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木質(zhì)纖維素范文第1篇

1發(fā)酵抑制物解除策

抑制物解除的基本策略按照處理對象的不同，可以分為3種：木質(zhì)纖維素物料脫毒、抑制物耐受菌篩選和過程控制優(yōu)化。

1.1木質(zhì)纖維素物料脫毒木質(zhì)纖維素物料脫毒是指針對酸解、堿解、汽爆等預(yù)處理后的物料，通過一定手段，去除抑制物的過程。目前木質(zhì)纖維素物料脫毒策略大體上可以分為物理法、化學法和生物法預(yù)處理3大類。物理法是直接去除水解液中的有毒物質(zhì)，而化學法和生物法在于將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)。目前，文獻已報道的物理法包括水洗法、蒸發(fā)法、吸附法、萃取法、離子交換法、電滲析法等。水洗法常用于去除汽爆預(yù)處理產(chǎn)生的可溶性發(fā)酵抑制物[9]。蒸發(fā)法是一種簡單地去除預(yù)處理水解液中乙酸和糠醛等揮發(fā)性抑制物的方法[10]。萃取法則是利用糖類與抑制物在萃取劑中溶解性的不同，用溶劑將抑制物從發(fā)酵溶液中分離出來，如采用乙酸乙酯萃取可以去除木質(zhì)纖維素水解液中56%的乙酸和所有的糠醛、香草醛和4-羥苯甲酸[11]。吸附法主要利用樹脂和活性炭具有的較強的吸附能力，去除水解液中的抑制物。一般地，脫毒的效果依次為陰離子交換樹脂>中性樹脂>陽離子交換樹脂[12]。在堿性條件下，陰離子交換樹脂能有效地去除陰離子和中性抑制物。活性炭對抑制物的去除效果受抑制物性質(zhì)、水解液pH、處理溫度和時間以及活性炭濃度的影響[13]。電滲析是將陰陽離子交換膜交替排列于正負電極之間，用特質(zhì)的隔板將其隔開，組成淡化和濃縮兩個系統(tǒng)，在直流電源的作用下，以電位差為推動力，利用膜材料的選擇透過性，把電解質(zhì)從溶液中分離出來，從而實現(xiàn)溶質(zhì)的分離、濃縮、精制和提純。雙極性膜是一種新型的離子交換復(fù)合膜。它由陽離子交換層(N型膜)和陰離子交換層(P型膜)復(fù)合而成，在直流電場的作用下將水離解，在膜兩層分別得到氫離子和氫氧根離子。雙極性膜電滲技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于酸的生產(chǎn)和回收工藝[14-15]。化學法主要是通過加入化學試劑使水解液中的抑制物形成沉淀或者通過調(diào)節(jié)pH使抑制物解離以去除毒性化合物的方法。目前應(yīng)用最廣泛的是1945年Leonard和Hajny[16]報道的過量堿法(Overliming)，即先向預(yù)水解液中加入Ca(OH)2，調(diào)節(jié)pH到9−12，使抑制物沉淀，經(jīng)過離心后再向得到的上清水解液中加入稀硫酸，調(diào)節(jié)pH到5.5。生物法是指利用酶或者微生物的降解作用以達到改變抑制物結(jié)構(gòu)、降低毒性的方法[17]。生物法可分為酶處理和微生物處理。由于酶具有專一性，所以酶處理只能去除特定的抑制物。漆酶對酚類化合物的去除作用是明顯的，但對于乙酸、糠醛和羥甲基糠醛無去除作用[18]。灰蓋鬼傘擔子菌CoprinuscinereusIFO8371生產(chǎn)的過氧化物酶在H2O2存在的情況下，可以將香豆酸、阿魏酸、4-羥基苯甲酸、香草醛、紫丁香醛、香草酸6種化合物轉(zhuǎn)化成高分子量化合物，從而提高拜氏梭菌Clostridiumbeijerinckii利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵丁醇的性能[19]。微生物脫毒指的是利用絲狀軟腐菌Trichodermareesei等微生物，去除水解液中乙酸、糠醛和安息香酸衍生物等的方法。例如，利用絲狀軟腐菌處理蒸汽爆破預(yù)處理過的柳樹半纖維素水解液，乙醇的產(chǎn)率可以提升3−4倍[20]。不同抑制物去除方法的優(yōu)缺點對比見表1。

1.2抑制物耐受菌選育物理、化學或生物等脫毒方法只能部分去除纖維素水解液中的抑制物，無法完全克服抑制物對宿主細胞的毒害作用，并且生物脫毒的費用一般占到總投入的30%−40%，幾乎是木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中投入最大的一項工序，使得諸如丁醇等發(fā)酵產(chǎn)物進一步降低了自己在同類產(chǎn)品中的競爭力[21]。因此，從發(fā)酵微生物本身出發(fā)選育高耐受的菌株，則成為解決底物抑制物問題的另一種有效方法。根據(jù)育種方式的不同，可以分為傳統(tǒng)誘變、代謝工程和合成生物學。傳統(tǒng)誘變是指通過一些強烈的化學誘變因子，如甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝基胍(NTC)、丙烯醇等，以及紫外線等物理誘變條件對出發(fā)菌進行誘變以獲取抑制物耐受菌株的方法。由于單一的誘變方法具有菌種性狀不穩(wěn)定、突變方向隨機等缺點，最近幾年的研究多集中于復(fù)合誘變和菌種馴化。復(fù)合誘變是指利用多種誘變劑同時或者依次對出發(fā)菌進行處理。誘變劑的復(fù)合處理有一定的協(xié)同誘變效應(yīng)，能增強誘變效果，并能將多種優(yōu)良性狀集中于同一菌株[22]。馴化是指讓細胞長期在某一環(huán)境下生長，使其能夠適應(yīng)并具有良好性狀的進化過程。馴化是在對機理知識理解不足的情況下獲得具有目標特性菌株的有效方法。丁明珠等以釀酒酵母為出發(fā)菌種，通過紫外誘變結(jié)合馴化的方法篩選出1株對于糠醛、苯酚和乙酸都有很強耐受能力的菌株[23]。Keating等[24]利用糠醛、5-羥甲基糠醛和乙酸溶液對釀酒酵母進行馴化，得到了一株在纖維素水解液中具有良好發(fā)酵效果的酵母菌株。Liu等[25]也利用馴化的方法得到了能耐受糠醛的酵母菌株，從而實現(xiàn)了對纖維素水解液中糠醛抑制物的原位脫毒。分子生物學技術(shù)的發(fā)展，使得產(chǎn)溶劑梭菌代謝工程改造成為了可能，外源基因和調(diào)控因子的引入，使代謝工程有別與傳統(tǒng)意義上的菌種改造。利用重組技術(shù)調(diào)控細胞中酶反應(yīng)、優(yōu)化代謝物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)運，可以有效增強宿主細胞對于抑制物的耐受能力。楊雪雪[26]對釀酒酵母同源二倍體單基因缺失株文庫進行篩選，經(jīng)過初篩、復(fù)篩、驗證等步驟，得到了163個糠醛抗性相關(guān)基因，并成功構(gòu)造出雙倍體單基因缺失株siz1/siz1，dep1/dep1，sap30/sap30和單倍體單基因缺失株siz1，dep1，sap30菌株，其對10mmol/L糠醛的抗性比各自相應(yīng)的野生型菌株要高出100倍。Li等[27]利用酵母全基因組表達譜芯片，研究了釀酒酵母在轉(zhuǎn)錄組水平上對糠醛和醋酸的代謝響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)增強HMG1基因可以提高胞內(nèi)糠醛的轉(zhuǎn)化效率，從而增強菌體的耐受能力。Gorsich等[28]通過對釀酒酵母單基因突變體庫的篩選找到62種與糠醛耐受性相關(guān)的基因。過表達其中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因ZWF1后，釀酒酵母可以在高濃度的糠醛下生長，這可能是因為過表達ZWF1使得葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性增加，為糠醛還原酶或依賴NADPH的脅迫應(yīng)激酶類提供了更多的還原動力(NADPH)，進而提高了菌體耐受性。目前為止，所得到的各種抑制物耐受菌大多是通過馴化或者傳統(tǒng)誘變篩選得到的。由于抑制物對于宿主細胞的抑制機理還不明確，很難通過定向設(shè)計獲得具有高耐受性的菌種。因此，深入了解水解液中抑制物與細胞的相互作用關(guān)系，揭示細胞的脫毒機制，進而定向改造菌株，是當前代謝工程亟待解決的問題。

2新型抑制物解除工藝傳統(tǒng)預(yù)處理方法

[29-31]、菌種改造[24]等方法，對于突破木質(zhì)纖維素抑制物瓶頸、實現(xiàn)木質(zhì)素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是必不可少的[32]。但它們只專注于單一的技術(shù)突破，忽略了木質(zhì)纖維素本身所具有的結(jié)構(gòu)特點[33]。實際上，木質(zhì)纖維素獨特的組成特點，可以為我們提供新的研究思路[34]；基于此，陳洪章課題組提出了“源頭降低抑制物——纖維素木質(zhì)素分級轉(zhuǎn)化”煉制模式，為木質(zhì)纖維素的開發(fā)和利用，探索出了一條全新的工藝路線；并在此基礎(chǔ)上，進一步提出了“原位脫毒——發(fā)酵促進劑設(shè)計技術(shù)”，它們共同組成了當前最新型的抑制物解除工藝。

2.1源頭降低木質(zhì)纖維素抑制物的分級轉(zhuǎn)化煉制工藝木質(zhì)纖維素原料具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不均一的多級結(jié)構(gòu)。從細胞組成上，可以分為纖維狀的纖維細胞和雜細胞(包括導(dǎo)管、薄壁細胞、表皮細胞等)。纖維細胞木質(zhì)素含量較高，具有較發(fā)達的次生壁，因此厚度較大。薄壁細胞腔大、壁薄、長度短，其成分主要為纖維素[35]。由于結(jié)構(gòu)和形態(tài)上的差異，這兩類細胞所要求的預(yù)處理條件也是不同的[21]。纖維細胞，細胞壁木質(zhì)化程度高，結(jié)構(gòu)致密，受熱過程中傳質(zhì)熱阻力大，且不易被撕裂；薄壁細胞，壁薄而腔大，即有利于傳質(zhì)傳熱，有利于水蒸氣閃蒸對其物理撕裂。因此，針對不同組織細胞分別優(yōu)化處理條件，開發(fā)出了二段汽爆分梳技術(shù)。其具體的工藝過程如下：1)將汽爆壓力控制在0.5−1.0MPa、維壓1−10min，對秸稈原料進行第一段蒸汽爆理。2)通過氣流分級裝置，將第一段汽爆物料進行分級，得到薄壁組織和纖維組織。薄壁組織可以直接用于纖維素發(fā)酵。3)將分梳得到的纖維組織在壓力為1−1.5MPa、維壓時間為1−10min條件下進行二段蒸汽爆理。二段汽爆分梳工藝，不同于傳統(tǒng)所指的二段汽爆工藝，前者采用較溫和的汽爆條件進行第一段汽爆，通過氣流分梳裝置將第一段物料(薄壁細胞)分級，得到薄壁組織和纖維組織，再將纖維組織在適當?shù)臈l件下進行第二段汽爆。該工藝可以實現(xiàn)纖維素組分的有效分離，即能保證纖維組織達到較好的預(yù)處理效果，提高纖維原料的酶解效果，又能避免薄壁細胞的過度降解，從源頭控制了抑制物的產(chǎn)生，減少了脫毒單元操作的引入，簡化了工藝。在二段汽爆以后，將汽爆后的秸稈渣送入1.2m3酸水解罐中，同時加入0.3%−0.5%的稀硫酸，物料和稀硫酸的體積比控制在1∶5−1∶7，在110−120℃的溫度下水解0.5−1.0h，然后利用螺旋擠壓機將水解液中的液體和固體分開，分別得到水解液和水解渣。水解液主要成分為非半纖維素，水解渣中主要為木質(zhì)素和纖維素。繼而采用2%的堿液提取殘渣中的木質(zhì)素，提取率可達96%，隨后利用逐級酸性沉淀(pH5−2)分級木質(zhì)素的方法，可以制得小于6kDa，6−10kDa，10−20kDa和大于20kDa等不同分子量范圍的木質(zhì)素，用于不同功能原料的開發(fā)。本課題組的研究發(fā)現(xiàn)，汽爆秸稈酶解液中并不存在糠醛、5-羥甲基糠醛與乙酸的抑制問題，而汽爆秸稈木質(zhì)素降解物才是抑制丁醇發(fā)酵的主要原因[36]。由于從源頭去除了木質(zhì)素對于半纖維素和纖維素發(fā)酵的干擾，發(fā)酵液中的抑制物種類較少，濃度較低，經(jīng)過簡單脫毒(5%−10%的活性炭吸附室溫下處理8−12h)，即可用于正常的丁醇發(fā)酵。基于以上重大技術(shù)突破，組建出與其技術(shù)相配套的自主加工的工業(yè)化裝置系統(tǒng)，完成了年產(chǎn)600t秸稈丁醇中試實驗。所建立的技術(shù)工藝在中國吉林省松原市成功用于“30萬t/年秸稈煉制”產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。該生產(chǎn)線將為秸稈作為工業(yè)原料生產(chǎn)能源、材料和化學品提供新的思路和產(chǎn)業(yè)化示范。該工藝有以下幾個特點：1)可以從源頭降低抑制物的產(chǎn)生，簡化了操作工序，降低了預(yù)處理的成本。2)通過組分分離，保證了發(fā)酵底物的純度，提高了溶質(zhì)的傳質(zhì)速率和酶的接觸面積，提高了發(fā)酵效率。3)實現(xiàn)了秸稈全組分高價化經(jīng)濟全利用，通過經(jīng)濟分攤，增加了木質(zhì)纖維素的經(jīng)濟競爭力。本實驗室所提出的“源頭降低抑制物——纖維素木質(zhì)素分級轉(zhuǎn)化”煉制模式，為木質(zhì)纖維素發(fā)酵抑制物的解除及木質(zhì)纖維素開發(fā)利用提供了全新的技術(shù)路線。

2.2基于木質(zhì)纖維素發(fā)酵特點的過程強化工藝從發(fā)酵微生物本身出發(fā)，通過增加發(fā)酵液殊的物質(zhì)，來提高微生物細胞對抑制物的耐受能力；或者選育出能夠耐受木質(zhì)纖維素水解液中各種抑制物，并具有較高發(fā)酵性能的微生物，以達到脫毒的目的，這種方法通常被稱為抑制物的原位脫毒。在木質(zhì)纖維素發(fā)酵過程中，往往微量級別(mg/L)的“特殊物質(zhì)”，就可以實現(xiàn)目標產(chǎn)物發(fā)酵效率的成倍增長，具有巨大的開發(fā)價值。這些“特殊物質(zhì)”稱為發(fā)酵促進劑，大多數(shù)屬于電子穿梭化合物，即具有多種氧化態(tài)和還原態(tài)的物質(zhì)。它們在細菌代謝過程中扮演著重要的角色。外源添加這種電子穿梭化合物，可以改變胞內(nèi)的電子流向，提高電子傳遞速率，進而理性調(diào)控生物胞內(nèi)的能量狀態(tài)和生理狀態(tài)，提高菌體的耐受性和目標產(chǎn)物的合成能力。常見的電子穿梭化合物，包括中性紅、亞甲基藍、聯(lián)芐吡啶、二磺酸蒽醌、Fe(OH)3和甲基紫精等。二磺酸蒽醌常用作腐殖酸的類似物，用于研究醌類物質(zhì)在電子傳遞中的作用。外源添加還原性的二黃酸蒽醌可以改變Clostridiumbeijerinckii的代謝模式，提高H2的產(chǎn)量。Fe(OH)3是最常用的氫氧化物，在厭氧發(fā)酵中是良好的電子載體；甲基紫精同鐵氧化還原蛋白的電勢相似，可以參與一系列生化反應(yīng)過程中的電子傳遞過程，通過鐵氧化還原蛋白-NAD還原酶增強NAD(P)+的電子流。1979年，Hongo等[37]首次提出了“電子能方法”(Electroenergizing)的概念，他們向黃色短桿菌Brevibacteriumflavum菌發(fā)酵液中添加中性紅(電子載體)，發(fā)現(xiàn)谷氨酸的產(chǎn)量明顯提高，而且從陰極傳遞的電子幾乎全部被宿主細胞吸收。遺憾的是，他們并沒有深入研究這些電子如何進入生化代謝途徑。Yarlagadda等[38]通過外源添加甲基紫精，使得Clostridiumsp.BC1的乙醇和丁醇產(chǎn)量分別提高了28倍和12倍，同時菌體對于丁醇等物質(zhì)的耐受性明顯提升。Liu等[39]認為這些物質(zhì)與胞內(nèi)的NADPH/NADP+和NADH/NAD+總比例有著直接的聯(lián)系，NADPH/NADP+和NADH/NAD+總比例是主導(dǎo)胞內(nèi)代謝狀態(tài)的最主要因素。生物信息數(shù)據(jù)庫KEGG中包括855和1064個氧化還原反應(yīng)，分別有106和88種以NAD+和NADP+為輔因子的酶催化反應(yīng)(到2012年10月為止)，幾乎涉及所有細胞骨架類化合物的構(gòu)建(如氨基酸、脂類和核酸)。通過改變胞內(nèi)NADH的水平可以實現(xiàn)胞內(nèi)代謝流的調(diào)控，提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量，增強菌體的抑制物耐受性。遺憾的是，目前對于發(fā)酵促進劑的研究，主要集中于抑制物耐受機理的闡明，實驗過程中多采用合成培養(yǎng)基，而實際生產(chǎn)方面的應(yīng)用幾乎沒有開展?；诖耍覀兟氏乳_展了電子載體物質(zhì)、氧化還原物質(zhì)與木質(zhì)纖維素抑制物原位脫毒關(guān)聯(lián)性的研究，利用秸稈水解液進行了實驗驗證，取得了良好的發(fā)酵結(jié)果；首次提出了“發(fā)酵促進劑設(shè)計技術(shù)”理念，綜合運用前體工程、理論化學、計算化學和計算機輔助模擬等手段，構(gòu)建出促進劑開發(fā)平臺技術(shù)，為傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝提出了新的研究思路。其主要內(nèi)容為：首先，運用組合化學手段，對已有的發(fā)酵促進劑進行歸類分析，獲取其決定作用的“母核”，然后運用虛擬組合庫進行大通量篩選。虛擬組合庫主要出自3個來源：一種是基于分子片段的直接枚舉而產(chǎn)生的新的分子庫；一種是基于反合成分析原理的片段化及重組而產(chǎn)生的新分子庫；另一種是基于分子構(gòu)象疊合和遺傳算法中的雜交原理的分子重組而產(chǎn)生的新的分子。目前，已經(jīng)成功完成了系列產(chǎn)品的研發(fā)，即將進行實際發(fā)酵的生產(chǎn)驗證。

3展望

木質(zhì)纖維素范文第2篇

    關(guān)鍵詞:山莊樹木花卉;植物造園藝術(shù)??

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    隨著國內(nèi)經(jīng)濟的迅猛發(fā)展,人們的生活質(zhì)素不斷提高,逐步增強向往回歸大自然的心態(tài),因而園林山莊建造雨后春筍,到處可見。其中山莊園林創(chuàng)造豐富多彩的樹干花卉起著重要的造園藝術(shù),對提高山莊園林藝術(shù)和功能等方面,都占一定的作用。?

    1. 樹木花卉的有機布置,極大豐富了園林景色?

    在現(xiàn)代造園景色中,樹木花卉是經(jīng)濟的,受地形、地勢等自然條件的限制也比較小,構(gòu)圖靈活,空間富于變化,而且可以通過色、香、味、型等直接作用于人的感官,感染力強。所以,樹木花卉歷來為造園藝術(shù)的一種重要手法。?

    樹干花卉是園林景色一種造園手法。如我國著名的避暑山莊在造園中,“萬軒松風”是以樹之聲——松濤為風景主題的;“青楓綠嶼”與“金蓮映日”是以葉色和花色組織風景構(gòu)圖的?！袄湎阃ぁ?、“香遠益清”、“曲水荷香”等是利用荷花的芳香,作為園林風景題材的。其它,如“西嶺晨霞”、“遠近泉聲”等,也是以樹木花卉與其它園林素材相結(jié)合,組織風景構(gòu)圖的。這樣起來,幾乎山莊的每一“景”都與樹木花卉有關(guān)。正是由于樹木花卉為園林提供了豐富多彩的風景素材,從而大大豐富了園林景色。?

    2. 樹木花卉的合理布局,提高了對園林風景的藝術(shù)欣賞?

    山莊以松樹為骨干樹種,強調(diào)了全園,使整個園林形成了一個宏偉的藝術(shù)整體,加強了園林風景構(gòu)圖的和諧強統(tǒng)一。同時,大量引種各地有代表性的樹木花卉,展示各地自然風貌。通過園林手法,反映了在風景構(gòu)圖中,加強了園林藝術(shù)形式和內(nèi)容的統(tǒng)一。樹木花卉與山水等自然素材相結(jié)合,形成了森林、平原、溪流等許多自然景色,眾多的樹木隱蔽了樓臺、亭閣等人工建筑,使園內(nèi)與園外的自然山林,從空間上連成一個藝術(shù)整體。這些都有力地渲染了園林的自然風采。?

    樹木花卉還有力地加強了山莊園林風景構(gòu)圖的節(jié)奏感。任何藝術(shù)都要有一定的韻律,要有節(jié)奏感,它對藝術(shù)品起著豐富和變化的作用。否則,藝術(shù)的統(tǒng)一就會變得呆板,這是形式美的法則之一,也是園林風景構(gòu)圖的藝術(shù)標準之一。?

    樹木花卉有力地顯示了地形的錯綜復(fù)雜變化。古人曾說:“山借樹為衣,樹借山而為骨”,這也適用于園林風景的布置。當山莊建造在山嶺環(huán)抱的位置之中,松蒼翠,峰嶺滴翠,不同的樹種,各具姿容,顯示不同的特點,從而使人強烈感覺到山巒的起伏變化。?

    山莊園林樹林花卉可以利用不同的栽植方法,以加強風景構(gòu)圖的節(jié)奏感。若采用行列栽植法,給人以整齊莊重的感覺。而湖岸、山巒區(qū)則采取隨地勢而自由散植的方法,給人以輕松閑適的感覺。?

    利用樹木花卉型體、葉狀的變化,加強風景構(gòu)圖的節(jié)奏感,也是造園慣用的一種手法。若山莊區(qū)內(nèi)松樹體型高大挺拔,湖岸的垂柳多姿,湖中的荷花隨波蕩漾于水面,平坡區(qū)的綠草平鋪如織……它們不同的體態(tài),形成了一種天然韻律。松葉如針、柳葉如眉、楓葉如掌、楊葉闊園,這樣多不同的葉狀,也是一種自然節(jié)奏。

    花色、葉色的變化,也是一種節(jié)奏。金蓮花燦若黃金,紅荷美若丹霞,敖漢白蓮浩白雪,風葉如丹……這是造園用植物色彩的變幻,譜出的一部動感樂章。?

    利用樹木花卉以應(yīng)時令,是傳統(tǒng)的園林手法之一。在這方面,山莊也有獨到之處。梨花為山莊早報春訊,荷花怒放恰當夏炎炎,如丹楓葉為金秋添色,傲雪蒼松是嚴冬的勝景。它們顯示著季節(jié)的交替,是一種時間節(jié)奏感。?

    3. 對“宜人調(diào)養(yǎng)之功”的園林“小氣候”的形成,起了重要的作用?

    園林是人們進行生活和休息的環(huán)境之一,應(yīng)該滿足人們衛(wèi)生防護、文化休息等功能的基本要求。適應(yīng)人們生活、休養(yǎng)的園林“小氣候”是園林藝術(shù)的重要因素之一,樹干花卉對提高山莊這方面的功能,也是有著重要的作用。 凈化空氣:一是吸收有害氣體。呼出人類所需要的氧氣。根據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)顯示,一畝林每天約吸收60公斤二氧化碳,呼出40公斤氧氣。一個山莊如果按1000畝林計算,在樹木生長期內(nèi),每天約吸收65噸二氧化碳,呼出43噸氧氣;二是殺死細菌。很多樹木在其生長發(fā)育過程中,分泌出大量揮發(fā)性殺菌素。據(jù)測算,一畝松林一個月能分泌約60公斤殺菌素,如果按1000畝松林計算,每月可分泌約65噸殺菌素,可以殺死大量的結(jié)核、傷寒、白喉、痢疾等病菌;三是吸收灰塵?；覊m是人類健康的大敵,它吸附的許多有毒的金屬籽子進入體后,可以引起各種疾病。而樹木樹葉多,樹冠大,可以降低風速,減少飛塵,樹木的枝干和葉片表面粗糙有毛細氣孔,能分泌粘液和油脂,可吸附大量的灰塵。據(jù)有關(guān)資料測算,一畝林每年可吸收各種灰塵20-60公斤,如果山莊按1000畝林計算,每年可吸附各種灰塵40噸~150噸。?

木質(zhì)纖維素范文第3篇

1.秸稈資源現(xiàn)狀

木質(zhì)纖維素類生物資源是世界上最多的可再生資源，全世界每年的產(chǎn)量估計為1010噸，其中秸稈占可利用生物質(zhì)產(chǎn)量的70%左右。在中國，農(nóng)作物秸稈的年產(chǎn)量為8.42×108噸，而且以1.3%的速度遞增，在農(nóng)作物秸稈中玉米秸稈所占的比例最大，為24%，目前國內(nèi)秸稈中，直接用作生活燃料的約占20%，用作肥料還田的約占15%，用作飼料的約占15%，用作工業(yè)原料的約占2%，其余被廢棄或直接燃燒的約占48%，這造成了極大的資源浪費和環(huán)境污染。國內(nèi)外的專家學者對秸稈資源經(jīng)濟有效的利用方法進行了大量研究，但到目前為止，國內(nèi)對秸稈資源在飼料中的應(yīng)用研究相對較少。

2.秸稈的生物質(zhì)特性及營養(yǎng)組成

2.1 秸稈的生物質(zhì)特性 木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大類主要的聚合物組成。一般條件下，纖維素不易溶于水、有機溶劑、堿以及稀無機酸溶液，僅在不加熱的條件下用濃無機酸處理，或者在高溫高壓條件下，用稀無機酸處理，纖維素才被分解為單糖。半纖維素是一類復(fù)雜的碳水化合物的組成結(jié)構(gòu)，草類和秸稈中的主要半纖維素是木聚糖，木材中的主要半纖維素是葡甘露聚糖。在細胞壁中半纖維素位于許多纖維素和木質(zhì)素之間，組成纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的緊密結(jié)構(gòu)。半纖維素在酸性和堿性環(huán)境中最容易被提取，而葡甘露聚糖在酸性環(huán)境下幾乎不能被提取出來，必須在強堿的作用下才能分離。在木質(zhì)纖維素的所有結(jié)構(gòu)中，半纖維素是對熱化學因素最敏感的成分。木質(zhì)素在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素和半纖維素，是一類由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元組成的無定型復(fù)雜復(fù)合物，木質(zhì)素在植物細胞壁中起著結(jié)構(gòu)支撐，保持細胞壁的不通透性，抵抗微生物攻擊和抗氧化等作用，所有這些特性，使木質(zhì)素成為植物細胞壁中最難降解的成分。木質(zhì)素和半纖維素形成牢固結(jié)合層，緊緊地包圍著纖維素，阻礙酶和其他物質(zhì)與纖維素的接觸。因此，在木質(zhì)纖維素的預(yù)處理過程中，木質(zhì)素的去除是非常重要的。

2.2 秸稈的營養(yǎng)組成 秸稈是脫粒后成熟植株的殘余物。當植物成熟時，在莖和葉中只剩下少量的蛋白質(zhì)、脂肪、類脂肪和易消化的碳水化合物，家畜營養(yǎng)所必須的各種礦物質(zhì)的含量顯著減少。維生素，特別是胡蘿卜素幾乎全部被破壞。未經(jīng)處理的秸稈適口性較差，體積較大，且動物的消化利用率較低。秸稈的化學成分主要是纖維性物質(zhì)，以干物質(zhì)計，中性洗滌纖維（ND）約為70%～80%，酸性洗滌纖維（ADF）約為50%～60%，粗蛋白含量約為3%～6%。

3.秸稈資源的預(yù)處理研究進展

秸稈預(yù)處理的目的是提高秸稈的消化率，使其在水解過程中能夠釋放出較多的糖類。目前，許多秸稈預(yù)處理方法已經(jīng)被研究和應(yīng)用，秸稈預(yù)處理過程要求能夠有效提高秸稈的消化率并且產(chǎn)生較少的抑制因子。秸稈的處理方法有物理處理、化學處理、物理化學綜合處理和生物處理法，在實際生產(chǎn)中通常采用不同方法的組合來獲得最大的糖釋放量、最低的毒素產(chǎn)量和能量消耗。

3.1 物理處理 物理處理能夠降低秸稈的尺寸，提高秸稈的可接觸面積，降低秸稈纖維素的晶度和聚合度，提高后處理過程的效率。物理預(yù)處理方法包括機械粉碎處理、熱處理、微波處理等。機械粉碎是降低秸稈尺寸的最基本的預(yù)處理步驟，能夠有效提高后續(xù)處理的效率，粉碎處理通常是切斷、粉碎和磨碎等綜合處理，處理后的最終尺寸不盡相同。秸稈的水分含量、成分以及最終粉碎的尺寸均影響能量的需要和后續(xù)處理效率，原料的水分含量越高，粉碎的尺寸越小，需要消耗的能值越高；熱處理是秸稈預(yù)處理的常用方法。熱處理的溫度超過150℃～180℃，秸稈中的物質(zhì)開始溶解，半纖維素首先釋放出來，接著部分木質(zhì)素也開始溶解；微波作為一種方便、高效和清潔的能源，不同于傳統(tǒng)的熱處理方法，對于某些化學反應(yīng)可以大幅提高反應(yīng)速度，已廣泛地用于有機合成、化學催化及高分子聚合等反應(yīng)過程。運用微波對植物纖維原料進行預(yù)處理可降解木質(zhì)素和半纖維素，改變植物纖維原料超分子結(jié)構(gòu)，使纖維素結(jié)晶區(qū)尺寸發(fā)生變化，提高植物纖維素酶的水解效率。

3.2 化學處理 秸稈的化學預(yù)處理包括酸處理、堿處理以及H2O2和SO2等氧化劑的處理。在所有這些方法中稀H2SO4預(yù)處理是被廣泛應(yīng)用的方法。酸處理的主要目的是轉(zhuǎn)化半纖維素，使纖維素更易被酶解。酸處理有稀酸處理和濃酸處理2種。濃酸處理可以在室溫下進行，得到較高的糖產(chǎn)量，但是濃縮處理過程產(chǎn)生抑制因子，影響后續(xù)反應(yīng)，加上樣品中較高濃度的酸和設(shè)備腐蝕等，極大地限制了該處理方法在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。稀酸處理使一些木糖類等主要的半纖維素溶解，并且轉(zhuǎn)化為可溶性糖類。然而，在稀酸水解過程中，半纖維素在較低的溫度下可以發(fā)生解聚，抑制后續(xù)發(fā)酵過程中微生物的生長；用于堿處理的堿包括氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀和氨水等，氫氧化鈉是所有堿處理試劑中研究最多的，是玉米秸稈預(yù)處理的最佳方法。但氫氧化鈉在實際生產(chǎn)中的使用成本相對較高，而且對動物生產(chǎn)存在一定的安全隱患。氫氧化鈣也是廣泛應(yīng)用的一種堿處理試劑，能夠去除秸稈中的木質(zhì)素，提高秸稈的結(jié)晶度，通過去除秸稈中的木質(zhì)素提高纖維素的可接近度和酶的作用效果。但實際生產(chǎn)研究結(jié)果表明，隨著時間的增加，經(jīng)氫氧化鈣預(yù)處理的秸稈容易受到霉菌的污染；氧化劑處理。木質(zhì)纖維素在H2O2和過乙酸等氧化劑的作用下能夠發(fā)生氧化降解作用，去除其中的木質(zhì)素和半纖維素，使纖維素容易被酶和微生物作用。但氧化劑的作用通常沒有選擇性，在木質(zhì)素被氧化的同時，纖維素和半纖維素通常也有一定的損失，并且木質(zhì)素被氧化的同時也產(chǎn)生一些酚類化合物，抑制后續(xù)的生物轉(zhuǎn)化。

3.3 物理化學綜合處理 木質(zhì)纖維素成分的降解與溫度、pH值和壓力等因素有關(guān)，是物理化學因素綜合作用的結(jié)果。許多的熱處理都屬于物理化學綜合處理，在熱處理中，如果室溫升到150℃～180℃以上，在木質(zhì)纖維素的成分中，半纖維素（主要包括木聚糖和葡甘露聚糖）是對熱最敏感的成分，首先開始降解，然后是木質(zhì)素開始溶解，一部分半纖維素被水解并形成酸性物質(zhì)，這些酸進一步催化半纖維素的水解。熱處理在降解半纖維素的同時，會降解一部分的木質(zhì)素，產(chǎn)生的降解復(fù)合物通常包括酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)在許多情況下是細菌、酵母等其他微生物生長的抑制因子。蒸汽爆破、液體熱水處理和酸堿的熱處理是常用的物理化學綜合處理方法。

3.4 生物處理 生物處理與其他預(yù)處理方法相比，消耗較少的化學物質(zhì)和能量，是一種生物安全、環(huán)境友好的秸稈處理方式，目前很多的研究都在尋求一種可控制的、快速有效的生物處理方法。微生物發(fā)酵處理。用微生物來提高秸稈的質(zhì)量是很有前景的秸稈處理方法。在自然界中有許多細菌和真菌可以利用天然的木質(zhì)纖維素類；酶水解處理。酶水解纖維素通常具有高度的針對性，纖維素被水解后，通常會產(chǎn)生葡萄糖等一些糖類物質(zhì)，酶類發(fā)酵秸稈通?？梢栽诒容^溫和的條件下進行，和酸堿處理秸稈相比，成本較低且不會腐蝕機器設(shè)備。

木質(zhì)纖維素范文第4篇

關(guān)鍵詞：生物乙醇 纖維素酶 工程菌株

The study and development progress of Bio-ethanol and cellulase production

Liping Yang1 Shuiwen Cai1 Ling Luo1 Hui Liu1，2

1. Changsha Environmental Protection and Professional technique College, 410004 2 Hunan

2. Agricultural university, 410128, Changsha, China

Abstract: With the fossil fuels from shortage to exhaustibility, the humanity is facing toward a common problem in energy crisis. Finding new energy sources is important to sustainable economic development and even human survival. Bio-ethanol, as an energy source that is renewable, affordable, and environmentally safe, will become a substitute for oil. Elevation of cellulase production and reduction of the cellulase production cost are the key factor for enhancing the market competitiveness of cellulosic bioethanol. In this paper, we discussed the development progress of bio-ethanol and cellulose industry to provide a basis for the future upgrading of bio-ethanol production industry and the development of gene engineering strain.

Keywords: bio-ethanol cellulose engineering strain

隨著石化燃料由短缺變成枯竭，能源危機是人類面臨的共同問題。1998年，Campbell和Laherrere對石油儲備和未開發(fā)的石油進行評估后認為，天然油在2010年前的產(chǎn)量就開始下降，到2050年全球每年石油供應(yīng)量將從目前的25億桶下降到5億桶[1]。隨著石化燃料供應(yīng)的減少，尋找新的能量來源關(guān)系到經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展乃至人類的生存問題。生物乙醇作為一種可再生的、經(jīng)濟上可承受的，并且對環(huán)境安全的能源物質(zhì)將逐漸成為石油的替代品[2]。生物乙醇的生產(chǎn)經(jīng)歷了以1代淀粉原料生產(chǎn)乙醇和以木質(zhì)纖維素為代表的非淀粉原料的2代生物乙醇工業(yè)。2代生物乙醇生產(chǎn)克服不與食品的供應(yīng)之間存在競爭，但是纖維素酶產(chǎn)量低、不穩(wěn)定、難以工業(yè)化導(dǎo)致2代生物乙醇的生產(chǎn)成本大大提高。本文從生物乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程、木質(zhì)纖維質(zhì)物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的市場前景及纖維素降解酶的研究進展進行綜述，為生物乙醇生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的提升、纖維素工程菌的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

生物乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程

從上世紀80年代開始，人們就開始以谷物為原料來生產(chǎn)乙醇用作供氧燃料，這些被業(yè)內(nèi)稱為第1代燃料乙醇的原料。在一些國家，如美國、加拿大、巴西、中國等，乙醇已經(jīng)被廣泛地摻入到汽油中來代替純汽油使用，其中乙醇的體積含量可達到10%。最近美國正在實施一項混合燃油計劃E85，即汽車制造商生產(chǎn)一種可使用乙醇混合物E85（85% 的乙醇和15% 的汽油按體積比混合）的汽車[3]。巴西早在1929年就建立了一項利用乙醇作為發(fā)動機燃料的計劃，并在接下來幾年里安裝了第一個使用乙醇作為燃料的發(fā)動機。1984年，巴西要求新生產(chǎn)的汽車能使用水化生物乙醇（96%的生物乙醇+4%的水）作為燃料[3]?；旌先剂系氖褂貌粌H可以減少汽油的使用量，還可以降低溫室效應(yīng)氣體以及有毒氣體的釋放。

但是隨著世界人口的不斷增長，以谷物等第1代淀粉原料生產(chǎn)乙醇就與食品的供應(yīng)之間存在競爭，這些谷物為原料生產(chǎn)乙醇就不能滿足全球的需求。中國在過去三十年中GDP的年平均增長量為10%，這使得中國成為世界上最大的燃料消費國之一，同時也成為世界上造成空氣污染最嚴重的國家。由于大部分的能源由燃燒化石燃料提供，中國政府正努力解決諸如國內(nèi)因迅速枯竭的石油和天然氣資源而越來越依賴進口石油來滿足國內(nèi)一半的實際需求[4]，以及嚴重的環(huán)境污染等問題。為了改善現(xiàn)狀，中國政府決定增加使用能源的種類，尤其提倡使用可再生的、排放更少溫室氣體的燃料，如乙醇這樣的生物燃料和生物柴油。由于生物燃料從諸如玉米、木薯、大豆這樣的農(nóng)產(chǎn)品中提取而來，這對改善中國農(nóng)村人口的經(jīng)濟狀況有積極影響。除了向乙醇生產(chǎn)者發(fā)放津貼以鼓勵乙醇的生產(chǎn)之外，中國政府近年來也強制要求中國十個省份必須銷售濃度為10%的乙醇汽油，這些措施使得中國2008年的乙醇產(chǎn)量迅速達到14.6億升且在2010年達到21.5億升，一舉成為繼美國和巴西之后的世界第三乙醇生產(chǎn)大國。盡管中國政府之前要求到2020年國內(nèi)乙醇的年消費量要達到100億升，然而由于擔心乙醇生產(chǎn)可能與食物生產(chǎn)行業(yè)形成競爭，且考慮到國內(nèi)農(nóng)村可用耕地數(shù)量有限，以及水資源供應(yīng)短缺的問題，中國政府于2007年宣布暫停國內(nèi)谷物乙醇的生產(chǎn)。

為了解決這個矛盾，以木質(zhì)纖維素為代表的非淀粉原料成為生物乙醇生產(chǎn)的重要原料物質(zhì)。木質(zhì)纖維素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有三種：纖維素35%～37%、半纖維(23-25%)和木質(zhì)素(18-22%)組成。每年光合可產(chǎn)生大于1，500億噸的植物干物質(zhì)，其中一半以上是纖維素和半纖維素[5]。另外，人類活動產(chǎn)生的廢棄物中也含有大量的纖維素，如農(nóng)業(yè)廢物( 稻草、稻殼、麥稈、花生殼、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣等)、食品加工廢物(果皮、果渣等)、木材廢物(木屑、樹皮)以及城市廢棄物(40%~60% 固體廢物是垃圾和廢紙)等。如果能有效地利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將這些纖維素轉(zhuǎn)化成簡單糖，再發(fā)酵產(chǎn)生乙醇等能源物質(zhì)，不僅可以變廢為寶，而且還可以避免由于化石燃料燃燒所帶來的環(huán)境污染，更重要的是可以緩解或解決石化能源短缺乃至枯竭所帶來世界性能源危機。

木質(zhì)纖維質(zhì)物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的市場前景

到2020年，全世界從木質(zhì)纖維素物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的產(chǎn)量大約是165億加侖（合計約625億升），美國將占有63.9%的市場，歐洲和中國分別將占有10.4%和11.5%的市場[3]。目前，生物乙醇的產(chǎn)業(yè)，尤其是非淀粉類的生物乙醇產(chǎn)業(yè)主要在于政府的補貼和維持，其原因在于利用木質(zhì)纖維生產(chǎn)生物乙醇的生產(chǎn)成本較高。第1代淀粉類原料與第2代非淀粉類原料發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇不同之處在于前面的預(yù)處理和酶解糖化過程。淀粉類原料很容易被酶接觸到，就被淀粉酶和糖化酶酶解為葡萄糖(C6糖)，然后葡萄糖再被普通的酵母發(fā)酵生產(chǎn)出乙醇，這樣，生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)少，流程短，成本就非常低。但是木質(zhì)纖維素物質(zhì)經(jīng)過自然選擇和漫長進化，木質(zhì)素將半纖維素和纖維素緊密包裹在內(nèi)部，形成緊密結(jié)構(gòu)，被天然“設(shè)計”成可以抵御酶進攻的分子結(jié)構(gòu)。因此與淀粉乙醇不同的是首先要有高溫高壓蒸汽或結(jié)合加酸堿等化學品的預(yù)處理技術(shù)將緊密結(jié)構(gòu)打開，讓酶能夠接觸到纖維素和半纖維素。纖維素和半纖維素酶解后發(fā)酵可以生產(chǎn)出乙醇[6]。纖維素酶解后可得到葡萄糖(C6糖)，半纖維素酶解后可得到木糖(C5糖)，淀粉類和纖維素都是由葡萄糖聚合成的長鏈結(jié)構(gòu)，只是結(jié)合的方式不同而已，因此酶解過程需要的酶是不同的；而半纖維素是由C5糖聚合而成的長鏈結(jié)構(gòu)，也需要特定的酶。纖維素及半纖維酶的成本更高，這也是導(dǎo)致木質(zhì)纖維素乙醇成本比淀粉乙醇高的重要原因之一。在每加侖生物乙醇的生產(chǎn)中，利用木質(zhì)纖維生產(chǎn)，纖維素酶的成本大約是15-20美分，而利用淀粉類生產(chǎn)，淀粉酶的費用僅僅只占到了2－4美分[7]。因此要想提高纖維素生產(chǎn)生物乙醇的市場的競爭力，提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低纖維素酶的成本成為解決問題的關(guān)鍵因素。我國是纖維素酶的需求大國，由于纖維素酶的廣泛應(yīng)用，我國市場需求量將以每年25%～35%的速度上升，用纖維素酶產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)生物乙醇的關(guān)鍵技術(shù)將在未來幾年內(nèi)得到解決，那時我國纖維素酶年需求量將增加到25-40萬噸，每年將為我國節(jié)省生產(chǎn)燃料乙醇用糧500-1，000萬噸[8]。由于產(chǎn)酶菌種落后，產(chǎn)率低，成本高，嚴重影響我國纖維素酶工業(yè)發(fā)展，從而阻礙了以木質(zhì)纖維素為原料的2代生物乙醇工業(yè)的發(fā)展。

木質(zhì)纖維素及纖維素降解酶

木質(zhì)纖維素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有三種：纖維素(35%～37%)、半纖維(23%-25%)和木質(zhì)素(18%-22%)組成[9]。纖維素屬于可再生自然資源，是生物界最重要的碳源物質(zhì)，每年由光合作用產(chǎn)生的植物干質(zhì)量約1，500億噸，其中纖維素占850億噸[5]。

纖維素酶(cellulase)是指能夠水解纖維素β-1，4-D-葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱。纖維素酶是一種具有很高活力的木聚糖酶，是一種復(fù)合酶，屬生物催化劑[10]。纖維素酶主要是指三類關(guān)鍵酶:（1）外切型纖維素酶，系統(tǒng)命名為外切β-1，4-D-葡聚糖酶，又稱纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91，也稱Cl酶)。這類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4-糖苷鍵，每回依次從纖維素分子中切下一個纖維二糖分子，所以又稱纖維二糖水解酶(簡稱CBH)。（2）內(nèi)切型纖維素酶，系統(tǒng)命名為內(nèi)切β-l，4-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也稱Cx酶或CMCase)。這類酶是纖維素酶中最重要的酶，它作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶有非還原末端的小分子纖維素。（3）纖維二糖酶，系統(tǒng)命名為β-葡萄糖苷酶(EC2.1.21，也稱CB酶)，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。當以上三種纖維素酶的關(guān)鍵酶的活性比例適當時，就能協(xié)同作用完成對纖維素的降解，但各個酶組分單獨作用時效果極差。所以說纖維素酶降解纖維素時一個協(xié)同表達和作用的過程[11-12]。

不同來源的纖維素酶分子特征和催化活性都不盡相同。細菌產(chǎn)生的纖維素酶量少，主要是內(nèi)切酶，大多數(shù)對結(jié)晶纖維素沒有活性，而且不能分泌到細菌細胞外，常常聚集形成多酶復(fù)合體[13]。真菌能產(chǎn)生大量的纖維素酶，產(chǎn)生的酶組分，能分泌到菌體外，一般不聚集成多酶復(fù)合體，但可以相互發(fā)生強烈的協(xié)同作用。纖維素酶分子的大小因來源不同也有明顯的差異，變化范圍很廣。多數(shù)真菌和少數(shù)細菌的纖維素酶都受到糖基化，所含碳水化合物的比率不同在很大程度上決定了酶的多型性，表現(xiàn)為分子量的差別[14]。纖維素酶的酶活力一般都很低，因而酶生產(chǎn)成本高。據(jù)報道，纖維素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相應(yīng)水解所需的大100倍，這是影響纖維素酶實際應(yīng)用的重要原因之一[3]。

迄今為止，人們已從40多種細菌和數(shù)種真菌中克隆到了多種纖維素酶基因，有一百多種基因可在大腸桿菌中表達，大多數(shù)克隆的纖維素酶基因能產(chǎn)生信號肽，從而使表達產(chǎn)物部分或全部轉(zhuǎn)移至E.coli的細胞質(zhì)間隙[15]。雖然克隆到大腸桿菌的基因，不需要載體的啟動子就可表達，但表達水平很低，推測可能是其啟動子不能完全被識別的緣故。但在大腸桿菌中表達纖維素酶基因存在兩個主要問題:一是提取有很大困難，二是表達水平低、酶蛋白不能分泌，離工業(yè)化應(yīng)用的目標還有一定的距離，所以在纖維素酶基因的表達方面人們將目光轉(zhuǎn)向了真核表達系統(tǒng)[16]。

木霉屬是研究最廣泛的纖維素酶產(chǎn)生菌[6]，世界纖維素酶市場中的纖維素酶20%是來自木霉屬和曲霉屬[17]。綠色木霉是一種在各種氣候帶的土壤中能夠普遍存在的一種多細胞絲狀真菌，能夠分泌完全的纖維素酶系，其中產(chǎn)量較高并且穩(wěn)定，是目前纖維素酶商業(yè)化生產(chǎn)的主要生產(chǎn)菌株[18]。對于綠色木霉的研究直到九十年代初僅有CBHⅠ基因克隆的報道，王建榮、張曼夫利用里氏木霉的基因序列同源片段做探針，構(gòu)建了綠色木霉基因文庫，并克隆了CBHⅠ、CBHⅡ基因，并對其基因結(jié)構(gòu)進行了研究[19]。

纖維素酶的合成一般受纖維素誘導(dǎo)及葡萄糖降解物的阻遏，多數(shù)菌株纖維素酶的合成既受纖維二糖、山梨糖等的誘導(dǎo)，又為葡萄糖、甘油等易利用碳源的阻遏，還受菌體生長速度的影響[6]。在綠色木霉中，纖維素酶屬誘導(dǎo)型酶類，其多個酶組分的表達經(jīng)過嚴密的調(diào)控。在綠色木霉中能產(chǎn)生分泌型的纖維素酶，當CBHⅡ基因缺失時，會影響纖維素酶系其他酶的表達，而缺失其他基因時，只單獨影響自身的表達。另有研究表明CBHⅡ是纖維素酶系統(tǒng)中最先表達的酶，其表達產(chǎn)物進一步誘導(dǎo)其他纖維素酶基因的表達，但CBHⅡ基因的表達受纖維素降解產(chǎn)物葡萄糖的抑制[20]。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，定點突變和基因重排技術(shù)在纖維素酶的生產(chǎn)工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛。在里氏木霉 (T.reesei) 中，需要產(chǎn)生至少14種酶協(xié)同作用才能水解未經(jīng)化學處理過的植物干物質(zhì)。為了降低纖維素酶的復(fù)雜性，將里氏木霉的CBH1、嗜酸耐熱菌的葡聚糖內(nèi)切酶EI 以及曲霉(Aspergillus niger)的β- 葡萄糖苷酶以90∶9∶1(質(zhì)量比)混合形成一個三元復(fù)合物，此三元復(fù)合物在120 小時內(nèi)水解預(yù)處理過的纖維素的能力與李氏木霉中纖維素酶體的水解能力相當。為了提高此三元復(fù)合物水解纖維素的活力，利用定點突變的方法對葡聚糖內(nèi)切酶EI的活性位點進行修飾，結(jié)果與突變前的三元復(fù)合物相比，其水解纖維素的活性提高了12%[21]。Zinnia R等在里氏木霉菌中應(yīng)用同源重組技術(shù)將外切β－葡萄糖苷酶整合到egl3和xyn3基因啟動子的下游，增強了纖維素酶的表達量4倍到7.5倍，這些重組菌株能有效的降解纖維素物質(zhì)[22]。

生物乙醇及纖維素降解酶的未來發(fā)展趨勢

隨著石化燃料供應(yīng)的減少，尋找新的能量來源關(guān)系到經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展乃至人類的生存問題。生物乙醇作為一種可再生的、經(jīng)濟上可承受的，并且對環(huán)境安全的能源物質(zhì)將逐漸成為石油的替代品[2]。由于產(chǎn)酶菌種落后，產(chǎn)率低，成本高，嚴重影響我國纖維素酶工業(yè)發(fā)展，從而阻礙了以木質(zhì)纖維素為原料的2代生物乙醇工業(yè)的發(fā)展。因此要想提高纖維素生產(chǎn)生物乙醇的市場的競爭力，提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低纖維素酶的成本成為解決問題的關(guān)鍵因素。目前纖維素酶工程菌株中不穩(wěn)定、產(chǎn)酶量不高、難應(yīng)用于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等三大難題。利用基因工程技術(shù)改造菌種，尤其是纖維素酶基因啟動子的改造，在發(fā)酵過程中其酶形成過程不受主要代謝產(chǎn)物葡萄糖的抑制，促進其他纖維素酶基因的協(xié)同表達，大幅度提高菌株在發(fā)酵過程中的產(chǎn)纖維素酶的能力，將是工程菌柱構(gòu)建的方向，構(gòu)建不受葡萄糖抑制、穩(wěn)定、高效的表達纖維素酶工程菌。可以解決本項目的實施將會大大提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇時纖維素降解成本，從而促進木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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木質(zhì)纖維素范文第5篇

關(guān)鍵詞 煙草；煙桿；纖維素酶；協(xié)同降解作用

中圖分類號 Q93 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）11-0225-03

Abstract In order to reuse the waste tobacco stalk，several microbial strains can use waste tobacco rod high-temperature aerobic composting were screened，preliminary detection of several decomposed strains was conducted，and the further testing for strains synergistic effect of the combination and proportion was carried out.The results showed that three groups of degradation of tobacco stalk cellulose strains can grow in the culture medium which with tobacco stems as the sole source of nutrition，and has strong cellulose degradation ability，number of strains were H2568，B1，M1.Synergistic test indicated when biomass ratios of H2568，B1，M1 with 1.0∶1.0∶1.5，combination with the strongest degradation of the cigarette rod ability，the degradation rate of cellulose，hemicellulose degradation rate，lignin degradation rate reached 56%，70%，33%，the highest fiber prime enzyme activity reached 625.44 U/mL.

Key words tobacco；tobacco stalk；cellulase；synergistic degradation

煙草不僅是一種極具經(jīng)濟價值的作物，而且也是具有科研價值的一年生模式植物[1]。我國的煙草種植量和生產(chǎn)量穩(wěn)居世界首位，在煙草采收和運輸?shù)倪^程中，大量的煙桿會被放棄或焚燒，即污染環(huán)境又造成資源浪費[2-3]。如何再充分利用這些廢棄煙桿，成為目前迫切需要研究解決的課題。楊政明[4]、詹其厚[5]、張從軍[6]等利用煙桿中含有大量的氮、磷、鉀及微量元素的特性，利用廢棄煙草生產(chǎn)有機復(fù)合肥分別在核桃、夏玉米、水稻上施用取得了較好的肥效，并使農(nóng)作物產(chǎn)量顯著增加。但是又因煙桿中含有77.4%纖維素和半纖維素、18.63%木質(zhì)素[7]，顯著高于禾本科作物秸稈中木質(zhì)素含量，因此其難以被充分利用[8]。張楠[8]、周熠[9]對煙桿中纖維素進行了降解并取得了不錯的效果，但纖維素的降解率不到40%，理論上還有一定的提升空間。因此，本研究通過組合高效的好氧纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解組合菌群，考察其對煙桿的降解效果并優(yōu)化其組合比例，以便開發(fā)能夠利用廢棄煙桿制作高溫好氧堆肥的高效微生物菌劑[10]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所有煙桿由中南煙草試驗站提供。培養(yǎng)基：細菌培養(yǎng)基為0.5% NaCl，0.5%牛肉膏，1%蛋白胨，蒸餾水100 mL，pH=7；真菌培養(yǎng)基為綜合PDA瓊脂培養(yǎng)基（20%馬鈴薯提取液，2%葡萄糖，0.3% KH2PO4，0.15% MgSO4?7H2O，0.02%維生素B1，蒸餾水100 mL，pH=7）。煙桿選擇培養(yǎng)基為10%煙桿，蒸餾水100 mL，瓊脂粉2.0%，調(diào)pH值至7。煙桿液體發(fā)酵培養(yǎng)基為10%煙桿，蒸餾水100 mL，調(diào)pH值至7。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種初步篩選。從土壤、腐熟的煙桿、剛屠宰的牛的胃部以及實驗室現(xiàn)有的纖維素降解菌中篩選能降解煙桿的菌種。將各菌株分別接種1環(huán)到2種種子液培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為25、37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵24 h后，各取種子液0.1 mL涂布在煙桿選擇培養(yǎng)基上，分別在25、37 ℃培養(yǎng)，3 d后觀察菌種生長情況。選擇能在煙桿選擇培養(yǎng)基上生長的菌種進行下一步煙桿液體發(fā)酵試驗。

1.2.2 不同菌株煙桿液體發(fā)酵試驗。將各菌株種子液以10%的接種量接種到煙桿液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵10 d后以4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL適量稀釋，用DNS法測定還原糖，選取還原糖含量較高的菌株進行下一步試驗。

1.2.3 各菌拮抗性試驗。將活力較高的菌株進行兩兩拮抗性試驗，利用抑菌圈法在蛋白胨、牛肉膏培養(yǎng)基（37 ℃）和PDA培養(yǎng)基（25 ℃）上培養(yǎng)24 h后，觀察菌株相互拮抗的情況。

1.2.4 不同組合菌煙桿液態(tài)發(fā)酵試驗。將無明顯拮抗性作用的菌株做三菌種組合和四菌種組合發(fā)酵試驗，把混合種子液于37 ℃、180 r/min擴大培養(yǎng)24 h，按接種量10%的煙桿液體發(fā)酵15 d，測定發(fā)酵液中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率，選出降解效率較高的4組菌種進行下一步試驗。

1.2.5 組合菌酶活力與發(fā)酵時間的關(guān)系。將選取的最佳組合菌在37 ℃、180 r/min條件下進行煙桿液體發(fā)酵15 d，間隔測定發(fā)酵過程中的纖維素酶活力。

1.2.6 組合菌酶活力與發(fā)酵溫度的關(guān)系。將選取的最佳組合菌分別在40、50、60 ℃及其他條件不變的條件下發(fā)酵11 d，測定纖維素酶活力，判斷所選組合菌是否具有耐高溫性。

1.3 分析方法

1.3.1 纖維素、半纖維素、木質(zhì)素定量分析方法。通過測定還原糖的增加量可以初步挑選出更能高效降解煙桿的菌種，但是為了更詳細地了解煙桿中主要成分的降解情況[11]，下一步試驗以纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率為主要試驗指標[12]。圖1為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素定量分析方法。

1.3.2 纖維素酶活性測定方法。取10 mL發(fā)酵液用離心機4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL稀釋25倍制成待測酶液。取4支25 mL刻度具塞試管（2支平行管、1支空白管）。分別向所有管中加入CMC-Na溶液2.00 mL，再加入稀釋好的待測酶液0.50 mL（空白管不加），用漩渦混勻器混勻，蓋塞。（50.0+0.1）℃水浴30 min后，加入DNS試劑3.0 mL，于空白管中加入待測酶液0.50 mL，搖勻。沸水浴10 min后，迅速冷卻至室溫，用水定容至25 mL，以空白管調(diào)儀器零點，在分光光度計波長540 nm下，用10 mm比色杯分別測量樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過用線性回歸方程求出纖維素酶活[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙桿化學組成分析

首先對提供的樣品進行了部分化學組成的檢測，尤其是對于纖維素類的物質(zhì)成分進行了定量分析。在提供的煙桿樣品中，總纖維素含量達到77.44%，木素含量大約為18.63%，果膠含量為3.89%，苯-醇溶出物含量為3.21%，另外還有5%左右的灰分?？梢?，煙桿中含有豐富的纖維素類物質(zhì)資源，如果能夠?qū)@些纖維素降解后加以利用，完全可以提高煙桿廢棄物的利用價值。

2.2 纖維素菌的篩選

在篩選出來的微生物中有11組菌種能利用煙桿生長，將其分別編號為H2568、H1249、H1348、H1764、H4479、B1、M1、N1、Y1、Y2、Y3。進行下一步煙桿液體發(fā)酵試驗以確定所需纖維素菌。

2.3 纖維素菌的確定

初步篩選的11組菌株在降解煙桿多糖生成還原糖的能力上差異較為顯著。從圖2可以看出，這些微生物生成還原糖的量從高到低的順序依次為B1、M1、H2568、N1、H1249、H1348、Y3、H1764、H4479、Y2、Y1。選取其中降解能力最強的5株菌H1249、H2568、B1、M1、N1，作為下一步菌種協(xié)同降解作用的基礎(chǔ)進行拮抗試驗。

2.4 不同菌種拮抗結(jié)果

有很多試驗研究表明，復(fù)合菌群較單一菌的降解能力強，特別是針對纖維素、木質(zhì)素等需多種酶協(xié)同降解的物質(zhì)，不同菌種組合起來可以起到補充和加強分解的作用。但在同一生長環(huán)境下，不同菌株之間產(chǎn)生拮抗性作用會抑制其自身生長和產(chǎn)酶活力。利用菌株之間不相容性，進行拮抗性試驗，從表1可以看出：H1249與B1拮抗，選取相對降解能力更強的B1。得到所需的4株無明顯拮抗性的菌株H2568、B1、M1、N1，可用于下一步菌種組合研究。

2.5 半纖維素、木質(zhì)素和纖維素的降解情況

在多菌株協(xié)同降解試驗中發(fā)現(xiàn)H2568、B1和M1這3種菌種以等量進行組合時能夠取得較好的降解效果（圖3），纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率分別達到了47%、63%、26%。因此，對煙桿纖維素降解效果最為理想的協(xié)同菌群組合確定為H2568+B1+M1。

2.6 組合菌酶活力與發(fā)酵時間的關(guān)系

將上述試驗中確定的最佳組合菌H2568-B1-M1煙桿液體發(fā)酵15 d[14]，觀察其發(fā)酵過程中酶活力的變化情況（圖4），發(fā)酵第11天時，發(fā)酵體系中纖維素酶的活力最高，達到625.44 U/mL，隨后酶活力開始逐步降低。

2.7 組合菌酶活力與發(fā)酵溫度的關(guān)系

高溫對菌株的生長與產(chǎn)酶不利，但由于現(xiàn)階段煙桿大多處理方式為堆肥，那么固態(tài)發(fā)酵所需升溫過程不能避免，因此需要篩選出的組合菌能夠耐高溫來適應(yīng)固態(tài)堆肥。從圖5可以看出，在發(fā)酵11 d后，H2568-B1-M1的纖維素酶活不可避免的受到高溫影響，但是即使在60 ℃下仍能達到250.47 U/mL。組合菌耐高溫試驗證明了H2568-B1-M1能長期保持較高的纖維素酶活力且耐高溫。

2.8 菌量比例對協(xié)同降解作用的影響

確定H2568、B1與M1為最佳的菌種組合后，對其接種時的比例進行優(yōu)化試驗。從圖6可以看出，H2568、B1與M1以1.0∶1.0∶1.5的比例組成煙桿發(fā)酵種子液時，取得了最佳效果。其纖維素降解率、半纖維素降解率、木質(zhì)素降解率分別達到56%、70%、33%，較1.0∶1.0∶1.0配比時的降解能力顯著提升。

3 結(jié)論與討論

煙葉產(chǎn)量的增加同時產(chǎn)生了大量的廢棄煙桿。由于煙桿不易腐爛也不能直接用于肥田，因而絕大部分都是作為廢棄物被丟棄或焚燒，這不僅不同程度地污染了當?shù)氐纳钌a(chǎn)環(huán)境，也造成了資源的浪費。經(jīng)試驗證明通過微生物發(fā)酵將煙桿中的大分子物質(zhì)降解，將纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解為小分子的單糖，使卷煙制造產(chǎn)生的廢棄物轉(zhuǎn)化為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中急需的有機肥，具備廣闊的生產(chǎn)應(yīng)用前景。而煙桿中有機質(zhì)的降解依賴于微生物是否產(chǎn)生多種酶系和產(chǎn)各種酶系活力的強弱?；诶w維素酶的復(fù)雜性，大量試驗證明，復(fù)合菌液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力高于單菌株，在同一生長環(huán)境下，相互依賴，共同生長，達到良好的協(xié)調(diào)作用。因此，篩選出無明顯拮抗、耐高溫、長時間具備高酶活且能高效降解煙桿的組合菌是試驗的基礎(chǔ)。在自然環(huán)境中常見的纖維素分解細菌大多為食纖維菌屬、生孢食纖維菌屬、多囊菌屬、鐮狀纖維菌屬與纖維弧菌屬。具有很強的纖維素分解能力的真菌主要有木霉、鐮刀霉、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢霉等屬的菌種。本試驗前期篩選了多種能降解纖維素的細菌、真菌用于進一步測試它們對煙桿的降解能力。因此，確定最佳的降解煙桿組合菌是為下一步研究提供了根本的基礎(chǔ)。本試驗中纖維素酶活力和還原糖的生成量能說明菌種自身降解能力的強弱，從另一角度總纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的變化情況反映了組合菌的降解效率。H2568-B1-M1以1.0∶1.0∶1.5的比例進行煙桿液體發(fā)酵，11 d后其纖維素降解率、半纖維素降解率、木質(zhì)素降解率分別達到56%、70%、33%，說明經(jīng)H2568-B1-M1產(chǎn)生多種酶系，促進了有機質(zhì)的降解，對煙桿的降解取得了較顯著效果，進一步提高纖維素酶活力，增加還原糖的生成量，提高纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率，為進一步進行煙桿固體發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

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