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【摘要】目的檢測新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemicencephalopathy,HIE)患兒紅細胞內(nèi)外鈣濃度及紅細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性,研究所檢測指標(biāo)與腦損傷程度之間的關(guān)系,并探討出現(xiàn)低鈣血癥時能否鈣劑治療,從而最大限度地提高HIE的療效,減少死亡和傷殘。方法采用流式細胞儀測定86例不同程度新生兒缺氧缺血性腦病患者紅細胞內(nèi)Ca2+濃度,以I-STAT1-Analyzer測定血漿游離鈣,以化學(xué)比色法測定紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性;以30例足月新生兒作為對照組,均為羊水吸入和咽下綜合征患者。將HIE組中部分患兒再分為補充鈣劑組與未補充鈣劑組,當(dāng)補充鈣劑療程結(jié)束后再次檢測各組相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果HIE急性期血漿游離鈣濃度水平均明顯低于對照組,(P<0.05),紅細胞內(nèi)Ca2+濃度水平均明顯高于對照組(P<0.05),紅細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯低于對照組(P<0.05);這些指標(biāo)的變化與腦損傷的嚴(yán)重程度相關(guān);在補充鈣劑后紅細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性及紅細胞內(nèi)Ca2+濃度均與未補充鈣劑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而血漿游離鈣濃度較未補鈣組顯著升高(P<0.05)。結(jié)論HIE時紅細胞內(nèi)鈣超載,血漿游離鈣降低,且紅細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低;補充鈣劑后紅細胞內(nèi)游離鈣濃度并未明顯上升,故而HIE時對有低鈣血癥臨床表現(xiàn)的患兒補充鈣劑是可行的,但本研究并未解決補充鈣劑后是否會延長細胞內(nèi)鈣超載的持續(xù)時間,因此提出以短期應(yīng)用為妥,一旦臨床表現(xiàn)緩解即可停止補充,血漿游離鈣僅做為參考。

【關(guān)鍵詞】新生兒;缺氧缺血性腦病;紅細胞內(nèi)外鈣濃度;紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性

【Abstract】ObjectiveToresearchtherelationshipbetweensomedetectiveindicatorsandtheneonatalhypoxic-ischemicencephalopathy(HIE)braininjury,bydetectingtheCa2+concentrationsinsideandoutsideoferythrocytesaswellasCa2+-Mg2+-ATPaseactivityonerythrocytemembranesinchildrenwithHIE.Meanwhile,todiscusswhetherthecalciumtreatmentcouldbeusedinthesituationofhypocalcemiaforthepurposeofimprovingtheeffectofHIEmaximatilyanddecreasingmortalityanddisability.MethodsTheclinicalof86caseswithHIEneonatuswerestudited.86casesofHIEneonatus,wedetectederythrocyteintracellularCa2+concentrationbyflowcytometry,plasmafreecalciumbyI-STAT1-AnalyzeranderythrocytemembranesCa2+-Mg2+-ATPaseactivitybychemicalassay.Asthecontrolgroup,30casesoffullterminfantsweretakenwhowereallinhaledandingestedamnioticfluid.TheHIEgroupwassubdividedintogroupswithandwithoutcalciumsupplement.Theaboveindicatorsweredetectedagainingroupsattheendofcalciumtreatment.

ResultsInHIEacutephase,plasmafreeCa2+concentrationsweresignificantlylowerthanthecontrolgroup(P<0.05),erythrocyteintracellularfreeCa2+concentrationweresignificantlyhigherthanthecontrolgroup(P<0.05),erythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivitywassignificantlylowerthanthecontrolgroup(P<0.05).Thesechangesarerelevantwiththeseverityofbraininjury.Aftercalciumsupplement,erythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivityanderythrocyteintracellularfreeCa2+concentrationswerenosignificantdifferenceswiththatwithoutaddedcalciumgroup(P>0.05),whiletheplasmaconcentrationoffreecalciumwassignificantlyhigher(P<0.05).

ConclusionErythrocyteintracellularcalciumionisoverloaded,plasmafreeCa2+concentrationanderythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivityaredecreasedinHIE.Aftercalciumsupplement,erythrocyteintracellularfreeCa2+concentrationdidnotsignificantlyincrease.calciumsupplementisfeasibleinHIEchildrenwithhypocalcemia.Butthisstudydidnotaddresswhethertheadditionalcalciumwouldextendintracellularcalciumoverloadduration.Therefore,short-termapplicationshouldbeusedaslongastheremissionofclinicalmanifestations.Andplasmafreecalciumisareferenceonly.

【Keywords】

Newborn;Hypoxic-ischemicencephalopathy;Ca2+concentrationinsideandoutsideoferythrocytes;ErythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivity

鈣與新生兒缺氧缺血性腦病的關(guān)系已得到公認,1977年Nicholson第一次提出鈣介導(dǎo)缺氧缺血后神經(jīng)元死亡的學(xué)說[1],1992年Schurr等在體外實驗中發(fā)現(xiàn)Ca2+超載假說最能說明缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)元死亡的機制,其后研究已證實缺氧缺血常引起細胞內(nèi)鈣超載,諸多實驗都證實在缺氧造成的神經(jīng)元損傷時,有細胞內(nèi)的鈣異常蓄積,這種變化比神經(jīng)細胞壞死出現(xiàn)得早,鈣濃度增高的程度也與神經(jīng)細胞壞死的數(shù)量成正比[2],細胞內(nèi)過度升高的鈣離子可觸發(fā)一系列有害的酶反應(yīng)過程,最終導(dǎo)致不可逆的細胞損害被認為是與其細胞受損的中心環(huán)節(jié),是導(dǎo)致細胞凋亡或死亡的“最后共同途徑”。但在細胞內(nèi)鈣超載的同時常伴有血漿游離鈣的降低,而是否應(yīng)該予以補充鈣劑以及如何補充鈣劑一直存在爭議,一般認為HIE患兒的總鈣并不低而只是鈣分布異常,并非真正缺乏,補充鈣劑后細胞外液Ca2+增加有可能造成鈣再次大量內(nèi)流進而造成細胞損傷,因而建議使用鈣通道阻滯劑協(xié)助治療,但目前還沒有證明對HIE安全而有效的鈣通道阻滯劑;亦有研究認為出現(xiàn)驚厥、呼吸障礙等低鈣血癥的癥狀后如不及時予以緩解會進一步加重腦損傷,故建議補充鈣劑。

本文主要研究HIE患兒紅細胞內(nèi)外鈣濃度及紅細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性及其這些指標(biāo)與腦損傷的相關(guān)性,并且進一步研究補充鈣劑后各相關(guān)指標(biāo)變化,從而為HIE出現(xiàn)低鈣血癥時是否能夠補鈣以及如何補鈣尋找依據(jù),以利于最大限度地提高HIE的療效,減少死亡和傷殘。

1對象和方法

1.1研究對象

1.1.1HIE組根據(jù)2004年中華醫(yī)學(xué)會新生兒學(xué)組在長沙最新制定的診斷和分度標(biāo)準(zhǔn)進行診斷和分組[2],均為2006年7月以后在山西省兒童醫(yī)院新生兒科住院的患兒,共82例,其中,男52例,女30例,平均胎齡(39.28±1.54)周,平均年齡(12.67±7.47)h。有感染性疾病、溶血性疾病、先天性疾病的患兒排除在外。

1.1.2對照組選擇同期在新生兒科住院的30例足月早期新生兒作為對照組,均為羊水吸入和咽下綜合征患者。其中,男18例,女12例,均無圍產(chǎn)期窒息史,無感染性疾病、溶血性疾病和先天性疾病,無宮內(nèi)發(fā)育遲緩,其母孕期健康。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,該組新生兒在胎齡、日齡、出生體重等組成上與HIE組差異無顯著性(P>0.05),見表1。

表1

不同程度HIE組患兒和對照組患兒的一般資料

組別例數(shù)年齡(h)胎齡(W)出生體重(kg)

輕度HIE組3011.85±6.6539.05±1.213.63±0.35

中度HIE組3013.19±8.4039.23±1.513.36±0.49

重度HIE組2212.96±8.5839.56±1.063.23±0.65

對照組3015.92±8.6138.30±1.273.39±0.53

F值0.3261.6012.345

P值>0.05>0.05>0.05

1.1.3補鈣組和非補鈣組

HIE組中30例患兒出現(xiàn)低游離鈣血癥同時出現(xiàn)相關(guān)臨床表現(xiàn)(驚厥,呼吸障礙),按照家長意愿補鈣者20例,未補鈣者10例,分別列入補鈣組和非補鈣組。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集86例HIE患兒均于入院當(dāng)天(生后0~3d、急性期)、30例非HIE組于生后0~3d均用真空管(EDTA抗凝)常規(guī)取靜脈血2ml,取血待測;均同時采約120μl動脈血測定血漿游離鈣,且在HIE補充鈣劑組于補充鈣劑3d后、HIE非補鈣組常規(guī)治療3d后,再次以相同的方法采血,測定各組相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2檢測方法采用流式細胞術(shù)檢測紅細胞內(nèi)Ca2+濃度,以I-STAT1-Analyzer測定血漿游離鈣濃度,以化學(xué)比色法檢測紅細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組間均數(shù)的兩兩比較用LSD法。各變量間關(guān)系作直線相關(guān)分析。以P<0.05為差異有顯著性。全部資料均采用SPSS12.0版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1紅細胞內(nèi)游離鈣濃度(見表2)。

表2

HIE各組與對照組紅細胞內(nèi)游離鈣濃度

(相對熒光強度)

組別例數(shù)紅細胞內(nèi)游離鈣濃度(相對熒光強度)

輕度HIE組30114.98±29.25

中度HIE組30320.86±33.61

重度HIE組22443.13±40.12

對照組30106.39±26.65

注:表示與輕度組比較P<0.05;表示與對照組比較P<0.05

2.2血漿游離鈣濃度(見表3)。

表3

HIE各組與對照組血漿游離鈣(mmol/L)

組別例數(shù)血漿游離鈣(mmol/L)

輕度HIE組300.95±0.24

中度HIE組300.76±0.13

重度HIE組220.61±0.11

對照組300.96±0.19

注:表示與輕度組比較P<0.05;表示與對照組比較P<0.05

2.3紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性(見表4)。

表4

HIE各組與對照組紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATP

酶活性(μmolPi/mgprot/hour)

組別例數(shù)紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(μmolPi/mgprot/hour)

輕度HIE組300.70±0.11

中度HIE組300.50±0.11

重度HIE組220.40±0.14

對照組300.65±0.10

注:表示與輕度組比較P<0.05;表示與對照組比較P<0.05

2.4相關(guān)性研究

2.4.1中度和重度HIE組紅細胞內(nèi)游離鈣濃度與紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈負相關(guān),(r=-0.684,r=-0.772,P<0.05)。

2.4.2中度和重度HIE組紅細胞內(nèi)游離鈣濃度與血漿游離鈣呈負相關(guān),(r=-0.574,r=-0.740,P<0.05)。

2.4.3中度和重度HIE組紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與血漿游離鈣呈正相關(guān)(r=0.505,r=0.534,P<0.05)。

2.5補充鈣劑前后紅細胞內(nèi)游離Ca2+濃度比較(見表5)。

表5

補充鈣劑前后紅細胞內(nèi)游離Ca2+濃度(x±s)

組別例數(shù)

熒光強度

補充鈣劑前補充鈣劑后/常規(guī)治療后

HIE補充鈣劑組20366.43±78.36①201.00±60.22②

HIE未補充鈣劑組10374.24±86.45③226.42±79.26④

注:②與①比較t=7.4861P<0.05;③與①比較t=0.2488P>0.05;②與④比較t=0.9806P>0.05

2.6補充鈣劑前后血漿游離鈣(見表6)。

表6

補充鈣劑前后血漿游離鈣(x±smmol/L)

組別例數(shù)

iCa2+(mmol/L)

補充鈣劑前補充鈣劑后/常規(guī)治療后

HIE補充鈣劑組200.62±0.16①0.89±0.12②

HIE未補充鈣劑組100.57±0.14③0.75±0.11④

注:②與①比較t=7.3943P<0.05;③與①比較t=0.8391P>0.05;②與④比較t=3.0928P<0.05

2.7補充鈣劑前后紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性(見表7)。

表7

補充鈣劑前后紅細胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase

活性(x±sμmolPi/mgprot/hour)

組別例數(shù)

Ca2+-Mg2+-ATPase

補充鈣劑前補充鈣劑后/常規(guī)治療后

HIE補充鈣劑組200.20±0.04①0.40±0.06②

HIE未補充鈣劑組100.18±0.07③0.37±0.05④

注:②與①比較方差不齊采用t′檢驗P<0.05;③與①比較方差不齊采用t′檢驗P>0.05;②與④比較方差齊t=1.3595P>0.05

3討論

自90年代以來,新生兒缺氧缺血性腦病一直是國內(nèi)新生兒醫(yī)學(xué)界的研究熱點,但至今對于重癥患兒尚缺乏有效的治療方法。目前鈣與新生兒缺氧缺血性腦病的關(guān)系已經(jīng)得到公認,1977年Nicholson第一次提出鈣介導(dǎo)缺氧缺血后神經(jīng)元死亡的學(xué)說,自此關(guān)于鈣的各方面研究不斷有新的突破[3,4]。

在正常情況下,Ca2+作為細胞內(nèi)信使,幾乎參與一切調(diào)控細胞功能的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,也是參與細胞內(nèi)代謝活動的重要元素,細胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定的維持對于生命活動是至關(guān)重要的,維持細胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定的機制:①細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase的外排作用;②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對Ca2+的儲存;③線粒體對Ca2+的儲存;④胞漿中一些蛋白質(zhì)與陰離子和Ca2+結(jié)合;⑤胞漿膜內(nèi)側(cè)磷脂極性端也具有和Ca2+結(jié)合的能力[5,6]。

局部或全部腦缺血后數(shù)分鐘,神經(jīng)元細胞內(nèi)的游離鈣[iCa2+]即明顯升高,其主要機制為:①通過興奮性氨基酸受體(excitatoryaminoacidreceptor,EAAR)造成Ca2+內(nèi)流;②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體儲存的Ca2+釋放;目前認為N-甲基-D-天門冬氨酸鹽受體(N-Methyl-D-asparaticacid,NMDA)的過度激活是缺血后細胞內(nèi)iCa2+迅速升高的主要因素,而持續(xù)iCa2+升高是線粒體Ca2+釋放的結(jié)果。另外,缺氧使H+含量增多,細胞酸中毒,結(jié)合鈣成為游離鈣也加劇了胞漿內(nèi)游離鈣含量增加。

細胞內(nèi)游離鈣增加通過激活細胞內(nèi)一系列Ca2+依賴性生物化學(xué)過程和導(dǎo)致線粒體滲透性改變及功能障礙而造成細胞損害和死亡,在新生兒HIE的研究中,由于取材的限制而無法直接觀察和測定腦細胞中鈣的變化。紅細胞是血液中含量最多的細胞成分,成熟的紅細胞無核,胞漿Ca2+濃度的變化可以較好地反映細胞內(nèi)外Ca2+轉(zhuǎn)運情況,非常適用于機體細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)變化機制及病理生理的研究。

本研究結(jié)果顯示中重度HIE組急性期血漿游離鈣濃度低于非HIE組;而紅細胞內(nèi)游離鈣濃度則高于非HIE組;同時,紅細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯低于非HIE組,三項指標(biāo)中重度HIE急性期與非HIE組比較均為P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義,且病情越重,變化越大,此與以往的一些研究一致[7],提示血漿游離鈣可作為早期判斷HIE腦損傷程度的有效指標(biāo)[8]。

本研究還顯示,HIE補充鈣劑組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上均給予補充鈣劑治療10%葡萄糖酸鈣2ml/kg+10%葡萄糖注射液10ml,2次/d,靜脈滴注,連續(xù)不超過3d,患兒驚厥、呼吸障礙等癥狀明顯緩解或消失,而未補充鈣劑組的這些癥狀仍然存在,再次測定各相關(guān)指標(biāo),其結(jié)果顯示補充鈣劑組血漿游離鈣濃度較補充前明顯上升,基本恢復(fù)正常;紅細胞內(nèi)游離鈣濃度較補充前有所下降,但與未補充鈣劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與此同時,紅細胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性較補充前明顯恢復(fù),已基本恢復(fù)正常,但與未補充鈣劑組比較亦差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果提示了補充鈣劑后血漿游離鈣濃度上升,而細胞內(nèi)游離鈣濃度并未明顯上升,說明補充鈣劑并未加重細胞內(nèi)鈣超載,這就為臨床補充鈣劑提出了一定的可行性依據(jù),在臨床中HIE常出現(xiàn)低鈣血癥加重驚厥、呼吸障礙等癥狀,如不及時予以緩解會進一步加重腦損傷,甚至導(dǎo)致生命危險[9],適當(dāng)補充鈣劑即10%葡萄糖酸鈣2ml/kg+10%葡萄糖注射液10ml,2次/d,靜脈滴注,連續(xù)不超過3d,在臨床上是可行的,可有效緩解上述癥狀,但另一方面,由于本研究觀察時間較短,在補充鈣劑后是否會延長細胞內(nèi)鈣超載的持續(xù)時間仍有待于進一步的研究,有鑒于此,認為臨床上只要驚厥、呼吸障礙等癥狀緩解后即可停止鈣劑的補充,血漿游離鈣僅做為參考。

總之,HIE時易造成細胞內(nèi)外電解質(zhì)的紊亂,尤其鈣離子的紊亂不僅常見而且進一步加重抽搐、呼吸障礙等從而加重腦損傷成為導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的因素之一,當(dāng)臨床上出現(xiàn)低鈣血癥時提倡個性化治療,在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上根據(jù)臨床癥狀的不同而處理對策有所不同,當(dāng)血漿游離鈣明顯降低且同時出現(xiàn)驚厥、呼吸障礙、尿潴留等癥狀時,補充鈣劑并非絕不可取,而一旦臨床癥狀緩解即可停用鈣劑臨床觀察,血漿游離鈣水平僅作為參考;在HIE的治療方面鈣通道阻滯劑、亞低溫等的應(yīng)用亦有待于進一步的研究與探討。

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