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本文作者：胡延奇作者單位：山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司

L-瓜氨酸（L-citrulline）又名氨基甲酰尿氨酸，一種非蛋白氨基酸。1914年右賀太郎從西瓜榨汁中首先分離得到，此后學(xué)者發(fā)現(xiàn)其為一種氨基酸，故將其命名為瓜氨酸。瓜氨酸以游離態(tài)存在于多種生物體內(nèi)[1]，在動(dòng)物體內(nèi)瓜氨酸參與尿素循環(huán)（Krebs-Henseleit），起到氨解毒的作用，可用于保護(hù)肝臟。研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸在人體內(nèi)還可以起到血管舒張[2]、診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[3]、促進(jìn)男子性功能等多種生理功能。同時(shí)，瓜氨酸具有清除羥基的功能[4]，在分子生物學(xué)試驗(yàn)中被用作DNA和酶的保護(hù)劑[5]。此外，瓜氨酸作為抗氧化劑還常用于化妝品及食品等領(lǐng)域。瓜氨酸因其多種保健功能成為了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。瓜氨酸的制備方法主要有：化學(xué)法、提取法、發(fā)酵法[6]、酶法[7-11]等?；瘜W(xué)法合成瓜氨酸，產(chǎn)物回收率較低，產(chǎn)品多為DL-型外消旋體，分離困難，并且操作中引入了有機(jī)試劑，存在著潛在的健康威脅。提取法主要從生物體內(nèi)提取瓜氨酸，成本高，工藝繁瑣，不利于工業(yè)化。發(fā)酵法多為從自然界中篩選出可高產(chǎn)瓜氨酸的菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)瓜氨酸成本低，產(chǎn)量高，但是微生物代謝中，瓜氨酸作為中間產(chǎn)物存在，發(fā)酵液中可能含有精氨酸、鳥氨酸等多種氨基酸以及培養(yǎng)基成份，不利于后期分離純化。酶法是以精氨酸脫亞氨基酶為催化劑，催化L-精氨酸生產(chǎn)L-瓜氨酸。應(yīng)用工程菌進(jìn)行精氨酸脫亞氨基酶的生物合成，生產(chǎn)周期短，積累量大，隨后可進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)瓜氨酸，體系內(nèi)雜質(zhì)種類少、催化效率高、催化專一性強(qiáng)。擬通過(guò)對(duì)L-瓜氨酸的工程菌（帶有精氨酸脫亞氨基酶基因）生產(chǎn)技術(shù)及其在卷煙中的應(yīng)用研究。以期為L(zhǎng)-瓜氨酸的制備及其應(yīng)用提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種

本單位構(gòu)建的基因工程菌，以帶有精氨酸脫亞氨基酶基因的pET-22b(+)為載體，E.coliBL21(DE3)為宿主。1.1.2主要試劑L-瓜氨酸，Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG，胰蛋白胨、酵母抽提物、氨芐青霉素（Amp），均購(gòu)自上海生工；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.3培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基LB（g/L）：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，pH為7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖，胰蛋白胨，氯化鈉，MgSO4•7H2O，K2HPO4•3H2O，pH7.0。滅完菌后加入50mg/L的氨芐青霉素（Amp）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)及誘導(dǎo)方法

挑取單菌落于3.5mL液體LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過(guò)夜。按2%（v/v）的接種量接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基（含Amp），37℃、200r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG0.1mM，28℃誘導(dǎo)5h。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)化法測(cè)定酶活

將培養(yǎng)完后的菌液離心（2000g，10min）收集菌體，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）充分洗滌，再離心得到菌體。將菌體加入到pH6.0磷酸鹽緩沖液中（將20mL發(fā)酵液離心所得菌體加入到20mL細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中，底物精氨酸濃度為50g/L），40℃、180r/min反應(yīng)，反應(yīng)完后離心過(guò)濾測(cè)定上清中瓜氨酸的含量。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備瓜氨酸的研究

1.2.3.1pH對(duì)瓜氨酸合成的影響

分別配置200mmol/L的HAC-NaAC（pH4.0，5.0）、KH2PO4-NaOH（pH=6.0，7.0）、Tris-HCl（pH8.0）緩沖液。采用20mL反應(yīng)體系，50g/L的底物精氨酸，20g/L菌體，40℃，180r/min水浴振蕩反應(yīng)5h后立即加熱煮沸終止反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物含量。

1.2.3.2溫度對(duì)瓜氨酸合成的影響

最適溫度：采用20mL反應(yīng)體系，50g/L的底物精氨酸，20g/L菌體，對(duì)pH10的緩沖體系，分別在溫度為20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃下，180r/min水浴振蕩反應(yīng)5h后立即加熱煮沸終止反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物含量。

1.2.3.3底物濃度對(duì)瓜氨酸合成的影響

采用20mL反應(yīng)體系，10~100g/L不同濃度的底物精氨酸，20g/L菌體，pH6.0，40℃，180r/min水浴振蕩反應(yīng)5h后立即加熱煮沸終止反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物含量。1.2.3.4菌體生產(chǎn)能力指標(biāo)采用20mL反應(yīng)體系，50g/L的底物精氨酸，20g/L菌體，pH6.0，40℃，180r/min水浴振蕩反應(yīng)；5h后離心回收菌體，同樣的反應(yīng)體系反應(yīng)6h；重復(fù)4次，每次反應(yīng)時(shí)間相應(yīng)增加1h。

1.2.4瓜氨酸的檢測(cè)方法

定性檢測(cè)：紙層析法，新華一號(hào)層析紙（杭州新華紙業(yè)，裁成30×20cm），將樣品點(diǎn)樣2μL，制成圓筒，垂直展開，展開相采用正丁醇:冰醋酸:水（60:15:25），內(nèi)含0.4%的顯色劑茚三酮，展開結(jié)束后自然晾干溶劑，85℃顯色10min，顯色強(qiáng)度與標(biāo)樣比較。定量檢測(cè)：高效液相測(cè)定法，采用分析儀器柱前衍生化定量測(cè)定氨基酸，采用ODSC18（Φ4.6×250mm），40℃分析，檢測(cè)波長(zhǎng)338nm，氨基酸定量用外標(biāo)法定量。

1.2.5卷煙樣品制備

按照卷煙國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB506.4-1996，將上述制備的L-瓜氨酸用75%乙醇溶液溶解，以加香方式施加于某牌號(hào)卷煙空白葉組煙絲中；在溫度(22±1)℃、相對(duì)濕度60%±1%條件下平衡24h后，將煙絲卷制成煙支；再次平衡24h后，與空白煙一起進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2結(jié)果及討論

2.1培養(yǎng)基優(yōu)化

在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交優(yōu)化。

2.1.1碳源對(duì)瓜氨酸生成量的影響

以葡萄糖作為碳源，其它成分為（g/L）：胰蛋白胨20，MgSO4•7H2O1，K2HPO41，NaCl5，配制不同濃度碳源的培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、誘導(dǎo)、離心收集細(xì)胞和細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)后測(cè)定反應(yīng)液中瓜氨酸的含量，結(jié)果如圖1。圖1表明，起始時(shí)隨著葡萄糖濃度的增加發(fā)酵液的酶活逐漸增加，此時(shí)葡萄糖為微生物的生長(zhǎng)代謝提供碳源；當(dāng)葡萄糖濃度到達(dá)5g/L時(shí)，單位發(fā)酵液的酶活最高；此后，隨著葡萄糖濃度的增加單位發(fā)酵液的酶活開始降低，原因可能是葡萄糖效應(yīng)影響了微生物的生長(zhǎng)代謝。

2.1.2氮源對(duì)瓜氨酸生成量的影響

以胰蛋白胨作為氮源，其它成分為（g/L）：葡萄糖5，MgSO4•7H2O1，K2HPO41，NaCl5，配制不同濃度氮源的培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、誘導(dǎo)、離心收集細(xì)胞和細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)后測(cè)定反應(yīng)液中瓜氨酸的含量，結(jié)果如圖2。胰蛋白胨可為微生物生長(zhǎng)代謝提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，尤其是為蛋白質(zhì)合成提供材料。由圖2看出，隨著胰蛋白胨濃度的增加，瓜氨酸生成量逐漸增加，當(dāng)超過(guò)20g/L后瓜氨酸生成量的增加趨于平緩。

2.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

基于對(duì)碳源和氮源單因素研究的結(jié)果，選取葡萄糖，胰蛋白胨，MgSO4•7H2O，K2HPO4•3H2O作為研究因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、誘導(dǎo)、離心收集細(xì)胞和細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)后測(cè)定反應(yīng)液中瓜氨酸的含量，結(jié)果如表1所示。由正交試驗(yàn)結(jié)果可以得到最佳的培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖5，胰蛋白胨20，K2HPO4•3H2O1，MgSO4•7H2O1，其中胰蛋白胨的影響最大，K2HPO4•3H2O次之。

2.2誘導(dǎo)條件優(yōu)化

pET質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)含有乳糖操縱子，進(jìn)行目的基因表達(dá)需要乳糖或其結(jié)構(gòu)類似物的誘導(dǎo)，IPTG作為乳糖的結(jié)構(gòu)類似物在微生物代謝中不被利用，常被用作誘導(dǎo)劑?？紤]到IPTG的毒性，研究了乳糖對(duì)工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的影響。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、誘導(dǎo)、離心收集細(xì)胞和細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)后測(cè)定反應(yīng)液中瓜氨酸的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖3。由圖3可知選取乳糖作為誘導(dǎo)劑對(duì)瓜氨酸的合成影響不大，完全可以替代IPTG。隨后選取加誘導(dǎo)劑時(shí)細(xì)胞OD值，誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)劑量等作為研究因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、誘導(dǎo)、離心收集細(xì)胞和細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)后測(cè)定反應(yīng)液中瓜氨酸的含量，結(jié)果如表2所示。由結(jié)果可知最佳誘導(dǎo)條件為：OD值1.0，誘導(dǎo)溫度25℃，誘導(dǎo)時(shí)間7h，乳糖量5g/L，其中誘導(dǎo)時(shí)間影響最大，誘導(dǎo)溫度次之。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系研究

2.3.1pH對(duì)瓜氨酸產(chǎn)量的影響

考察了pH對(duì)瓜氨酸合成的影響，環(huán)境pH值會(huì)影響與酶的催化有關(guān)的氨基酸殘基的離子化狀態(tài)，影響影響酶的構(gòu)象，影響底物與酶活性中心的結(jié)合。以底物轉(zhuǎn)化率最高的為100%相對(duì)轉(zhuǎn)化率作圖，結(jié)果如圖4所示，瓜氨酸合成的最佳pH為6.0。

2.3.2溫度對(duì)瓜氨酸合成的影響

考察了溫度對(duì)瓜氨酸合成的影響，如圖5所示，細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)合成瓜氨酸的最適反應(yīng)溫度是40℃。隨著溫度的升高，酶活性不斷增強(qiáng)，當(dāng)溫度達(dá)到一定值后，酶活性開始下降，這是由于溫度升高到一定值后，酶開始變性，構(gòu)象發(fā)生變化，影響了酶的活性。

2.3.3底物濃度對(duì)瓜氨酸合成的影響

對(duì)于菌體添加量為20g/L的體系，考察了底物濃度對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響，如圖6所示，精氨酸質(zhì)量濃度在60g/L以下時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率均在90%以上；精氨酸濃度高于60g/L后，瓜氨酸的生成量的增加趨緩，分析原因可能是瓜氨酸作為精氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，會(huì)與精氨酸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合精氨酸托亞氨基酶的活性中心，影響酶的催化效率，因此對(duì)于菌體添加量為20g/L的細(xì)胞反應(yīng)體系，底物濃度應(yīng)為60g/L。

2.3.4菌體生產(chǎn)能力指標(biāo)

穩(wěn)定性和可重復(fù)性是酶重要指標(biāo)，可為工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)?？疾炝斯こ叹闹貜?fù)利用情況，對(duì)于菌體添加量為20g/L，精氨酸濃度為60g/L的體系，比較了不同批次細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的產(chǎn)物生成量。從圖7中可以看出工程菌重復(fù)使用3次，產(chǎn)物產(chǎn)量穩(wěn)定，第4次產(chǎn)量較降幅度較大，不再適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.4L-瓜氨酸在卷煙中的應(yīng)用結(jié)果

將前述制備所得的L-瓜氨酸分別按0.01%，0.02%，0.04%，0.06%的用量按加香方式施加于某品牌卷煙混合絲；其結(jié)果分別如下表3所示。由表3可知，隨著L-瓜氨酸用量的增加，卷煙香氣量呈增加趨勢(shì)；但各香韻間的協(xié)調(diào)性略有降低，且不舒適的雜氣較重。對(duì)比評(píng)吸結(jié)果表明當(dāng)其用量為0.02%時(shí)，綜合效果相對(duì)較好。

3結(jié)論

綜上所述，工程菌的最佳培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖5，胰蛋白胨20，K2HPO4•3H2O1，MgSO4•7H2O1；最佳誘導(dǎo)條件為：OD值1.0，誘導(dǎo)溫度25℃，誘導(dǎo)時(shí)間7h，乳糖量5g/L；對(duì)于菌體濃度為20g/L的20mL細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，工程菌細(xì)胞生產(chǎn)瓜氨酸的最佳條件為：pH6.0，溫度40℃，精氨酸濃度為60g/L，產(chǎn)量達(dá)55.1g/L，細(xì)胞可連續(xù)使用三次，且產(chǎn)量穩(wěn)定，具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。在卷煙中的應(yīng)用初步研究結(jié)果表明：在卷煙生中，加入一定量的L-瓜氨酸可提升卷煙的香氣量、香氣質(zhì)和改善余味等感官質(zhì)量指標(biāo)。