細(xì)胞對(duì)前列腺癌Du145細(xì)胞株殺傷活性（圖3）。如圖所示，在同一效靶比下，Zol組刺激擴(kuò)增得到的γδT細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷能力明顯強(qiáng)于IPP組，在效靶比20∶1下，Zol組γδT細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷率達(dá)到45．9％，IPP組γδT細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷率為33．5％（P＜0．05）。圖3Zol／IPP刺激擴(kuò)增的γδT細(xì)胞對(duì)DU145細(xì)胞毒活性檢測(cè)（P＜0．05）Fig．3CytotoxiceffectsofγδTcellsstimulatedbyZol／IPPtoDU145tumorcells（P＜0．05）

2．3Zol／IPP對(duì)γδT細(xì)胞增殖效應(yīng)的動(dòng)態(tài)觀察為了更充分地了解Zol／IPP擴(kuò)增γδT細(xì)胞的動(dòng)態(tài)進(jìn)程，從第5天開始到第14天，每2天收集培養(yǎng)的細(xì)胞，測(cè)定其增殖情況并計(jì)算增殖倍數(shù)（圖4）。如圖所示，Zol／IPP聯(lián)合rhIL－2增殖倍數(shù)的峰值均出現(xiàn)在第11天，在培養(yǎng)的前9天中，對(duì)于兩種不同磷酸化合物而言，IPP的刺激效應(yīng)相對(duì)緩慢些，增殖倍數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），但在第9天后，Zol刺激的γδT細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯較IPP組大（P＜0．05）。

3討論

γδT細(xì)胞是體內(nèi)固有免疫的重要T細(xì)胞群之一，它能迅速識(shí)別TCR信號(hào)和模式識(shí)別受體信號(hào)并做出應(yīng)答，并有研究發(fā)現(xiàn)其具有適應(yīng)性免疫和部分免疫記憶的特點(diǎn)，因而目前認(rèn)為γδT細(xì)胞是固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁，其相關(guān)研究倍受關(guān)注［1］。γδT細(xì)胞能夠直接識(shí)別腫瘤應(yīng)激抗原、磷酸化合物以及熱休克蛋白的同源分子，其中磷酸化合物具有特異性擴(kuò)增活化γδT細(xì)胞的能力已經(jīng)得到反復(fù)證實(shí)［12－14］，如本研究所采用的Zol和IPP都屬于此類物質(zhì)。Zol的化學(xué)成分為氨已基咪唑類雙磷酸，為雙膦酸類藥物，具有抑制破骨細(xì)胞，抑制骨吸收之功效，臨床上被廣泛用于治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥和Paget＇s病，也被用于惡性腫瘤病人骨轉(zhuǎn)移和高鈣血癥的治療。近年的臨床研究表明，相對(duì)于其他患者，接受過Zol治療的腫瘤患者的生存率及腫瘤殺傷率都得到一定提升，其腫瘤患者體內(nèi)的γδT細(xì)胞的數(shù)量有較為明顯的上升［15－16］。目前已有研究者采用Zol代替IPP進(jìn)行γδT細(xì)胞的體外擴(kuò)增［11］。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證唑來磷酸對(duì)γδT細(xì)胞的擴(kuò)增效率，本文研究比較了Zol和IPP兩類磷酸抗原對(duì)前列腺癌患者外周血中γδT細(xì)胞的特異擴(kuò)增能力，篩選確定其最佳的增殖條件，建立穩(wěn)定的體外特異性擴(kuò)增前列腺癌患者外周血中γδT細(xì)胞方法，為日后γδT細(xì)胞的在腫瘤免疫治療應(yīng)用中打下基礎(chǔ)。圖4Zol／IPP刺激前列腺癌患者外周血中γδT細(xì)胞增殖倍數(shù)Fig．4AmplificationfoldsofγδTcellsstimulatedbyZol／IPPonprostatecancerpatient本研究重點(diǎn)對(duì)Zol聯(lián)合rhIL－2刺激前列腺癌患者外周血中的γδT細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行了研究，并與IPP聯(lián)合rhIL－2刺激培養(yǎng)法進(jìn)行了比較，研究結(jié)果顯示，Zol和IPP均能在體外有效的擴(kuò)增前列腺癌患者外周血中的γδT細(xì)胞，兩者對(duì)γδT細(xì)胞的趨勢(shì)是一致的，均在刺激的第11天達(dá)到其擴(kuò)增高峰，且擴(kuò)增培養(yǎng)至第9天的γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞都有一定的殺傷活性。但從整個(gè)培養(yǎng)體系來看，Zol作為磷酸抗原刺激γδT細(xì)胞時(shí)，其擴(kuò)增效率以及擴(kuò)增倍數(shù)都明顯較IPP好，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性亦較IPP組強(qiáng)。綜上所述，不管是采用Zol還是IPP作磷酸抗原時(shí)，都能在體外有效擴(kuò)增前列腺癌患者外周血中γδT細(xì)胞。但Zol相對(duì)于IPP來說價(jià)格低廉，毒性小，而且Zol作為一種注射液應(yīng)用的用藥，比IPP更為安全的優(yōu)勢(shì)，故我們認(rèn)為，在體外磷酸化合物Zol作為γδT細(xì)胞的擴(kuò)增刺激劑，特別是對(duì)以γδT細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療方面，其應(yīng)用前景可能更為廣闊。

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作者：郭吉楠1，房杰群1，袁也晴1，楊江根1，鄒暢2，趙盼2，肖克峰1