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1材料與方法

1.1實驗動物

普通級新西蘭白兔，3～4月齡，體重2.5～3.0kg，購自哈藥集團(tuán)制藥總廠動物實驗中心，動物合格證號：SCXK（黑）2011-005；商品蛋雞購自黑龍江省大慶市禽蛋公司養(yǎng)雞場。

1.2菌株及質(zhì)粒

主要試劑T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、PfxplatinumDNA聚合酶、DNAmarker、AgaroseGelDNAExtractionKit、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖屑暗拖鄬Ψ肿淤|(zhì)量蛋白質(zhì)marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；X-gal和IPTG購自武漢華美生物工程有限公司；EcoRⅠ、SalⅠ、牛血清蛋白、Giemsa染色液、酵母提取物和胰蛋白胨購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；兔抗MSP1α和MSP1β多克隆抗體由本院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室自制；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自，INC公司；FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG購自上海華壹生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.5MSP1α和MSP1β基因的擴增按細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增MSP1α和MSP1β基因。MSP1α基因反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃1min，55℃1min，68℃1min，共30個循環(huán)；68℃延伸7min。MSP1β基因反應(yīng)條件除將退火溫度升高至63℃，其他同上。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2重組表達(dá)

將鑒定正確的陽性質(zhì)粒和pGEX-6p-1分別經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，回收目的基因片段及載體片段，經(jīng)T4DNA連接酶14℃連接2h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21（DE3），挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β。目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)將測序正確的重組菌和空載體轉(zhuǎn)化菌各100μl接種于4ml含100μg／mlAmp+抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；分別取50μl新鮮菌液，轉(zhuǎn)接至50ml含40μg／LAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200r／min振蕩培養(yǎng)，至菌體A600值為0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度為1mmol／L，200r／min振蕩培養(yǎng)，分別于3、4、5和6h收集1.5ml菌液，冰浴超聲破碎，10000×g離心10min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

3表達(dá)產(chǎn)物的純化及鑒定

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，將目的蛋白切膠后收集至透析袋中，120V水平電泳1h，待膠透明后，取出置PBS緩沖液中，4℃透析過夜，收集液體，用超濾離心管進(jìn)行濃縮。取30μg純化的蛋白，電轉(zhuǎn)膜后，置5%脫脂奶粉室溫封閉1h；分別加入兔抗MSP1α和MSP1β多克隆抗體（均1∶100稀釋），37℃孵育1h；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5000稀釋），37℃孵育1h；DAB法顯色，蒸餾水洗滌，終止反應(yīng)。重組蛋白多克隆抗體的制備用2只新西蘭白兔進(jìn)行高免血清的制備，用2只商品蛋雞進(jìn)行抗MSP1α和MSP1βIgY抗體的制備。將純化的重組蛋白100μg加等體積的完全弗氏佐劑進(jìn)行初免，將純化的重組蛋白100μg加等體積的不完全弗氏佐劑進(jìn)行2、3次免疫，每次免疫間隔14d。白兔經(jīng)皮下注射接種，雞經(jīng)肌肉注射接種。在末次免疫5d后，經(jīng)白兔耳緣靜脈采血，分離血清，進(jìn)行Westernblot鑒定，具體操作同1.8項。商品蛋雞從免疫前1周至末次免疫后2周，每日收集雞蛋，采用聚乙二醇沉淀法提取雞蛋中IgY抗體：將卵黃從卵清中分離出來，取10ml卵黃，加入100ml磷酸鈉鹽緩沖，再加入5ml氯仿，至有半固體狀物質(zhì)出現(xiàn)后，10000×g離心，收集上清，加至5ml聚乙二醇中，10000×g離心，收集沉淀，重懸于磷酸鈉鹽緩沖液中，置-20℃保存?zhèn)溆谩?和MSP1β蛋白在大腸埃希菌外膜表達(dá)的檢測采用間接熒光免疫法。取誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌，經(jīng)PBS（pH7.2）洗滌后，涂布固定至載玻片上，用含1%BSA的PBS37℃封閉60s；在分離的IgY抗體中孵育60s；PBS洗滌，加入FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG（1∶1000稀釋），37℃孵育30s；PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察，視野中呈現(xiàn)黃綠色熒光判為陽性。1.11MSP1α和MSP1β蛋白對牛紅細(xì)胞黏附作用的檢測用于血凝試驗和血凝抑制試的血液采自經(jīng)PCR方法檢測A.marginale陰性的牛（來自黑龍江某集約化牛場）。抗凝血經(jīng)PBS洗滌5次后，置含1%戊二醛的PBS中，4℃固定12h后，置含1.5mol／L疊氮化合物的PBS中備用；將約5×107個／ml的紅細(xì)胞加至約2×109個重組表達(dá)菌中，進(jìn)行HA試驗，混勻，37℃振蕩溫育30min；PBS洗滌，重懸于等體積PBS，制作血細(xì)胞涂片，甲醇中固定15min，進(jìn)行Giemsa染色，紅細(xì)胞凝集百分?jǐn)?shù)通過對吸附到紅細(xì)胞上的細(xì)菌計數(shù)來確定。取免疫后分離的IgY抗體0.5ml，分別加至約2×109個誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌中進(jìn)行HI試驗，制備稀釋度為1∶2、1∶3和1∶5的IgY抗體，37℃溫育30min；將約5×107個紅細(xì)胞加至含1.5mol／L疊氮化合物的PBS中，37℃溫育30min；PBS洗滌，重懸于等體積PBS，制作血細(xì)胞涂片并計算紅細(xì)胞凝集百分?jǐn)?shù)。

作者：倪宏波錢愛東姜海芳單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)