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本文作者：王俊國包秋華陳永福劉文俊丹彤張和平作者單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

心血管疾病是當(dāng)前導(dǎo)致人類死亡的最主要原因，大量流行病學(xué)和臨床研究的結(jié)果表明：在膽固醇含量與心血管疾病之間存在著顯著的正相關(guān)，血脂中總膽固醇的減少能降低高血脂人群患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常食用一些益生菌(主要是乳酸菌)的發(fā)酵制品及其制劑有助于降低血液膽固醇的含量[2-4]。而許多研究者認(rèn)為乳酸菌降低膽固醇與其所產(chǎn)生的膽鹽水解酶有著密切聯(lián)系。膽鹽水解酶(BSH)是微生物生長(zhǎng)、繁殖過程中產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物[5]。該酶主要由乳酸菌產(chǎn)生，能水解結(jié)合態(tài)牛磺酸膽鹽和甘氨酸膽鹽，將其轉(zhuǎn)變成氨基酸和游離膽酸。

人們?cè)趲追N腸道固有的乳酸菌中都發(fā)現(xiàn)了BSH[6-8]。在降膽固醇菌株的篩選上，是否具有BSH活性已成為一個(gè)重要的指標(biāo)，不少科學(xué)家越來越關(guān)注BSH和乳酸菌降膽固醇之間的關(guān)系[9-11]。乳酸菌的BSH活性，除了具有降低體內(nèi)膽固醇和保護(hù)菌體細(xì)胞免受毒害及提高細(xì)胞自身活力等功能外，還能提供腸道微生物生長(zhǎng)所需的能量，抗膽鹽毒性作用，提高腸道乳酸菌對(duì)病原菌的拮抗作用，維護(hù)腸道菌群平衡等作用[5]。因此篩選具有BSH活性的乳酸菌有著重要意義。

本研究的目的在于篩選分離自新疆及蒙古國酸馬奶中的含有膽鹽水解酶活性的乳桿菌菌株，并通過體外實(shí)驗(yàn)對(duì)影響乳酸菌膽鹽水解酶活性的一些因素進(jìn)行研究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株

從蒙古國及新疆酸馬奶樣品中篩選出的10株耐酸性、耐膽鹽較好的菌株，它們是D4401、LIP-I、E7301、XB4-1、F6306、MG1-2、MG9-2、MG13-3、MG16-3、MG18-1。1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑膽鹽：分析純，Difco公司；膽固醇、鄰苯二甲醛、巰基乙酸鈉、正己烷、冰醋酸：上海國藥公司，分析純；脫氧?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉：分析純，美國Sigma公司；甘氨酸：美國Sigma公司，色譜純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1膽鹽水解酶活力的定性檢測(cè)[12]

在MRS液體培養(yǎng)基中添加0.3%脫氧?；悄懰徕c、0.2%巰基乙酸鈉(THIO)、0.37g/LCaCl2和1.5%瓊脂，121℃15min滅菌后傾倒入滅菌平皿中，凝固后倒置放入?yún)捬豕?BBL)中48h后取出。將無菌濾紙片放入平皿中，在每個(gè)濾紙片上滴加10μL菌液，平皿再次放入?yún)捬豕拗校?7℃培養(yǎng)72h。觀察濾紙片周圍有無白色沉淀物生成。

1.2.2膽鹽水解酶活力的定量檢測(cè)[13]

將供試菌株，按2%接種量接種于含有0.3%甘氨膽酸鈉的200mLMRS-THIO培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后，通過HPLC測(cè)BSH活力。HPLC色譜條件：Agilent1100HPLC系統(tǒng)(Agilent，USA)：高壓二元泵、熒光檢測(cè)器、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent色譜工作站(Agilent，USA)，Sep-PakC18(100mm×8mm)，熒光檢測(cè)波長(zhǎng)205nm，進(jìn)樣量20μL，峰面積計(jì)算用ChemResearchSoftware，甘氨膽酸的流速1.0mL/min，所用有機(jī)溶劑均為色譜純。流動(dòng)相：700mL甲醇和300mL0.02mol/L乙酸混合用5mol/LNaOH調(diào)其pH為5.6，通過0.45μm聚丙烯過濾器過濾。配制2.00mmol/L甘氨酸(GLY)的溶液，作為標(biāo)樣，并稀釋至0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mmol/L，利用HPLC法測(cè)定甘氨酸含量。HPLC條件與樣品相同，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3不同pH值對(duì)BSH活力的影響[14]

將菌株接入30mLMRS-THTO培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，離心收集菌體。用0.5mmol/LpH7.0的磷酸緩沖液洗滌菌體2次，在600nm處調(diào)整不同菌株間OD值在5.0，5等份后分別加入1mLpH值為4、5、6、7、8含有2mmol/L甘氨膽酸鈉的磷酸緩沖液，厭氧37℃培養(yǎng)8h后，震蕩均勻。離心后取上清液加入等體積15%的三氯乙酸再次離心，取上清液利用HPLC法測(cè)定不同pH值條件下甘氨酸的含量。

1.2.4不同超聲波破碎時(shí)間對(duì)BSH活力的影響[15]

如前所述方法，制備OD值在5.0的菌液，加入10mmol/L的二硫蘇糖醇(dTT)防止酶的氧化，置冰浴在超聲波破碎儀功率為100W下破碎，每隔3min取樣累計(jì)21min，在12000r/min、4℃離心10min后取上清液，上清液即為菌體破碎液。在180μL0.1mmol/LpH6.0的磷酸緩沖液中加入10μL上清液、10μL2mmol/L甘氨膽酸鈉、10mmol/L的dTT。37℃水浴30min加入等體積15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，在4℃、12000r/min離心10min后，取上清液利用HPLC法測(cè)定不同超聲波破碎時(shí)間下甘氨酸的含量。

1.2.5氧化還原電位(O/R)對(duì)BSH活力的影響[16]

在600nm處調(diào)整不同菌株間OD值在5.0，3等份后每份加入10μL、2mmol/L甘氨膽酸鈉，其中一份加0.2%THIO置于厭氧罐中，另一份置于厭氧罐中，剩下的一份不作任何處理。37℃下培養(yǎng)8h后，12000r/min、4℃離心10min后，取上清液利用HPLC法測(cè)定甘氨酸的含量。

2結(jié)果與分析

2.1膽鹽水解酶活性的定性檢測(cè)結(jié)果

由于膽鹽水解酶可以水解結(jié)合態(tài)膽鹽，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榘被岷陀坞x膽酸，游離膽酸可以和培養(yǎng)基中的CaCl2反應(yīng)，產(chǎn)生白色沉淀。因此，含有膽鹽水解酶活性的乳酸菌會(huì)在濾紙片周圍產(chǎn)生白色的沉淀圈[17]。在10株實(shí)驗(yàn)菌株中，有3株菌在濾紙片周圍產(chǎn)生明顯的白色沉淀，表示這些菌株可能具有膽鹽水解酶活性，它們分別是MG13-3、XB4-1、MG16-3。它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖1所示。利用16SrDNA序列同源性分析對(duì)這3株菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示，MG13-3和MG16-3是發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)，在GenBank/EMBL/DDBJ上序列注冊(cè)號(hào)是EU287483和EU688978，XB4-1是開菲爾乳桿菌(L.Kefiranofaciens)，在GenBank/EMBL/DDBJ上序列注冊(cè)號(hào)是EJ172344。

2.2膽鹽水解酶活性的定量檢測(cè)結(jié)果

具有膽鹽水解酶活力的菌株可以水解甘氨膽酸鈉，產(chǎn)生甘氨酸和游離膽酸，膽鹽水解酶活性越大，生成的甘氨酸越多，對(duì)應(yīng)的峰面積越大，同時(shí)甘氨酸的出峰時(shí)間在11.3min，用HPLC法通過測(cè)定不同甘氨酸濃度時(shí)的峰面積，就可以得到甘氨酸濃度值，進(jìn)而可知水解酶活力的高低。從圖3~圖5及表1可知，用HPLC法測(cè)定出MG16-3、XB4-1、MG13-3產(chǎn)生的峰面積分別是86.34364、127.28943、274.39850。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，查得對(duì)應(yīng)的甘氨酸濃度分別是0.0909、0.1340、0.2889μmol/mL。.結(jié)果表明，這3株乳酸菌膽鹽水解酶活性從小到大的順序?yàn)镸G16-3、XB4-1、MG13-3，初篩中選擇的對(duì)照菌株MG16-3產(chǎn)生的白色沉淀圈較小，利用HPLC對(duì)其檢測(cè)的結(jié)果表現(xiàn)出較低的膽鹽水解酶活性(0.0909μmol/mL)，驗(yàn)證了初篩過程的準(zhǔn)確性。為了更準(zhǔn)確地評(píng)估菌株膽鹽水解酶的活性，我們利用HPLC對(duì)其余7株菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明它們水解產(chǎn)生甘氨酸的量極低，膽鹽水解酶活性較弱。

2.3影響B(tài)SH活力因素的研究

一些研究表明：不同的pH值，超聲波對(duì)菌體破碎不同時(shí)間，以及氧化還原電位的高低都會(huì)對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)和膽鹽水解酶活力有影響。我們選用MG16-3、XB4-1、MG13-33株菌來探討環(huán)境因素對(duì)乳酸菌膽鹽水解酶活力的影響規(guī)律，并對(duì)菌株產(chǎn)膽鹽水解酶的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行研究。

2.3.1不同pH值對(duì)BSH活力的影響

從圖6可知3株菌均在pH6時(shí)BSH活力最高，說明pH6是這3株菌膽鹽水解酶作用的最適pH值。

2.3.2不同超聲波破碎時(shí)間對(duì)BSH活力的影響

圖7表明：超聲波破碎時(shí)間對(duì)BSH活力有明顯影響，MG16-3、MG13-32株菌在0~15min內(nèi)BSH活力一直處于上升趨勢(shì)，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；而XB4-1在0~12min是上升趨勢(shì)，之后呈現(xiàn)下降。這說明了在100W的功率下超聲波破碎12~15min是這3株菌提取BSH的最佳時(shí)期，因?yàn)锽SH是乳酸菌體內(nèi)的一種胞內(nèi)酶，在0~12min內(nèi)，BSH隨著破碎時(shí)間的延長(zhǎng)，不斷地從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，在12~15min胞內(nèi)所有BSH被釋放出來，之后BSH活力降低可能是因?yàn)槌暡ㄆ扑閷?duì)該酶有破壞作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，破壞強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。2.3.3氧化還原電位(O/R)對(duì)BSH活力的影響圖8結(jié)果表明，在有氧條件下3株菌BSH活力很低，置于厭氧罐中BSH活力明顯增強(qiáng)，而在加入巰基乙酸鈉(THIO)且放置于厭氧罐中，BSH活力是三種情況下最強(qiáng)的，這充分說明了BSH活力的產(chǎn)生對(duì)厭氧環(huán)境有強(qiáng)烈依賴性，故低的氧化還原電位(O/R)是BSH生成的必要條件。

3討論

自從Klaver和VanDerMeer(1993)[18]通過體外實(shí)驗(yàn)提出了共沉淀理論后，圍繞著BSH的爭(zhēng)論就一直不斷[15-17]。隨著時(shí)間的推移，越來越多的證據(jù)表明BSH在人體內(nèi)對(duì)膽固醇的降低起著重要作用[5,7,11,14-16]。

對(duì)于人類和其他哺乳動(dòng)物而言，膽固醇的主要排泄途徑是通過糞便。膽汁是肝細(xì)胞利用膽固醇合成的并以結(jié)合膽鹽的形式貯存在膽囊中。結(jié)合膽鹽分泌進(jìn)入小腸后有助于脂溶性維生素及其他膳食中脂溶性物質(zhì)的吸收。在促進(jìn)脂類消化吸收的同時(shí)，膽汁受到腸道(小腸下端及大腸)內(nèi)細(xì)菌作用而由結(jié)合膽鹽變?yōu)槊摻Y(jié)合膽鹽[1]。脫結(jié)合膽鹽與結(jié)合膽鹽相比其溶解性較低，這導(dǎo)致其在小腸內(nèi)吸收性降低并隨糞便排出[2]。當(dāng)含有膽鹽水解酶的益生菌進(jìn)入腸道后，將使大量的結(jié)合膽鹽變?yōu)槊摻Y(jié)合膽鹽，要維持正常的腸肝循環(huán)就必須有更多的膽固醇合成新的膽鹽來補(bǔ)充排泄掉的那部分(膽固醇是膽鹽的前提物質(zhì))，從而起到了降低血液膽固醇的作用[11-13]，同時(shí)由于游離膽鹽的增多將造成腸道中脂類的溶解和吸收率的下降，促使更多的脂類隨糞便排出體外，對(duì)降低血脂也有一定的作用[1]。

膽鹽水解酶的影響因素除了菌種本身外，環(huán)境因子也起重要作用[9-11]。不同菌種產(chǎn)生膽鹽水解酶的條件有所不同。為此，我們對(duì)分離自新疆和蒙古國酸馬奶樣品中的10株有較好的益生特性的乳桿菌進(jìn)行了膽鹽水解酶的定性篩選及定量測(cè)定并對(duì)影響B(tài)SH活性的因素進(jìn)行了研究。盡管許多人認(rèn)為有膽鹽水解酶活力的菌株必須來源于富含有膽鹽的環(huán)境，例如分離自人或動(dòng)物的腸道或糞便，而分離自蔬菜和發(fā)酵乳制品的菌株一般不具有膽鹽水解酶活力[19-20]，但從我們的試驗(yàn)結(jié)果來看，從發(fā)酵乳制品中也可以分離出具有膽鹽水解酶活性的乳酸菌，所以我們認(rèn)為具有膽鹽水解酶活力的菌株并不一定要來自富含膽鹽的環(huán)境。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)3株菌的膽鹽水解酶最適作用pH值為6，同時(shí)其對(duì)厭氧環(huán)境有強(qiáng)烈的依賴性，而人體小腸上段正常pH值為5.5~6.5，同時(shí)腸道內(nèi)的厭氧環(huán)境也符合膽鹽水解酶作用的條件，這從另一方面證實(shí)人體內(nèi)有適合膽鹽水解酶作用的外在條件。

4結(jié)論

通過鈣圈法對(duì)10株乳桿菌進(jìn)行了定性篩選，其中MG13-3、XB4-1、MG16-33株菌產(chǎn)生了白色沉淀圈，表示它們具有膽鹽水解酶活性。利用HPLC法對(duì)MG13-3、XB4-1、MG16-33株乳桿菌的膽鹽水解酶進(jìn)行了定量測(cè)定，3株菌的膽鹽水解酶活性從小到大依次為：MG16-3、XB4-1、MG13-3。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，在體外膽鹽水解酶的最適pH為6.0；在100W的功率下，超聲波破碎時(shí)間在12~15min時(shí)，酶活力體現(xiàn)較強(qiáng)；低的氧化還原電位(O/R)是BSH生成的必要條件。