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本文作者：孫婷、王芳、李梅花、孫春玲、劉文俊、于潔、張家超、張和平單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室

藏靈菇又稱“西藏靈菇”,是一種乳白色、膠質(zhì)塊狀物,外形酷似米粒,上面棲息著多種微生物,能在乳中快速生長,并集結(jié)成塊,看起來很像雪蓮,也稱“西藏雪蓮”[1]。據(jù)相關文獻記載,“西藏雪蓮”主要具有以下功效:(1)可以加速唾液、胃酶及胰酶的分泌,增強食欲和幫助消化。(2)乳酸菌分解糖所產(chǎn)生的乳酸和醋酸,具有使腸內(nèi)pH下降,抑制腐敗菌和病原菌繁殖,從而抑制小腸腐敗。微量的乙醇可以促進新陳代謝,使循環(huán)系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的活動正?；?對于胃腸病、代謝異常病有較好的治療與預防作用。(3)能夠降低膽固醇,有效防止高血壓、冠心病等心血管疾病的發(fā)病率。(4)其活性物質(zhì)成分以及微生物所形成的抑制致病菌的抗菌性物質(zhì)能抑制癌癥的發(fā)生及癌細胞增殖[24]。目前對藏靈菇的研究還屬于起步階段,相關的報告并不多,根據(jù)一些相關文獻的報道藏靈菇中主要的微生物是乳酸菌和酵母菌,其中乳酸菌包括開菲爾乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、腸膜明串珠菌、乳酸乳球菌;酵母菌包括啤酒酵母、假絲酵母、克魯維酵母、單孢酵母等[5],同時也有部分文獻報道過藏靈菇中含有醋酸菌[6],肖琳琳等人從藏靈菇中分離出多株乳球菌、乳桿菌和酵母菌,并從中篩選出一株能高效降解膽固醇的干酪乳桿菌[7],劉變芳等人也從藏靈菇中分離出乳桿菌、乳球菌及酵母菌[8]。然而,近年來對藏靈菇中乳酸球菌的研究比較少,特別是運用多種方法研究其中乳酸球菌成分的更少,即使有些文獻報道,但其研究手段主要采用傳統(tǒng)的鑒定方法。本研究采用傳統(tǒng)的生理生化試驗與16SrRNA基因序列分析、變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)、16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析等分子生物學技術相結(jié)合的多項分類手段對藏靈菇中的乳球菌進行了鑒定和研究,期望更全面、準確地對藏靈菇中乳酸球菌進行分離、鑒定和優(yōu)勢菌群分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源及模式菌株:2份藏靈菇樣品采集于西藏日喀則地區(qū)江孜縣東郊鄉(xiāng)和西藏那曲縣桑雄鄉(xiāng)。本試驗以購買自美國模式菌種培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的EnterococcusduransATCC19432作為試驗的參考菌株。

1.1.2各種培養(yǎng)基與試劑:改良MRS瓊脂培養(yǎng)基配方(g/L):大豆蛋白胨10,牛肉浸取物10,酵母提取物5,葡萄糖20,乙酸鈉5,檸檬酸三鈉2,吐溫1,磷酸氫二鉀2,七水硫酸鎂0.2,七水硫酸錳0.054,瓊脂15,放線菌酮1×103,蒸餾水1L。在原有配方中添加1g/L的放線菌酮從而達到抑制真菌生長的目的。TPY液體培養(yǎng)基,BLB液體培養(yǎng)基,以及其它生理生化試驗和糖發(fā)酵試驗所用培養(yǎng)基和試劑,參照文獻[9]配制。

1.1.3試驗主要儀器:試驗主要儀器:變性梯度凝膠電泳儀、PTC-200型梯度基因擴增儀,伯樂公司;電泳儀,Appliedbiosystem公司;TGL-16B高速離心機、TGL-16G-A型高速冷凍離心機,安亭公司;ND-1000型微量紫外分光光度計,Eppendorf公司;MLS-3780型全自動高壓蒸汽滅菌器,三洋公司;HHSI-NI恒溫水浴槽,北京長安科學儀器廠;DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海雷韻試驗儀器制造有限公司;DOC2000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng),北京六一儀器廠;本試驗所用引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成,具體引物序列見表1。

1.2方法

1.2.1菌株分離及保存:取經(jīng)過初步培養(yǎng)后的藏靈菇發(fā)酵乳1mL,用生理鹽水依次稀釋至105、106、107倍,每個稀釋度取0.1mL涂布于改良MRS瓊脂培養(yǎng)基,37°C厭氧培養(yǎng)48h,然后隨機選取典型菌落,進行培養(yǎng)、涂片、革蘭氏染色、鏡檢、過氧化氫酶實驗。凡過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性的球菌初步定為乳酸菌球菌,繼續(xù)在相應的培養(yǎng)基上劃線純化,如此重復3次,直至鏡檢為純培養(yǎng)物。將純化后的菌株于真空冷凍進行保存。

1.2.2乳酸菌球菌的生理生化鑒定:重新活化初步鑒定為乳酸球菌的菌株,據(jù)參考文獻[911]對供試菌株進行生理生化試驗和糖發(fā)酵試驗,對照菌株為LactobacilluscaseiATCC393、Lactococcuslactissubsp.cremonsATCC19257,由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供。

1.2.3菌株基因組DNA的提取:將供試菌株采用改良的CTAB-凍融方法提取菌株基因組DNA[12],即用液氮反復凍融后進行提取。

1.2.4變性梯度凝膠電泳:PCR擴增選用引物V3F和V3R[13],對供試菌株和參考菌株的16SrRNA基因的V3區(qū)進行擴增,選用引物V3FG+C和V3RG+C[14]。擴增反應體系(50μL)含如下成分:基因組DNA模板約50ng;dNTP(2.5mmol/Leach,TaKaRa)2μL;兩條引物V3FG+C和V3RG+C的終濃度均為0.4mol/L;1.5UDNATaq聚合酶(TaKaRa)0.5μL;10×PCRBuffer5μL。擴增反應程序:94°C5min;94°C40s,65°C50s,0.5°C循環(huán),72°C3min,共20個循環(huán);94°C40s,55°C50s,72°C3min,共10個循環(huán);72°C7min。將300ng擴增產(chǎn)物于8%的聚丙烯酰胺膠上進行分離,變性劑梯度范圍為27%52%(100%的變性劑包含7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺)。電泳在恒溫60°C下1×TAE緩沖液中進行,電壓200V,時間4h。電泳結(jié)束后進行銀染并對電泳圖譜進行分析。將銀染后的凝膠條帶小心切下,溶于100μLTE溶液中,過夜后取3μL該溶液作為再次擴增的模板,使用不含GC夾子的V3區(qū)引物進行擴增,而后將擴增產(chǎn)物測序。

1.2.516S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析:以供試菌株的DNA為模板,應用16S-23SrRNA間區(qū)引物L1和G17[15]進行PCR擴增。擴增反應體系(25μL)含如下成分:基因組DNA模板約50ng;dNTP濃度為200μmol/L;兩條引物L1和G17的濃度均為10pmol/L;DNATaq聚合酶1.5U;1×PCRbuffer。擴增反應程序:94°C2min;94°C30s,54°C30s,72°C1min,共30個循環(huán);72°C8min[16]。擴增16株供試菌株和1株參考菌株的16S-23SrRNA間區(qū)序列。將擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂凝膠在電壓60V的條件下電泳3h,而后將電泳凝膠用溴化乙錠(EB)染色并分析電泳結(jié)果。

1.2.616SrRNA基因序列分析:使用實驗室自主設計的引物A27F和A1495R對參考菌株的16SrRN段進行擴增,菌體擴增條件如下:94°C5min;94°C1min,58°C1min,72°C2min,共30個循環(huán);72°C10min。將擴增成功的PCR產(chǎn)物寄往上海桑尼生物科技有限公司測序,將測序結(jié)果運用DNAstar軟件進行序列拼接、校準、排齊。然后上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫并BLAST比對,最后應用MEGA4.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹并完成同源性分析。

2結(jié)果與分析

2.1乳酸球菌的傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果將革蘭氏陽性,過氧化氫酶試驗陰性的球菌進行生理生化試驗,試驗結(jié)果如表2、表3所示,根據(jù)參考文獻[911]將16株菌株歸為3個菌群:片球菌群、乳球菌群和腸球菌群。其中14株菌株都能在10°C、45°C、pH4.5、pH9.0、6.5%NaCl環(huán)境下生長,部分菌株能從精氨酸中產(chǎn)生NH3,大多數(shù)菌株能利用乳糖、果糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖、麥芽糖等,所以將14株菌株初步鑒定為腸球菌群(Enterococcus)。另外IMAU60189與片球菌屬的生理生化性質(zhì)相似,初步鑒定為片球菌群(Pediococcus),IMAU60193與乳酸球菌屬的生理生化性質(zhì)相類似,所以初步鑒定為乳球菌群(Lactococcus)。

2.216S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析為了進一步將菌株鑒定到種的水平,對分離到的16株菌進行了16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析。從圖2可以看出Lane1,Lane12與所選用耐久腸球菌的模式菌株處于不同的位置,而其它菌株的條帶與模式菌株處于相同的位置。

2.3變性梯度凝膠電泳分析結(jié)果為了驗證上述方法的準確性,本試驗又采用變性梯度凝膠電泳分析對16株菌株進行了鑒定。從圖3可以看出IMAU60193(Lane1),IMAU60189(Lane12)的條帶與參考菌株的條帶不在同一位置,而其他菌株的條帶與參考菌株處于同一位置,與16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析結(jié)果是一致的,所以我們將銀染后的凝膠不同位置的條帶切割回收并對其進行測序。通過測序可知Lane1的IMAU60193為乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubsp.lactis),Lane12的IMAU60189為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

2.416SrRNA基因序列分析將試驗中分離到的16株菌進行了16SrRNA基因測序,測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索(BLAST),并采用軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,比較已測序菌株與模式菌株的親緣關系,如圖3所示,從圖中可以看到14株分離菌株與耐久腸球菌的模式菌株親源性較近,IMAU60193與Lactococcuslactissubsp.lactis的模式株親緣性較近,IMAU60189與Pediococcusacidilactici的模式株親緣關系較近。試驗結(jié)果與DGGE測序結(jié)果相一致。

3討論

藏靈菇的多種保健作用,如藏靈菇具有抗炎癥作用[17],藏靈菇奶對慢性腸道疾病功能調(diào)節(jié)作用[18],所以目前國內(nèi)外對其微生物組成進行了一定的研究,藏靈菇中菌系十分復雜,但主要菌種為乳酸球菌、乳酸桿菌、醋酸菌和酵母菌,這些菌株相互依存在藏靈菇中形成了共生體系。而對藏靈菇中微生物的分離鑒定還是主要采用了傳統(tǒng)的生理生化試驗,但是由于藏靈菇中微生物菌群的復雜性,僅用傳統(tǒng)的方法還是無法準確地分析藏靈菇中微生物的結(jié)構,因此在本次試驗中我們采用了多項分類方法對藏靈菇中的乳酸球菌進行了鑒定,從而有效地彌補了傳統(tǒng)方法的缺陷,更準確的對其進行了鑒定。本試驗主要對西藏雪蓮中的乳酸球菌進行了分離,從2份樣品中分離得到了14株耐久腸球菌、1株乳酸片球菌、1株乳酸乳球菌乳酸亞種,從試驗結(jié)果可以看出耐久腸球菌是藏靈菇中的優(yōu)勢菌株,在相關的文獻中還未發(fā)現(xiàn)類似的報道,其他2菌株與相關文獻報道基本相同,表明不同來源的藏靈菇中優(yōu)勢菌群種類可能存在差異。腸球菌為革蘭氏陽性球菌,是一種條件致病菌,可引起心內(nèi)膜炎、菌血癥、尿道感染等疾病,且具有抗生素抗性。但是一些能產(chǎn)生細菌素的腸球菌卻可以作為益生菌應用于人們的日常生活中[19],作為一種食品中常見的乳酸菌,在肉制品和其他發(fā)酵食品中也可能起著重要作用。安全性是腸球菌應用中的首要問題,因此采用不同的方法準確鑒定耐久腸球菌在日常生活中有著重要的意義。由于耐久腸球菌的鑒定具有實際意義,所以選用準確的方法就尤為重要,目前還是主要應用傳統(tǒng)的分離純化鑒定方法,需要進行一系列繁雜的形態(tài)特征和生理生化試驗,卻不能對分離物進行精確的鑒定,不能反映分離物間的系統(tǒng)發(fā)育關系[2022],所以本試驗主要采用了傳統(tǒng)的鑒定方法和不同的分子生物方法相結(jié)合的多項分離鑒定方法對藏靈菇中的乳酸球菌進行了鑒定。從本次試驗結(jié)果中可知傳統(tǒng)的生理生化試驗可以將分離到的菌株鑒定到菌群的水平,由于一個菌群中包含了多個種和亞種,其中有些種和種之間,種和亞種之間的一些生理生化性質(zhì)也很相似,所以僅根據(jù)一些生理生化性質(zhì)我們無法準確的鑒定到種的水平,甚至是亞種的水平,而rRNA是研究細菌進化和親緣關系的重要指標,它含量大(約占細菌RNA總量的80%),并存在于所有細菌中,而且16SrRNA序列分析已經(jīng)成為細菌種屬鑒定和分類的標準方法,大約2500個種的16SrRNA全序列已經(jīng)被報。而且rRNA基因序列既具有保守性,又具有高變性,是目前細菌分類和鑒定中經(jīng)常測定的序列。

其中16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析、DGGE、16SrRNA序列分析作為近幾年主要的分子生物方法,這些分子生物方法可以很好地解決傳統(tǒng)的生理生化試驗無法準確鑒定到種的水平的缺陷。從16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析、DGGE電泳條帶中可以看到這兩種方法能有效快速的將16株菌株區(qū)分成3個不同的種,并通過16SrRNA基因測序最終將16株菌株全部準確的鑒定到種的水平。因此傳統(tǒng)的生理生化試驗并不能作為菌種分離鑒定的主要方法,而16S-23SrRNA間區(qū)序列多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和16SrRNA基因測序可適用于藏靈菇中乳酸球菌菌種之間的鑒定。藏靈菇可以作為天然發(fā)酵劑使牛奶變成酸奶,這種發(fā)酵劑含有多種乳酸菌和酵母菌,本文應用傳統(tǒng)生理生化和多種分子生物學方法相結(jié)合的惰性分類手段對藏靈菇中的乳酸球菌進行了準確鑒定和全面、可靠的研究,為研究和開發(fā)天然菌種發(fā)酵劑的乳酸菌資源奠定了良好的基礎。