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本文作者：李璽洋1,2白俊杰1于凌云1梁旭方1作者單位：1華中農業(yè)大學水產學院2中國水產科學研究院珠江水產研究所

結果

1突變序列篩選和草魚醛縮酶A3''''UTR分析

經直接測序及DNAstar軟件分析結果顯示在草魚醛縮酶AmRNA3''''UTR內靠近polyA識別位點一端存在約由425個堿基組成的AU富含區(qū)，與眾多基因的3''''UTR高度同源。經比對分析，得出醛縮酶AmRNA3''''UTR存在一些特殊原件，如:AU富含元件ARE反應中心，和缺氧反應元件(HIF-1)中的核心序列5''''-ACGT-3''''。醛縮酶3''''UTR17bp插入序列“TGAACGCATCTGT-GCTC”位于AU富含區(qū)61bp處，離ARE反應中心差111bp和324bp。

2插入序列在草魚群體中的多態(tài)性分析

將含有17bp插入序列的基因型用A表示，不含有插入序列用B表示。在草魚群體中存在AA、AB、BB三種基因型。對三種基因型進行卡方分析，基因型頻率分析和遺傳參數(shù)分析(見表1和2)?？ǚ椒治霰砻鳎琍值大于0.05，說明插入突變基因型頻率符合Hardy-Weinberg定律。經多態(tài)信息含量(PIC)檢測為0.32，屬于中度多態(tài)性。

3插入序列與草魚生長性狀關聯(lián)分析

對草魚醛縮酶A3''''非翻譯區(qū)插入片段三種基因型與形態(tài)性狀進行一般線性模型(GLM)分析，結果見表3。該插入位點不同基因型在體寬，吻長生長性狀上有顯著差異(P＜0.05)，值分別為0.012和0.049。BB型個體在體重、體寬、眼間距、吻長、肛前距、全長、體長、尾柄長和體高上均比AB和AA型個體顯示出較高的生長優(yōu)勢，尤其在體重方面，BB型草魚體重比AA型草魚體重增加8.37%，BB型草魚在生長性狀方面較另外兩種基因型草魚占優(yōu)勢。

討論

1醛縮酶A3''''非翻譯區(qū)插入序列的功能探討

真核生物基因表達的調控序列大多群集于5''''和3''''非翻譯區(qū)，調控蛋白與3''''UTR中的順式作用元件結合而影響mRNA穩(wěn)定性，降解速率，調節(jié)轉錄本亞細胞定位和翻譯水平來調控基因表達［4］。例如人類3''''非翻譯區(qū)中高度保守的miRNAs與靶基因結合形成雙鏈來促進mRNA的降解，抑制蛋白質翻譯［5］。真核生物醛縮酶A3''''非翻譯區(qū)在基因轉錄后水平、mRNA的穩(wěn)定性、基因表達翻譯等方面的研究已有報道［6-7］。例如:Semenza［8］報道人醛縮酶A基因3''''-UTR上具有缺氧反應元件(HIF-1)中的核心序列5''''-ACGT-3''''［9］，HIF-1與核心序列結合，在3''''端功能序列作用下［10］，可增強轉錄活性，促進了醛縮酶A蛋白水平的增加，加速糖的酵解，為組織提供更多的能量［11-12］。為分析此插入突變如何影響醛縮酶A3''''-UTR的表達調控功能，本實驗分析了醛縮酶3''''-UTR結構，發(fā)現(xiàn)其區(qū)域含有一些特殊元件，如AU富含區(qū)，國內外文獻都有關于AU富含區(qū)功能［5］的報道，大部分都是關于人的，其機制是富含AU穩(wěn)定結構域使mRNA的polyA尾快速縮短至20～40個(A)寡聚尾，從而加速mRNA的降解，另一方面還可與相應蛋白因子結合，調控mRNA的降解，使翻譯效率下降［13］。例如人鈉離子依賴性二羧酸轉運蛋白基因SDCTβ3''''-UTR的AU富含區(qū)可進行基因表達負調控，降低mRNA穩(wěn)定性，促進mRNA的降解［14］。本實驗17bp插入突變序列位于AU富含區(qū)內，推測此插入突變點可通過AU富含區(qū)影響醛縮酶A蛋白的表達，進而影響醛縮酶A蛋白在糖酵解過程中功能的發(fā)揮。根據此突變點對草魚生長性狀的影響，推測此插入突變點可能通過AU富含區(qū)促進醛縮酶AmRNA降解，具體加速還是降低還需進一步研究證實。

2醛羧酶A3''''非翻譯區(qū)插入突變可用于育種

魚類大多對糖的利用能力低下，草魚更被視為先天性“糖尿病體質”［15］。醛縮酶作為糖酵解中的關鍵酶，其基因突變對糖代謝甚至對機體生長的影響更值得關注，相關研究有很多，例如CROSS等［16］在遺傳性果糖不耐受癥患者的醛縮酶B基因外顯子上發(fā)現(xiàn)了3個錯義突變，導致酶蛋白功能的缺陷，導致糖不能進一步代謝，出現(xiàn)體重不增，生長緩慢等臨床癥狀。環(huán)境條件改變會引起基因突變。推測醛縮酶的這種插入突變可能是野生草魚和養(yǎng)殖草魚食性改變，對糖利用程度不同引起的。人工養(yǎng)殖草魚飼料中糖類物質為淀粉，野生草魚以食草為主，草中主要成分為纖維素。淀粉，纖維素需淀粉酶和纖維素酶催化水解成葡萄糖，再進入糖酵解過程，兩種糖及各自的水解酶的結構，活性等均不同，對醛縮酶的活性影響程度也不同。食物的差異，糖類物質水解酶的差異以及糖酵解過程的主要酶含量及活性不同，導致醛縮酶基因突變。草魚醛縮酶A全序列已全部成功克隆，本實驗采用關聯(lián)分析法對草魚醛縮酶A基因3''''非翻譯區(qū)多態(tài)性序列與生長性狀進行分析研究。BB型草魚在生長性狀方面較另外兩種基因型草魚占優(yōu)勢?？梢钥紤]將醛縮酶A基因的多態(tài)性作為分子標記用于生長快速草魚的選育。