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摘要】目的肺炎衣原體抗體(Cpn-PcAb)的制備及。用10μlCpn菌株TW-183(2×108ifu)與300μl福氏完全佐劑混勻后皮下多點(diǎn)注射新西蘭白兔。雙向瓊脂擴(kuò)散法鑒定血清抗體的效價(jià)為1∶64，用硫酸銨鹽析法、DEAE-Sephadex-50層析法純化免疫球蛋白(IgG)，然后用異硫氰酸熒光素(FITG)標(biāo)記IgG。用Cpn-PcAb與美國(guó)進(jìn)口Cpn-單抗(Cpn-McAb)同時(shí)檢測(cè)病人外周血標(biāo)本294例。另外，分別從Cpn-PcAb檢測(cè)出Cpn特異性抗原陽性的外周血單核細(xì)胞(PBMC)標(biāo)本(A組)中和對(duì)照組(B組)中隨機(jī)各挑選20例，用PCR檢測(cè)PBMC中的Cpn-DNA。結(jié)果Cpn-PcAb檢測(cè)的陽性率為45.9%(135/294)，Cpn-McAb檢測(cè)的陽性率為43.5%(128/294)，兩種抗體同時(shí)陽性的標(biāo)本有110例，Kappa值是0?7，根據(jù)其判斷標(biāo)準(zhǔn)提示兩者有較高的一致性。A、B兩組Cpn-DNA陽性標(biāo)本分別為17例和3例。結(jié)論Cpn抗體幾乎和Cpn單抗一樣有較高的特異性和敏感性，可能可以替代進(jìn)口單抗用于臨床Cpn感染的檢測(cè)，有助于相關(guān)疾病的診治。

【關(guān)鍵詞】肺炎衣原體多克隆抗體肺炎衣原體單克隆抗體微量免疫熒光外周血單核細(xì)胞

Productionandapplicationofpolyclonalantibodytochlamydiapneumoniae

【Abstract】ObjectiveProductionandapplicationofpolyclonalantibodytochlamydiapneumoniae(Cpn).MethodsNewZealandwhiterabbitwassubcutaneouslyinjectedwith10μlCpnstrainTW-183(2×108ifu)and300μlcompleteFreundadjuvant.Theserumantibodytiterof1∶64wasidentifiedbytwodimensionalimmunodiffusiontest.IgGwasextractedfromserumandpurifiedbyammoniumsulphatesaltingoutandDEAE-SephadexA-50chromatography，thenwaslabeledbyfluoresceinisothiacyanate.InordertoevaluteCpn-PcAb，thebloodspecimensof294patientsweredeectedbyCpn-PcAbandCpnmonoclonalantibody(Cpn-PcAb)fromUSAatthesametime.Ontheotherhand，werandomlyselected20peripheralbloodmononuclearcell(PBMC)specimenswithCpnantigenpositive(groupA)and20oneswithCpnantigennegative(groupB)byCpn-PcAbdetection，thendetectedCpn-DNAinPBMCbyPCR.ResultsThepositiveratewas45.9%(135/294)forCpn-PcAband43.5%(128/294)forCpn-McAb，and110caseshavethesamepositiveforthem，showingthehighconcordancebetweenthem(Kappa=0.7).ThespecimensofpositiveCpn-DNAwerein17and3respectivelybetweengroupAandgroupB.ConclusionTheCpn-PcAbhasalmostthesamehighspecificityandsensitivityasCpn-McAb.TheCpn-PcAbmaybereplaceCpn-McAbtodetecttheCpnspecificantigenandbehelpfultodiagnoseandtreattheclinicaldiseasesassociatedwithCpninfection.

【Keywords】polyclonalantibodytochlamydiapneumoniae(Cpn-PcAb)monoclonalantibodytoCpn(Cpn-McAb)micro-immunofluorescenceperipheralbloodmononuclearcell

肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae，Cpn)是嗜衣原體(Chlamydohilapneumoniae)屬下的一個(gè)種，是一種常見的呼吸道病原體，帶菌者和隱性感染者非常普遍［1，2］。近年來在多種系統(tǒng)疾病患者血清中檢出的Cpn-抗體均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組［3］，如心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病等，因此Cpn已成為危害人類健康的一種病原體，尤其是它在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)形成過程中的作用日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。Cpn感染和AS之間的關(guān)系已為血清流行病學(xué)、病和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)所證實(shí)［4］。筆者亦建立了外周血單個(gè)核細(xì)胞中Cpn-抗原的檢測(cè)方法［5］，并用于臨床檢測(cè)，為臨床相關(guān)疾病的診治提供可靠依據(jù)。但是，檢測(cè)Cpn-抗原所用的單抗主要依賴進(jìn)口，為此筆者嘗試用家兔自制抗Cpn抗體，并已獲得成功，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1兔抗肺炎衣原體抗體的制備用10μlCpn菌株TW-183(2×108ifu)與300μl福氏完全佐劑混勻后皮下多點(diǎn)注射新西蘭白兔(NewZealandwhite，NZW)，在第14、28和42天，用10μlCpn菌株與300μl福氏不完全佐劑混勻后皮下多點(diǎn)注射NZW，用雙向瓊脂擴(kuò)散法鑒定其抗血清效價(jià)＞(1∶64)后，頸動(dòng)脈插管放血55ml，分離出血清25ml，用硫酸銨鹽析法、DEAE-Sephadex-50層析法逐步純化兔免疫球蛋白(IgG)，用考馬氏亮藍(lán)法測(cè)其蛋白含量為3.45mg/ml。

1.2肺炎衣原體抗體熒光素結(jié)合物的制備將純化的IgG抗體用pH9～9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜，配制異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiacyanate，F(xiàn)ITC)二甲亞砜(DMSO)溶液，使終濃度為1mgFITC/1mlDMSO。按50μgFITC/1mgIgG比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中。標(biāo)記物用pH9～9.5碳酸鹽緩沖液加至2.5ml，再將其裝入透析袋，并放在預(yù)冷4℃的碳酸鹽緩沖液中，于4℃暗處磁力攪拌過夜。然后用PBS于4℃暗處透析5次，以除去游離的FITC，直至透析外液與參比溶液PBS在495nm處吸光度一樣。FITC標(biāo)記物分別在276nm和493nm測(cè)定光密度，然后根據(jù)圖算出熒光素(F)與蛋白(P)mol比值，合適的F/P比值為2～4。

1.3Cpn-PcAb與Cpn-McAb同時(shí)檢測(cè)標(biāo)本復(fù)旦大學(xué)附屬金山住院患者共294例，其中冠心病、高血壓、心肌梗死、糖尿病等患者109例，肺炎、支氣管炎、哮喘、肺氣腫等患者135例，慢性鼻炎、鼻息肉、鼻竇炎、咽喉炎、扁桃體炎等患者50例。常規(guī)無菌采集靜脈血3ml，EDTA抗凝。外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離參照Moazed等［6］方法略加修改：抗凝血2000rpm離心5min，吸出血漿后的余血用等體積PBS稀釋混勻，再緩慢加到含有3ml淋巴細(xì)胞分離液試管中，然后于室溫2200rpm離心30min，吸出含有PBMC的中間云霧狀層，用PBS洗至不含紅細(xì)胞后，懸浮于PBS中，使其約含PBMC5×106個(gè)。PBMC中Cpn-抗原的檢測(cè)參照Timms等［7］方法略加改進(jìn)：吸取新鮮制備的PBMC懸浮液10μl(約含PBMC6×105個(gè))分別在載玻片上涂出2個(gè)直徑4～5mm的圓點(diǎn)，電吹風(fēng)吹干后丙酮固定3次。其中一個(gè)圓點(diǎn)作為空白對(duì)照，另一個(gè)圓點(diǎn)加上5μlCpn-McAb(FITC-TT-401)稀釋液(工作濃度1∶40，即5μlFITC-TT-401原液+195μl0.01%伊文氏藍(lán)PBS)，置濕盒于37℃溫育1h，PBS洗3次，每次3min，再用蒸餾水洗3次，電吹風(fēng)吹干。同時(shí)用自制FITC-Cpn-PcAb進(jìn)行平行操作。然后將載玻片置熒光顯微鏡下(HB0200汞燈，第一濾片：BG-12，第二濾片：CG-13和WILD8075)由2人觀察并核對(duì)大小均勻的特征性蘋果綠亮點(diǎn)。測(cè)定圓點(diǎn)內(nèi)的熒光亮點(diǎn)數(shù)減去空白圓點(diǎn)內(nèi)的熒光亮點(diǎn)數(shù)后的差數(shù)，作為特異性抗原陽性的依據(jù)。陽性對(duì)照：Cpn菌株(TW-185)牛奶稀釋液作為抗原，以PBS為陰性對(duì)照。抗原陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Muhlestain等［8］的標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)陽性(＞100個(gè)亮點(diǎn)/原點(diǎn))，陽性(10～100個(gè)亮點(diǎn)/原點(diǎn))，陰性(＜10個(gè)亮點(diǎn)/原點(diǎn))。

1.4PCR法檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中Cpn-DNA按筆者已發(fā)表的方法進(jìn)行［9］。1.5%凝膠于5V/cm下電泳1h，在紫外燈下觀察結(jié)果，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為474bp。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.5.1采用χ2檢測(cè)法P＜0.05為差異有顯著性。

1.5.2采用Kappa值判斷兩種方法的一致性強(qiáng)度Kappa值在0.61～0.80，一致性強(qiáng)度屬于高度。

2結(jié)果

2.1Cpn抗體效價(jià)和交叉反應(yīng)鑒定應(yīng)用進(jìn)口可溶性Cpn-脂多糖(LPS)來鑒定，瓊脂糖雙向免疫擴(kuò)散結(jié)果表明，Cpn抗體效價(jià)為1∶64。Cpn抗體與沙眼衣原體-LPS抗原無交叉反應(yīng)。

2.2Cpn抗體與進(jìn)口單抗同時(shí)檢測(cè)PBMC中Cpn-抗原294例PBMC標(biāo)本中Cpn-McAb檢出Cpn特異性抗原陽性128例，陰性166例；而Cpn-PcAb檢出的陽性標(biāo)本135例，陰性159例，二者之間差異無顯著性(P＞0.05)，見表1。

表1Cpn抗體與進(jìn)口單抗檢測(cè)PBMC中Cpn-抗原的結(jié)果比較(例)

2.3Cpn-PcAb檢測(cè)PBMC中Cpn-抗原評(píng)估Cpn-PcAb與Cpn-McAb同時(shí)檢出PBMC中Cpn-抗原陽性的標(biāo)本有110例，而PBMC中Cpn-抗原陰性的標(biāo)本為141例，Kappa值是0.7，根據(jù)其判斷標(biāo)準(zhǔn)表明：Cpn-PcAb與Cpn-McAb檢測(cè)結(jié)果的一致性強(qiáng)度屬于高度，見表2。

表2Cpn抗體檢測(cè)PBMC中Cpn-抗原方法評(píng)價(jià)(例)

2.4PCR法檢測(cè)外PBMC中Cpn-DNA結(jié)果20例用Cpn-PcAb經(jīng)直接微量免疫熒光(DI)法檢測(cè)出Cpn-抗原陽性的PBMC標(biāo)本中，用PCR法從17例PBMC中檢測(cè)到Cpn-DNA；20例用Cpn-PcAb經(jīng)DI法檢測(cè)Cpn-抗原陰性的PBMC標(biāo)本中，用PCR法從3例PBMC中檢測(cè)到Cpn-DNA?？梢娮灾艭pn-PcAb有較好的敏感性和特異性，見表3。

表3PCR法和DI法檢測(cè)PBMC結(jié)果比較(例)

3討論

近年來根據(jù)流行病調(diào)查，發(fā)現(xiàn)多種系統(tǒng)疾病都與Cpn感染有關(guān)。國(guó)外已成功分離出Cpn菌株-183、AR-39、AR-59、AR-458、LR-65等，而且有Cpn活菌和單抗出售，并用阿齊霉素進(jìn)行較大規(guī)模的臨床干預(yù)試驗(yàn)［10］。國(guó)內(nèi)有學(xué)者就冠心病患者做了有關(guān)Cpn感染的流行病學(xué)調(diào)查［11］，建立了家兔Cpn感染和動(dòng)脈粥樣硬化模型［9］。，臨床診斷Cpn感染的依據(jù)主要依靠抗體的檢測(cè)，但是Cpn抗體的檢出只能說明該個(gè)體感染過Cpn，卻不能反映體內(nèi)是否仍有Cpn活菌存在。而Cpn特異性抗原的檢測(cè)能直接反映該個(gè)體內(nèi)有無Cpn活菌的存在［12］，為此筆者已建立了PBMC中Cpn-抗原的檢測(cè)方法［5］，并用于臨床檢測(cè)，為臨床相關(guān)疾病的診治提供可靠依據(jù)。但檢測(cè)Cpn-抗原所用的Cpn單抗目前尚依賴進(jìn)口，不僅手續(xù)麻煩，且價(jià)格昂貴。為此，我們采用Cpn菌株感染新西蘭白兔，成功地獲得純度較高的家兔抗Cpn-抗體。為了測(cè)定其特異性和敏感性，我們用進(jìn)口單抗(FITC-TT-401)與自制的FITC-Cpn)抗體同時(shí)檢測(cè)294例PBMC中Cpn特異性抗原，陽性標(biāo)本分別為128例和135例(見表1)，同時(shí)都為陽性的有110例，同時(shí)都為陰性的有141例，Kappa值為0.7(見表2)，根據(jù)Kappa值判斷標(biāo)準(zhǔn)提示自制的Cpn抗體與進(jìn)口單抗的檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性。

另外，我們隨機(jī)挑選了20例用Cpn抗體經(jīng)DI法檢測(cè)Cpn特異性抗原陽性和20例陰性的PBMC標(biāo)本，用PCR法檢測(cè)Cpn-DNA。結(jié)果顯示陽性組有17例，陰性組有3例檢測(cè)到Cpn-DNA(見表3)。由此表明，自制的Cpn抗體特異性較好、敏感性較高，可能可以替代進(jìn)口單抗用于臨床Cpn-抗原的檢測(cè)，有助于Cpn感染相關(guān)疾病的診治，而且為進(jìn)一步制備Cpn單克隆抗體提供了經(jīng)驗(yàn)。

【】

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