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本文作者：萬婧、周向陽、周秀錦、邵宏宏單位：舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局

目前使用昆蟲桿狀病毒作為基因傳遞的載體用于基因治療受到了廣泛關(guān)注,其中研究最為深入的是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedro-virus,AcMNPV)[1]。桿狀病毒基因組較大且可操作性好,可以容納多個(gè)基因或較大的基因,而且桿狀病毒在哺乳動物細(xì)胞中不能復(fù)制,并對哺乳動物細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,使得桿狀病毒成為基因治療的潛在載體。桿狀病毒雖然能夠在體外對多種細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá),但其介導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)卻很少有成功的例子,這其中抑制桿狀病毒介導(dǎo)的基因傳遞效率的主要因素是血清補(bǔ)體系統(tǒng)[2]。補(bǔ)體是構(gòu)成宿主先天性免疫的重要組成部分,并在先天性免疫和適應(yīng)性免疫之間起著一定的聯(lián)系作用。補(bǔ)體可通過經(jīng)典、替代和凝集素3條既獨(dú)立又交叉的途徑激活[3]。補(bǔ)體蛋白C1q可結(jié)合IgG或IgM分子的Fc區(qū)激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑。補(bǔ)體的C3蛋白自發(fā)地水解為C3a和C3b,C3b暴露出具有反應(yīng)性的硫酯鍵,與病原表面的氨基和糖基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合從而引發(fā)補(bǔ)體的替代途徑。當(dāng)血清中存在的甘露糖結(jié)合凝集素(Mannan-bindinglectin,MBL)或纖維蛋白膠凝素(Ficolin)與細(xì)菌或病毒表面的甘露糖殘基結(jié)合后,激活MBL-相關(guān)絲氨酸蛋白酶,進(jìn)而激活凝集素途徑。在所有途徑中,補(bǔ)體蛋白水解引起一連串級聯(lián)放大的連鎖反應(yīng),導(dǎo)致溶膜復(fù)合物(Membraneattackcomplex,MAC)的形成而引起膜穿孔[3]。補(bǔ)體系統(tǒng)的級聯(lián)激活受表面結(jié)合調(diào)節(jié)因子和可溶調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)格控制,以免發(fā)生不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活,導(dǎo)致宿主自身細(xì)胞受到損傷。表面結(jié)合調(diào)節(jié)因子包括補(bǔ)體受體1(Complementreceptor1,CR1)和補(bǔ)體促衰變因子(Decayacceleratingfactor,DAF),它們是引起C3b和C4b快速降解的輔因子,能阻止溶膜復(fù)合物的形成[34]。可溶調(diào)節(jié)因子如C4b-結(jié)合蛋白(C4BP)、H因子、FHL-1等,其中H因子和FHL-1是替代途徑中的特異性調(diào)節(jié)因子,而C4BP是經(jīng)典途徑中的調(diào)節(jié)因子[5]。補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子含有多個(gè)拷貝的短序列重復(fù)結(jié)構(gòu)(Shortconsensusrepeats,SCRs)。許多哺乳動物病毒利用補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子陷阱來逃避補(bǔ)體的攻擊。而且一些病毒產(chǎn)生的可溶蛋白與宿主的補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)和功能極為相似,例如正痘病毒和牛痘病毒[6]。利用可溶的補(bǔ)體抑制劑sCR1能抑制人體血清對桿狀病毒的滅活,使人們認(rèn)為桿狀病毒通過經(jīng)典途徑引起補(bǔ)體激活[2]。然而有研究表明,抑制補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑和凝集素途徑僅僅提高了桿狀病毒30%的存活率,將所有途徑全部中和可以達(dá)到100%的存活率,而且桿狀病毒在缺少了C1q蛋白的病人血液中的存活率僅有25%[7]。最近有研究人員利用體外血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)一步闡明了補(bǔ)體激活的機(jī)制,表明桿狀病毒粒子可以與IgM和C3b結(jié)合[8]。上述結(jié)果表明替代途徑和經(jīng)典途徑同時(shí)在桿狀病毒失活過程中起作用。在此結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展,概述了桿狀病毒逃避補(bǔ)體攻擊的多種策略,使桿狀病毒能夠有效地介導(dǎo)基因傳遞而達(dá)到基因治療的目的。

1免疫赦免位點(diǎn)作為基因傳遞的靶標(biāo)體內(nèi)存在一些稱作免疫赦免的位點(diǎn),例如眼睛、腦和睪丸,這些位點(diǎn)不能針對抗原產(chǎn)生適應(yīng)性激活和先天性免疫反應(yīng)[9]。

1.1眼睛對角膜和眼前房的免疫赦免已有數(shù)十年的研究,認(rèn)為其可以避免眼睛發(fā)炎而造成組織受損或視力下降。眼睛中存在補(bǔ)體激活的替代途徑和經(jīng)典途徑,但卻受到多種補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子,例如,DAF、MCP、CD59、I因子和H因子的嚴(yán)格控制,另外血眼屏障也限制了眼睛先天免疫系統(tǒng)的激活[10]。已有許多利用桿狀病毒載體高效轉(zhuǎn)導(dǎo)眼睛的報(bào)道。Haeseleer等首先利用表達(dá)GFP的桿狀病毒通過玻璃體內(nèi)注射和視網(wǎng)膜下注射小鼠眼睛,闡明了傳遞方法之間轉(zhuǎn)導(dǎo)模式的差異[11]。視網(wǎng)膜下注射桿狀病毒限制了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo),而玻璃體內(nèi)注射桿狀病毒導(dǎo)致基因在角膜內(nèi)皮、晶狀體、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜內(nèi)表達(dá)。相似的研究證明,將桿狀病毒通過玻璃體內(nèi)注射兔眼后,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜和光感受器細(xì)胞能夠得到有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。另外有研究利用玻璃體內(nèi)注射桿狀病毒到大鼠眼睛,從內(nèi)皮和神經(jīng)元特異性的啟動子來闡明轉(zhuǎn)基因表達(dá)的特異性[1314]。這些結(jié)果表明桿狀病毒介導(dǎo)的基因傳遞可能在治療眼部疾病方面具有廣泛的用途。

1.2腦由于血腦屏障、缺少淋巴流和免疫調(diào)節(jié)特性的居留細(xì)胞導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫赦免。研究表明免疫赦免僅限于軟細(xì)胞組織,而不包括腦室、脈絡(luò)叢、腦脊膜和腦室周圍器官[15]。許多研究利用桿狀病毒作為載體將基因傳遞到腦組織。Sarkis等證明紋狀體注射桿狀病毒后,能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠和小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞,而且注射補(bǔ)體C3蛋白抑制劑——眼鏡蛇毒因子的小鼠與對照組之間桿狀病毒介導(dǎo)的基因傳遞無明顯差異,因此該研究也首次證明了腦對桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的免疫赦免[16]。利用3個(gè)不同的立體定位圖譜:一個(gè)接近側(cè)腦室前角,一個(gè)是軟細(xì)胞組織的內(nèi)部和紋狀體,進(jìn)一步分析了桿狀病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)在小鼠腦內(nèi)的偏愛性,結(jié)果表明對脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和微脈管內(nèi)皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的偏愛性,而紋狀體注射導(dǎo)致注射位點(diǎn)僅僅有很少的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞,而且桿狀病毒并未引起顯著的小神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)和臨床生化影響[17]。利用腦室內(nèi)注射水泡性口膜炎病毒G蛋白胞外域(VesicularstomatitisvirusGpro-teinectodomain,VSV-G)假型化的桿狀病毒后,發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室的上皮細(xì)胞、大腦導(dǎo)水管和蛛網(wǎng)膜的上皮細(xì)胞都能夠檢測到轉(zhuǎn)基因的大量表達(dá)[18]。研究人員用VSV-G修飾的桿狀病毒直接轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠腦皮層后發(fā)現(xiàn)該假病毒對血液補(bǔ)體有很大的抗性[19]。Boulaire等對大鼠的腦、人的星狀細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞注射桿狀病毒后,描述了宿主的反應(yīng),其中針對桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo),星狀細(xì)胞特異性的激活補(bǔ)體系統(tǒng),選擇神經(jīng)元特異性的啟動子可能避免轉(zhuǎn)導(dǎo)星狀細(xì)胞,而補(bǔ)體激活到何種程度才能影響體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的水平以及持續(xù)表達(dá)的能力還有待進(jìn)一步論證[20]。這些結(jié)果為臨床治療腦部疾病提供了光明的前景。

1.3睪丸血睪屏障物理性的將血管和輸精管分開,使得睪丸也是一個(gè)免疫赦免組織[21]。目前利用桿狀病毒將基因傳遞到小鼠睪丸組織的研究報(bào)告僅有兩例:Tani等通過輸精管傳送表達(dá)GFP的桿狀病毒,發(fā)現(xiàn)基部的細(xì)胞和塞爾托利細(xì)胞有轉(zhuǎn)基因的表達(dá)[19];而Park等將桿狀病毒注射到白膜,使得外部的輸精管細(xì)胞有高水平的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)[22]。在研究中未檢測到精母細(xì)胞和精細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo),表明了桿狀病毒可以被用來介導(dǎo)基因傳遞到睪丸組織,而且沒有種系傳播的風(fēng)險(xiǎn)。2體外轉(zhuǎn)導(dǎo)為提高基因傳遞效率,亦可人工創(chuàng)造免疫赦免條件。研究人員將桿狀病毒注射到兔頸動脈處的硅橡膠環(huán)內(nèi),避免了桿狀病毒與血液補(bǔ)體的接觸,使得外膜細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平明顯高于腺病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)水平[23]。體外轉(zhuǎn)導(dǎo)是隔絕補(bǔ)體的有效措施,首次理論論證的結(jié)果表明在人肝灌注模型處能檢測到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。研究報(bào)道可以利用桿狀病毒將基因高效地傳遞到關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,這個(gè)過程需要骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bonemorphogeneticprotein-2,BMP-2)的表達(dá)和旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器培養(yǎng)基,證明桿狀病毒可以在軟骨和骨組織加工方面作為潛在的載體。將這種方式的軟骨細(xì)胞加工應(yīng)用到兔體時(shí),可以在膝蓋骨的凹槽處修復(fù)軟骨缺陷[24]。Hu等首次證明了桿狀病毒可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)人的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)以及起源于MSCs的脂肪形成細(xì)胞的前體、軟骨形成細(xì)胞的前體和成骨細(xì)胞的前體[25]。研究人員利用攜帶BMP-2的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)MSCs引起成骨細(xì)胞的分化,移植到裸鼠背部的皮下組織可導(dǎo)致異位骨的形成[26];而且在免疫兔體中利用表達(dá)BMP-2和VEGF的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)同種異系的MSCs時(shí),可以增加股骨的部分骨缺陷的愈合[27]。已經(jīng)證明桿狀病毒載體也可以將基因高效地傳遞到人的胚胎干細(xì)胞。大量的研究工作證實(shí)桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)并不影響基因組的穩(wěn)定性以及胚胎干細(xì)胞的多功能性。利用桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)起源于人的胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞有助于神經(jīng)系統(tǒng)的移植,為治療廣譜的神經(jīng)疾病提供了可能性[28]。最近,桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC細(xì)胞被用來將自殺基因——胸苷激酶傳遞到異種移植腫瘤[29]。這些結(jié)果表明了利用桿狀病毒作為體外治療載體的巨大潛在可能性。

3補(bǔ)體的藥理抑制劑

利用補(bǔ)體的藥理抑制劑滅活補(bǔ)體,可以避免桿狀病毒的失活。利用補(bǔ)體C3蛋白抑制劑——眼鏡蛇毒因子處理血清后,再進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠抑制補(bǔ)體對桿狀病毒的滅活作用。進(jìn)一步研究證明,利用能結(jié)合C3b和C4b的可溶性補(bǔ)體抑制劑sCR1處理人血清時(shí),桿狀病毒的存活率呈現(xiàn)劑量依賴性[2]。Tani等利用補(bǔ)體B和C1蛋白的抑制劑FUT-175,也能恢復(fù)桿狀病毒的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)活性[19]。到目前為止,利用補(bǔ)體的藥理抑制劑進(jìn)行體內(nèi)研究的報(bào)道僅有兩例。Sarkis等通過紋狀體注射桿狀病毒后,再用眼鏡蛇毒因子預(yù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)處理的小鼠和對照組之間無明顯差異,揭示了腦的免疫赦免足以保護(hù)載體免受失活[16]。2005年,研究人員對小鼠的門靜脈注射高滴度的桿狀病毒,通過服用sCR1的處理組和對照組來證明體內(nèi)補(bǔ)體激活的重要意義[7]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組的小鼠全部死亡,而處理組小鼠的2/3存活且存在較低水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá),進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明降低病毒的劑量可以降低免疫反應(yīng)的激活。而且兩組小鼠的肝組織學(xué)揭示了肝壞死和出血區(qū)域可能與補(bǔ)體系統(tǒng)的激活有關(guān)。當(dāng)對小鼠注射高滴度的桿狀病毒時(shí),其肝出血和死亡是否是由于血液凝固引起的有待進(jìn)一步研究論證。這些研究結(jié)果說明進(jìn)一步尋找合適的補(bǔ)體抑制劑對于降低免疫反應(yīng)具有重要意義,也突出了未來臨床治療上劑量選擇的重要性。Georgopoulos等在人的體外血液循環(huán)系統(tǒng)中評估了兩種補(bǔ)體抑制劑的效果:C3裂解的抑制劑和C5a受體拮抗物(C5areceptorantagonist,C5aRA)[8]。兩種抑制劑均能引起細(xì)胞炎癥因子釋放的減少,與C3裂解的抑制劑相反,C5aRA卻不能拯救桿狀病毒的失活,表明在MAC的形成過程中C5b較C5a起了更重要的作用。此外,在體外血液循環(huán)系統(tǒng)中注射病毒和C3裂解的抑制劑后,發(fā)現(xiàn)血液細(xì)胞中的補(bǔ)體激活級聯(lián)反應(yīng)明顯降低。注射桿狀病毒可引起肉眼可見的血塊凝固,加入抑制劑后可完全抑制血塊的形成。由此可見,C3裂解的抑制劑可以有效地抑制補(bǔ)體激活、炎癥因子的釋放和血塊的凝固,這些特性使其有望成為臨床應(yīng)用桿狀病毒的有效抑制劑。

4桿狀病毒的表面加工

通過遺傳和化學(xué)方式加工桿狀病毒也可以在基因傳遞的過程中避免補(bǔ)體的攻擊[3031]?？梢詫U狀病毒粒子表面進(jìn)行加工,例如當(dāng)病毒粒子從昆蟲細(xì)胞膜出芽時(shí),可以將過表達(dá)的跨膜蛋白組合到病毒粒子的表面。同樣的,可以將感興趣的多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示于病毒粒子的囊膜上。通常將這種技術(shù)稱作桿狀病毒展示技術(shù),這個(gè)真核展示平臺在藥物開發(fā)、疫苗和基因傳遞方面具有廣泛的應(yīng)用[32]。將桿狀病毒的囊膜糖蛋白GP64作為融合伴侶是目前應(yīng)用最為廣泛的表面加工技術(shù)[33]。GP64是病毒結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞必不可少的蛋白,也是依賴低pH從核內(nèi)體中脫去核衣殼,以及隨后從昆蟲細(xì)胞中出芽不可或缺的蛋白。為了避免由于GP64的修飾而可能導(dǎo)致病毒感染力下降問題的出現(xiàn),研究人員也在探尋其他的表面展示技術(shù),VSV-G即是其中一種[30]。已有研究證明,對病毒粒子進(jìn)行化學(xué)修飾也是一種有效的表面加工技術(shù)[34]。

4.1聚合物包被聚合物能保護(hù)載體免受血液補(bǔ)體的識別,這種方法也被應(yīng)用到桿狀病毒上。桿狀病毒表面帶有負(fù)電荷,因此可以用帶正電荷的聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)包被病毒粒子,這種包被依賴于病毒粒子和聚合物之間的靜電相互作用[31]。在50%的人血清中PEI可以使10%的載體免受補(bǔ)體的破壞,而在小鼠血清中可以達(dá)到100%。在感染復(fù)數(shù)為100,不超過0.2nmolPEI/106病毒粒子的比率時(shí),轉(zhuǎn)導(dǎo)桿狀病毒不會引起細(xì)胞毒素的副作用。研究報(bào)道,PEI包被的桿狀病毒在肝和脾臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯高于未包被的病毒,而且在裸鼠模型中,包被的桿狀病毒能高效地抑制人異種移植腫瘤的生長。半乳糖化的PEI1800與PEI效果一致,卻提高了桿狀病毒在10%血清中的穩(wěn)定性[35]。已有研究發(fā)現(xiàn),利用另一種聚合物——聚乙烯乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)修飾桿狀病毒能提高基因在體外、鼠腦和肺中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,而且聚乙二醇化的程度低于36.5%時(shí)對病毒的感染性影響最小[36]。此外,葉酸-PEG修飾桿狀病毒后在體外表現(xiàn)出受體特異性的基因轉(zhuǎn)移,而且能抑制人表皮癌異種移植模型中腫瘤的生長[34]。盡管未對聚乙二醇化桿狀病毒的血清穩(wěn)定性進(jìn)行研究,但是上述結(jié)果足以證明聚乙二醇化可以逃避免疫系統(tǒng),并延長生物分子的循環(huán)時(shí)間[37]。然而,在利用PEI和PEG聚合物時(shí),為保證病毒的感染性和較低的細(xì)胞毒性,需要對聚合物的尺寸以及聚合物與病毒粒子的比率進(jìn)行最優(yōu)化處理。

4.2假型化批次之間的差異以及保證病毒的感染性需要大量優(yōu)化工作,這兩方面限制了化學(xué)修飾的應(yīng)用。從遺傳學(xué)角度對載體進(jìn)行加工,避免補(bǔ)體的攻擊是一個(gè)理想選擇。假型化是利用其他病毒表面蛋白替換病毒自身囊膜蛋白的過程,目前已被證明可以緩和補(bǔ)體攻擊的問題。VSV-G假型化的桿狀病毒應(yīng)用最為廣泛,研究表明無論在體內(nèi)還是體外,VSV-G都提高了桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[19]。與未修飾的的桿狀病毒相比,VSV-G假型化的桿狀病毒對人、兔、豬、大鼠、倉鼠和小鼠的血清補(bǔ)體都顯示出較強(qiáng)的抵抗力。這些結(jié)果與VSV-G假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的研究結(jié)果一致[3839]。研究證明在gp64-敲除型的桿狀病毒中,VSV-G和麻疹病毒受體CD46可以在一定程度上代替GP64的功能,使得桿狀病毒能夠在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制和傳播[4041]。Barsoum等首先假定VSV-G假型化的桿狀病毒可以抵抗補(bǔ)體的攻擊,通過尾靜脈注射VSV-G假型化的桿狀病毒后,發(fā)現(xiàn)在小鼠肝細(xì)胞中有轉(zhuǎn)基因的表達(dá)[42]。研究人員進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明,直接肌肉注射VSV-G修飾的桿狀病毒有一部分不被補(bǔ)體系統(tǒng)中和,提高了基因傳遞到小鼠四頭肌的效率[43]。Kaikkonen等表明共展示VSV-G蛋白的一個(gè)短的跨膜片段與完整的VSV-G一樣可以保護(hù)桿狀病毒免受補(bǔ)體的攻擊[30]。上述結(jié)果表明,對桿狀病毒的囊膜進(jìn)行修飾,可以改變其免疫特性,而共展示異種囊膜蛋白提供補(bǔ)體保護(hù)的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4.3表面展示補(bǔ)體抑制劑通過遺傳方式在病毒粒子表面展示補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白,這樣可以增加桿狀病毒載體在血清中的穩(wěn)定性,第一個(gè)被展示的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白是DAF[44]。展示DAF-GP64融合蛋白的桿狀病毒可以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)補(bǔ)體充足新生鼠的肝軟細(xì)胞組織,而對成鼠直接肝內(nèi)注射后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效果一般。研究人員證明了展示DAF的保護(hù)特性,并且評估了其他補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白以及不同組合間逃避補(bǔ)體攻擊的效率,例如FHL-1、C4BP和MCP[30]。桿狀病毒在血清中的穩(wěn)定性依賴于展示的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白和血清的來源,研究證明70%的小鼠血清以及13%的大鼠血清具有最佳的防護(hù)效果,將病毒粒子與50%的人血清孵育1h后,大約30%的病毒粒子仍能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)HepG2細(xì)胞。通常細(xì)胞表面結(jié)合的DAF和MCP能較好地阻止補(bǔ)體激活,而同時(shí)共展示幾種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白達(dá)不到更好的效果。先前研究表明門靜脈注射高劑量未經(jīng)修飾的桿狀病毒對小鼠是致死的,而門靜脈注射抑制補(bǔ)體攻擊的桿狀病毒能安全將基因傳遞到靶器官,與補(bǔ)體的藥理抑制劑相似,展示DAF提高了小鼠的存活率[7,30]。越來越多的證據(jù)表明補(bǔ)體系統(tǒng)和Toll-樣受體(Toll-likereceptors,TLR)之間存在大量的串?dāng)_現(xiàn)象,例如,在缺失DAF的小鼠中檢測到白介素1-b(Interleukin-1b,IL-1b)和白介素-6(Inter-leukin-6,IL-6)在TLR的刺激下顯著增加,表明了TLR引起的細(xì)胞因子反應(yīng)對補(bǔ)體系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用[45]。有趣的是,攜帶DAF的桿狀病毒與巨噬細(xì)胞孵育后,與對照相比,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥性細(xì)胞因子明顯減少。已經(jīng)證明,補(bǔ)體的激活可以引起血液凝固,當(dāng)高劑量的桿狀病毒接觸到血液也會引起這種現(xiàn)象。研究報(bào)道,展示DAF-VSV-GED能降低補(bǔ)體的激活和炎癥反應(yīng),也有可能降低血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。對表面展示補(bǔ)體抑制劑的不斷研究勢必會促進(jìn)桿狀病毒作為基因傳遞載體的廣泛應(yīng)用。

5結(jié)論與展望

桿狀病毒在哺乳動物細(xì)胞中不能復(fù)制,以及對哺乳動物細(xì)胞較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率使它成為基因治療中越來越有吸引力的載體[46]。然而,桿狀病毒對人體血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)高度敏感,要使桿狀病毒載體在基因治療中得到廣泛應(yīng)用,必須克服補(bǔ)體系統(tǒng)的攻擊。避免補(bǔ)體系統(tǒng)攻擊的被動措施包括：將免疫赦免組織作為基因傳遞的靶標(biāo)和體外轉(zhuǎn)導(dǎo),這些措施被證明有潛在的應(yīng)用價(jià)值,但是在臨床上不能廣泛使用。在未來的發(fā)展中,補(bǔ)體的藥理抑制劑有望以混合物的方式獲得廣泛應(yīng)用,例如C3裂解的抑制劑,然而在基因治療中抑制補(bǔ)體的潛在副作用有待進(jìn)一步評估[47]。因此,最理想的選擇是對載體自身進(jìn)行加工,使其避免補(bǔ)體的攻擊,研究證實(shí)PEI包被和展示DAF的桿狀病毒具有巨大的應(yīng)用潛力。桿狀病毒載體引起補(bǔ)體激活的分子機(jī)制仍不明確。C3b與蛋白抑制劑或者細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合就能失活,而桿狀病毒粒子缺少這些抑制蛋白,由于昆蟲宿主細(xì)胞檢測不到唾液酸轉(zhuǎn)移酶的活性,因此桿狀病毒也不攜帶唾液酸,所以不能失活C3b,也就容易被補(bǔ)體系統(tǒng)失活[3]。在能夠表達(dá)唾液酸的昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)展示DAF的桿狀病毒可能會更好地逃避補(bǔ)體的攻擊。明確桿狀病毒激活補(bǔ)體的詳細(xì)機(jī)理,對將來設(shè)計(jì)更高效的桿狀病毒載體以及基因治療的臨床應(yīng)用具有重要意義。