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本文作者：苑園園、劉清明、廖富蘋、林健榮單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是水產(chǎn)養(yǎng)殖重要的條件致病菌,能夠引起多種水產(chǎn)動(dòng)物敗血癥,危害極大。目前由該菌感染引起的疾病絕大多數(shù)依賴抗生素藥物治療,對(duì)水環(huán)境、水產(chǎn)品質(zhì)量和人類健康等的安全造成重要影響[1]。因而,采用生物防治技術(shù)或利用生物產(chǎn)物進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物嗜水氣單孢菌感染癥的預(yù)防和治療有重要意義。近年來,我國在嗜水氣單胞菌的生物防治領(lǐng)域已取得一些進(jìn)展,單曉楓等[2]研究了糞腸球菌MLS-7對(duì)嗜水氣單胞菌有較強(qiáng)的抑菌作用,宋鐵英等[3]從土壤和植物中分離純化出拮抗菌LB3、K1、K29、E43,對(duì)防治鱉的嗜水氣單胞菌感染癥有效,秦生巨等[4]發(fā)現(xiàn)8株蛙弧菌對(duì)河蚌嗜水氣單胞菌具有裂解效果。周飛等[5]發(fā)現(xiàn)金銀花對(duì)嗜水氣單胞菌有較強(qiáng)的抑菌作用,彭金菊等[6]在32味中藥中篩選出五倍子、梔子、訶子、五味子、烏梅、黃芩、川黃連、石榴皮等8味藥物對(duì)嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)的抑菌活性,張梁[7]的研究表明大蒜素對(duì)引起草魚腸炎的豚鼠氣單胞菌具有顯著的體外抑菌及防治效果。芽孢桿菌是一類重要的具有生防潛力的細(xì)菌,這類菌株能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)[8],多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspo-lymyxa)CP7菌株是本課題組分離獲得的一株具有廣譜抗病原菌活性的拮抗性細(xì)菌,能夠分泌多種抗菌活性物質(zhì)[9],在其發(fā)酵培養(yǎng)的上清液中,已知有3種抗菌物質(zhì)存在:第1種是由23個(gè)氨基酸組成的具有抗革蘭氏陽性菌的Cpacin抗菌肽(廖富蘋等,發(fā)明專利號(hào):200710118975)[10];第2種是抗革蘭氏陰性菌的多粘菌素類物質(zhì)[11];第3種是抗真菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶[12]。本文研究了CP7菌株的抗菌蛋白(CP7ACP)對(duì)嗜水氣單胞菌S12菌株的抑殺作用機(jī)理,為CP7ACP在水產(chǎn)致病菌嗜水氣單胞菌的生物防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株多粘類芽孢桿菌CP7菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存,嗜水氣單胞菌S12菌株來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所。

1.2CP7ACP的制備挑取平板培養(yǎng)的CP7菌株單菌落接種于5mLYEPD液體培養(yǎng)基中,于30°C、180r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h作為種子菌液,按1％接種量(體積比)轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30°C、180r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)液置于沸水浴中處理20min后,迅速取出冰浴冷卻,于4°C、10000r/min離心20min,收集的上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后用33%硫酸銨飽和度沉淀其蛋白,經(jīng)透析,即為菌株抗菌蛋白提取液,于20°C冰箱保存?zhèn)溆?。可溶性蛋白的含量測定采用考馬斯亮藍(lán)顯色法測定抑菌蛋白的濃度。

1.3抑菌試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)S12菌液濃度經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)為105106CFU/mL。用CP7ACP原液(濃度為27.84g/L)對(duì)S12的抗菌活性參照瓊脂板孔穴擴(kuò)散法[13],孔穴直徑2.7mm,每孔穴加粗提液5μL,以消毒營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為對(duì)照,30°C倒置培養(yǎng)過夜,測量CP7ACP對(duì)S12抑菌圈的直徑。采用二倍稀釋法測定CP7ACP對(duì)S12的最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)[14]。

1.4S12磷泄漏的檢測參照Newton等[15]的方法并做改進(jìn),將處于對(duì)數(shù)生長期的S12菌液于4500r/min離心10min,收集菌體。用pH7.0、5mmol/L的HEPES-Na緩沖液(含1%NaCl)重新懸浮洗滌除去雜質(zhì),重復(fù)23次,調(diào)節(jié)濃度約1.0×108CFU/mL;然后依次向10mL離心管中加入HEPES-Na緩沖液、S12菌液和CP7ACP的2、4倍稀釋液。使菌液最終濃度為2.0×107CFU/mL。以滅菌水處理作為對(duì)照組,30°C分別孵育0、10、20、30、60、90、120、150、180min后,迅即放置在冰浴上,4°C、4500r/min離心5min,收集上清,用紫外分光光度計(jì)在OD700測定上清液中磷的吸光度,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出含量,從而測算CP7ACP作用菌體后引起菌體磷泄漏的變化情況。處理樣品中磷含量的測定采用鉬銻抗(即鉬酸銨-酒石酸銻鉀-抗壞血酸)比色法[16]。

1.5CP7ACP對(duì)S12胞內(nèi)的生物大分子物質(zhì)影響的檢測生物體內(nèi)的紫外吸收物質(zhì)主要有蛋白質(zhì)、DNA和RNA等,可通過檢測紫外吸收量來衡量分析,參照鄒文政等的方法[17]。取對(duì)數(shù)生長期的S12,用0.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋為1×106CFU/mL。CP7ACP的2倍、4倍稀釋液的分別與稀釋菌液于30°C共同孵育10、20、30、60、90、120、150、180min,以未加CP7ACP的稀釋菌液為對(duì)照;用0.22μm濾膜過濾檢測液,濾液于紫外分光光度計(jì)260nm波長測定其吸光值,以其衡量CP7ACP引起S12內(nèi)泄出生物大分子物質(zhì)的效應(yīng)。

1.6紫外光譜法分析S12基因組DNA增色效應(yīng)利用TIANampBacteriaDNAKit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,提取S12基因組DNA,在0.01mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.2)介質(zhì)中,S12基因組DNA與CP7ACP2倍稀釋液混合于30°C避光孵育,孵育時(shí)間經(jīng)過3、6、12、18h后;以水調(diào)零做基線,置于紫外-可見分光光度計(jì)中進(jìn)行掃描,分別測其波長在220300nm范圍內(nèi)的紫外吸光光譜[18]。在整個(gè)操作過程中,樣品實(shí)行避光保存。

1.7CP7ACP對(duì)S12作用的電鏡觀察CP7ACP對(duì)S12菌體作用處理過程是:S12在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基30°C條件下?lián)u床培養(yǎng)12h,在對(duì)數(shù)生長期取菌液經(jīng)5000r/min離心10min,棄上清收集沉淀,用10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)調(diào)節(jié)菌的濃度為1×108CFU/mL,吸取制備好的S12菌液2mL至離心管中,然后加入CP7ACP至終濃度為2倍稀釋液,混勻,于30°C保溫0.5、1、3h后,5000r/min離心5min,收集菌體。加入適量的PBS緩沖液洗滌菌體3次,收集菌體。以滅菌水處理的菌液為對(duì)照。分別取上述經(jīng)處理的樣品,加入1mL4%戊二醛固定液,混勻菌體,于4°C固定過夜。然后按常規(guī)方法處理樣品后,掃描電鏡觀察記錄、拍照。分別是取上述經(jīng)處理的樣品,加入適量的PBS緩沖液洗滌菌體3次,棄緩沖液(不打散細(xì)胞),加入2.5%戊二醛固定液10min,然后5000r/min離心10min,于4°C冰箱中固定過夜。然后按常規(guī)方法處理樣品,透射電鏡觀察記錄、拍照。

2結(jié)果與分析

2.1CP7ACP對(duì)S12的抑殺作用CP7ACP對(duì)S12進(jìn)行抑菌試驗(yàn),結(jié)果見圖1,經(jīng)檢測抑菌圈直徑約8.1mm。經(jīng)測定,CP7ACP對(duì)S12的最小抑制濃度(MIC)為3.48g/L,即只需CP7ACP原液濃度的1/8便可完全抑制S12菌體的生長,最小殺菌濃度(MBC)為6.96g/L,即只需CP7ACP原液濃度的1/4便可全部殺死菌體。結(jié)果表明CP7ACP對(duì)S12有明顯的抑殺作用。

2.2CP7ACP對(duì)S12磷泄漏的影響CP7ACP對(duì)S12作用后,菌體內(nèi)磷的泄漏情況如圖2所示。從圖2中看出CP7ACP的2、4倍稀釋液處理30min,S12胞外的磷就分別達(dá)到110.9和89.7μmol/L,60min后磷濃度達(dá)到最高值,分別是117.5和94.3μmol/L,經(jīng)方差分析顯示,P>0.05,即2、4倍稀釋液分別處理30、60min時(shí)磷泄漏沒有顯著性差異,而與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明CP7ACP能使S12胞內(nèi)在短時(shí)內(nèi)發(fā)生明顯的泄露,并且CP7ACP濃度越高泄漏量越多。

2.3CP7ACP對(duì)S12胞內(nèi)的生物大分子物質(zhì)影響生物體內(nèi)的紫外吸收物質(zhì)主要有蛋白質(zhì)、DNA和RNA等大分子物質(zhì),以CP7ACP的2、4倍稀釋液處理S12,在260nm處檢測培養(yǎng)液吸光值,分析CP7ACP影響菌體大分子物質(zhì)泄漏情況,結(jié)果見圖3。可見紫外吸收物質(zhì)發(fā)生明顯的變化,在處理030min時(shí),紫外吸收物質(zhì)量急劇上升,3060min時(shí)達(dá)到峰值,此后處于平緩的狀態(tài)。對(duì)照區(qū)幾乎檢測不出紫外吸收物質(zhì)的量值。經(jīng)方差分析顯示,CP7ACP的2、4倍稀釋液作用后的吸光值差異顯著(P＜0.05),2、4倍稀釋液作用后的吸光值與對(duì)照相比差異極顯著(P＜0.01)。由此推測,CP7ACP會(huì)引起S12胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)即生物大分子的外泄。

2.4CP7ACP對(duì)S12基因組DNA的作用增色效應(yīng)通常是由于DNA變性引起的光吸收增加,可作為衡量DNA變性的依據(jù)。CP7ACP處理S12基因組DNA后的增色效應(yīng)檢測情況如圖4所示。從圖4中可以看出,CP7ACP處理S12基因組DNA后,在紫外光波長為260nm處發(fā)生了增色效應(yīng),處理時(shí)間越長增色效益越明顯,即18h＞12h＞6h＞3h,細(xì)菌基因組DNA的紫外吸光值隨作用時(shí)間的延長而上升。增色效應(yīng)的發(fā)生,可能是CP7ACP與DNA表面的磷酸基團(tuán)作用;或者部分結(jié)構(gòu)嵌入到DNA分子溝槽中,使DNA原本收縮的構(gòu)象趨于松散變性。

2.5CP7ACP對(duì)S12抑殺作用的電鏡觀察

2.5.1CP7ACP對(duì)S12作用的掃描電鏡觀察:S1被CP7ACP的2倍稀釋液處理0.5、1、3h。在掃描電鏡下觀察其菌體的變化,如圖5所示。正常S12的形態(tài)特征(圖5A),菌體呈桿狀,兩端鈍圓,結(jié)構(gòu)完整,外觀飽滿,表面光滑、圓潤無孔洞。CP7ACP處理S12,0.5h后細(xì)胞表面變得粗糙,有孔洞出現(xiàn),并且有些細(xì)胞間出現(xiàn)粘連(如圖5B箭頭所示);1h后有些菌體表面有明顯孔洞出現(xiàn),表面凸凹不平,細(xì)胞與細(xì)胞之間的界限略變模糊,細(xì)胞形態(tài)趨向變形,邊緣模糊部分粘連在一起(如圖5C箭頭所示);3h后菌體細(xì)胞壁呈溶解狀,細(xì)胞變形破裂嚴(yán)重,內(nèi)容物泄漏而使菌體細(xì)胞干癟、皺縮,表面粗糙程度加重(如圖5D箭頭所示),另胞外可看到許多大而明顯的附著在菌體上的白色分泌物,推測是正在外泄的細(xì)胞內(nèi)容物(如圖5E箭頭所示)。

2.5.2CP7ACP對(duì)S12作用的透射電鏡觀察:S12被CP7ACP的2倍稀釋液處理0.5、1、3h后,用透射電鏡觀察其細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化,見圖6。對(duì)照組菌體細(xì)胞的內(nèi)膜和外膜結(jié)構(gòu)完整,輪廓層次清晰、致密,胞內(nèi)內(nèi)容物充實(shí)且分布均勻,細(xì)胞邊緣光滑,圓潤(如圖6A所示)。CP7ACP處理S12,30min后細(xì)胞內(nèi)容物出現(xiàn)溶解,質(zhì)壁分離,細(xì)胞膜開始有破損,細(xì)胞邊緣及結(jié)構(gòu)層次性模糊,細(xì)胞變成不規(guī)則多邊形,細(xì)胞外圍可見許多短線狀的絮狀物(如圖6B箭頭所示);1h后細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重,出現(xiàn)許多缺損,細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊不清,原有的微細(xì)結(jié)構(gòu)紊亂甚至消失,胞內(nèi)內(nèi)容物大量溢出,形成大片空白區(qū)(圖6C箭頭所示);3h后細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破損更嚴(yán)重,細(xì)胞變形,出現(xiàn)很多缺口,胞內(nèi)內(nèi)容物大量流失,胞內(nèi)空虛,整個(gè)細(xì)胞處于崩潰狀態(tài)(圖6D箭頭所示)。

3討論

目前認(rèn)為抗菌肽殺菌的作用機(jī)制主要是其作用于病原菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜,進(jìn)而形成有規(guī)則結(jié)構(gòu)的離子通道,胞漿完整性遭到破壞,細(xì)胞內(nèi)外離子不平衡,使得離子或胞內(nèi)內(nèi)容物外泄,最終引起細(xì)菌死亡[1921]。Harder等[22]認(rèn)為人抗菌肽β-defensin3能夠使細(xì)胞壁形成孔洞,導(dǎo)致細(xì)菌死亡。徐進(jìn)署等[23]證明細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)是家蠶抗菌肽CM4攻擊的首要靶點(diǎn)。而Melittin和Pandinin是通過-螺旋的疏水中心垂直插入到細(xì)胞膜內(nèi),破壞細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)[2425]。本研究通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),受處理的菌體細(xì)胞表面變得粗糙,細(xì)胞間出現(xiàn)粘連,隨著作用時(shí)間的延長,細(xì)胞形態(tài)變形,細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯缺損,內(nèi)容物外泄而塌陷,菌體破裂,菌體干癟,皺縮而壞死。透射電鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)也明顯看到,S12的細(xì)胞壁受損,出現(xiàn)孔洞;細(xì)胞膜甚至溶解,細(xì)胞器被破壞。Robert等[26]和Reddy等[27]認(rèn)為抗菌物質(zhì)作用于菌體后引起細(xì)胞內(nèi)無機(jī)磷、DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子泄漏的原因是抗菌物質(zhì)破壞了細(xì)胞壁,繼而破壞細(xì)胞膜,細(xì)胞內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)受到破壞,生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)被阻斷,從而導(dǎo)致胞內(nèi)離子的外泄,DNA和RNA等核酸物質(zhì)的泄漏,以及胞內(nèi)ATP水解等,使得受處理菌菌液中的磷、DNA和核酸類物質(zhì)含量增多。本研究也發(fā)現(xiàn)受CP7ACP處理的S12菌體內(nèi)無機(jī)磷和胞內(nèi)生物大分子物質(zhì)大量外泄,且是在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生、呈現(xiàn)急劇性的。此外,Boman等[28]和Chatterji等[29]認(rèn)為抗菌肽通過與細(xì)菌DNA結(jié)合進(jìn)而阻斷DNA的合成也是抗菌肽殺菌的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)CP7ACP使S12基因組DNA產(chǎn)生增色效應(yīng)。這可能是CP7ACP與DNA表面的磷酸基團(tuán)作用,或者CP7ACP部分結(jié)構(gòu)嵌入到DNA分子溝槽中,使DNA構(gòu)象趨于松散變性。綜上所述,CP7ACP的殺菌機(jī)制可能破壞S12的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,使S12胞內(nèi)無機(jī)磷和DNA等生物大分子外泄或者是抗菌物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)與基因組DNA發(fā)生結(jié)合,引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的破壞而導(dǎo)致細(xì)菌死亡的。嗜水氣單胞菌是在水體等環(huán)境中廣泛分布的有害性細(xì)菌,能夠引起淡水魚類敗血癥,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖危害極大。目前對(duì)該病的防治,主要使用化學(xué)藥物。然而,因長期、大量使用抗生素等化學(xué)藥品,現(xiàn)已引起了許多病原菌產(chǎn)生了耐藥性,并產(chǎn)生殘留,影響了水產(chǎn)品的質(zhì)量與食用安全。為此,采用生物防治技術(shù)或利用生物產(chǎn)物進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物嗜水氣單孢菌感染癥的預(yù)防和治療受到越來越多的重視。CP7菌株的發(fā)酵上清液有Cpacin抗菌肽、多粘菌素類物質(zhì)和β-1,3-1,4-葡聚糖酶等3種成分分別抵抗革蘭氏陽性、陰性菌和真菌,本研究中的CP7ACP實(shí)際上包括以上3種物質(zhì)在內(nèi)的蛋白質(zhì)混合物。本研究利用CP7ACP體外作用嗜水氣單胞菌,研究表明CP7ACP能夠抑制魚嗜水氣單胞菌在瓊脂平板上生長,掃描電鏡和透射電鏡可明顯觀察到CP7ACP能夠抑殺魚嗜水氣單胞菌。嗜水氣單胞菌是革蘭氏陰性菌,CP7ACP中抑制革蘭氏陰性菌的成分是多粘菌素類物質(zhì)。因此認(rèn)為CP7菌株是嗜水氣單胞菌的拮抗菌,其分泌的活性成分多粘菌素類物質(zhì)能夠強(qiáng)烈抑殺嗜水氣單胞菌的生長,可以考慮通過進(jìn)一步的研究開發(fā)應(yīng)用于防治魚嗜水氣單胞菌引起的病害。