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本文作者：袁美娟薛文通作者單位：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院

回鍋油又稱“萬年油”，泛指長期使用后，變色變質(zhì)劣化后的食用油。常見特征是油質(zhì)偏混濁，顏色深，甚至變黑(或存在明顯的油炸過后的懸浮物)，攪拌時(shí)明顯地黏稠等，嗅覺較靈敏的人甚至可聞出異味。但回鍋油并不等于“地溝油”、“餿水油”，回鍋油可能來自大豆色拉油、棕櫚油、玉米油、花生油、葵花油等，屬于長期使用過后的炸油。這種油新舊摻雜或用于燒菜或用于火鍋底料，不僅營養(yǎng)物質(zhì)大大減少，還產(chǎn)生了環(huán)氧化合物等致癌物質(zhì)。本工作擬用高效液相色譜(HPLC)測定回鍋油中的主要脂肪酸成分，驗(yàn)證所使用的油的營養(yǎng)價(jià)值，間接驗(yàn)證使用的食用油是否是回鍋油。同時(shí)利用測得的游離脂肪酸的質(zhì)量間接驗(yàn)證回鍋油的酸價(jià)。為尋找快速檢測回鍋油的方法提供不一樣的思路。

1材料與方法

1.1材料與試劑

亞麻酸、油酸、亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品、衍生化試劑2,4-二溴苯乙酮、相轉(zhuǎn)移催化劑18-冠-6醚：上海Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司；色譜甲醇：德國Merck試劑公司；色譜乙腈：美國Fisher試劑公司；色譜二氯甲烷：天津津科化學(xué)試劑公司。EclipseXDB-C18柱：美國安捷倫科技有限公司。

1.2色譜條件

流動(dòng)相：乙腈:水(90:10)；體積流量1.5mL/min；柱溫：33℃；檢測波長254nm；進(jìn)樣量20μL，利用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.3衍生化處理

準(zhǔn)確稱取等量的2,4-二溴苯乙酮和18-冠-6醚配制成1mg/mL的衍生化溶液，置于4℃條件下避光保存。分別稱取亞麻酸、硬脂酸、油酸、棕櫚酸和亞油酸0.2226、0.3208、0.2971、0.2468、0.2880g，以甲醇和二氯甲烷1:1(v:v)混合溶液定容至100mL待用。取上述脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.15mL于具塞反應(yīng)管中，加入相應(yīng)濃度的衍生化試劑3mL，另加入0.4g碳酸鉀已形成pH值為8.3～8.5的緩沖體系?；旌衔镉?0℃水浴中加熱30min，反應(yīng)液置于4℃條件下冷卻1h，過0.45μm濾膜后，待HPLC分析[1]。

1.4樣品前處理

1.4.1非皂化處理(測游離脂肪酸)

稱取樣品0.5g，以甲醇和二氯甲烷1:1(v:v)混合溶液定容至5mL，加入1g無水硫酸鈉脫水，4200r/min離心5min，取上清液0.15mL，按上述中脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生化步驟處理，所得樣品待HPLC分析[2]。

1.4.2皂化處理(測總的脂肪酸)

精確稱量樣品0.5g，加入30mL無水乙醇、3mL50%KOH水溶液、2mL10%抗壞血酸水溶液，超聲10min，75℃回流皂化1.5h，用蒸餾水和石油醚沖洗皂化瓶并入分液漏斗中，用石油醚萃取3次，每次30mL，棄去石油醚層，保留水層；調(diào)節(jié)水層pH4.0，使脂肪酸鹽轉(zhuǎn)為脂肪酸；用石油醚萃取3次，每次30mL，合并石油醚層，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收石油醚，將瓶中剩下約2mL石油醚時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮?dú)獯档羰兔眩訜o水硫酸鈉干燥，用甲醇定容5mL，待測[3]。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入濃度為1mg/mL的衍生化試劑，按1.3方法制成脂肪酸衍生物貯備液30mL，分別取貯備液8、6、5、3、1mL用甲醇和二氯甲烷1:1(v:v)混合溶液定容至10mL配制成不同梯度溶液的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2所述色譜條件依次進(jìn)樣分析。并不斷稀釋最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比為10時(shí)的濃度作為檢測定量限，以信噪比為3時(shí)作為檢測限。以Y(峰面積105)為縱坐標(biāo)，以X(質(zhì)量濃度mg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸線性關(guān)系良好，各曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍以及檢測限和定量限如表1所示。

2.2精密度實(shí)驗(yàn)

按1.3所述方法制備脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每次脂肪酸峰面積，所得亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸與硬脂酸精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)分別為1.2%、1.4%、1.0%、1.1%和1.0%。

2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

脂肪酸衍生化樣品置于4℃條件下，每隔2h進(jìn)樣1次，進(jìn)樣6次，記錄每次脂肪酸峰面積，計(jì)算所得亞麻酸、油酸、亞油酸、棕櫚酸與硬脂酸穩(wěn)定性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)分別為1.5%、1.5%、0.9%、1.3%和0.7%。

2.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

分別稱取樣品0.5g(3份)，制備脂肪酸衍生化溶液，各進(jìn)樣2次，計(jì)算5種脂肪酸含量，考察方法重現(xiàn)性。計(jì)算所得5種脂肪酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為1.5%、0.6%、2.2%、4%、3.3%。

2.5專一性考察

分別配制樣品油，亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸對照品的衍生化產(chǎn)物及空白溶液(空白溶液的制備：加入2,4—二溴苯乙酮和18-冠-6醚混合溶液3mL及甲醇和二氯甲烷1:1(v:v)的混合溶液0.15mL，另加入0.4g碳酸鉀)進(jìn)液相色譜分析?？梢娫诳瞻字衼喡樗帷営退?、棕櫚酸、油酸、硬脂酸處均無干擾，亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸分離度好。

2.6回收率實(shí)驗(yàn)

精確稱量樣品0.5g(3份)，加入亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸混合標(biāo)準(zhǔn)液2mL，再加入30mL無水乙醇、3mL50%KOH水溶液、2mL10%抗壞血酸水溶液，超聲10min，75℃回流皂化1.5h，用蒸餾水和石油醚沖洗皂化瓶并入分液漏斗中，用石油醚萃取3次，每次30mL，棄去石油醚層，保留水層；調(diào)節(jié)水層pH4.0，使脂肪酸鹽轉(zhuǎn)為脂肪酸；用石油醚萃取3次，每次30mL，合并石油醚層，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收石油醚，將瓶中剩下約2mL石油醚時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮?dú)獯档羰兔眩訜o水硫酸鈉干燥，用甲醇定容10mL，待測。計(jì)算所得亞麻酸、油酸、棕櫚酸、亞油酸與硬脂酸加樣回收率分別為98.2%、95.1%、96.5%、95.7%、97.1%。

2.7樣品中脂肪酸含量

將食用花生油每天連續(xù)煎炸2h，然后放置過夜，如此反復(fù)取5次樣，測定其中脂肪酸成分。花生油中亞麻酸、亞油酸和油酸等不飽和脂肪酸占到85%以上，是花生油具有營養(yǎng)價(jià)值的主要原因。人體所需要的不飽和脂肪酸主要是從食用油中供給，因此食用油的營養(yǎng)價(jià)值大小至關(guān)重要。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花生油中的不飽和脂肪酸在前2h的煎炸過程中下降最快，只占到17%。隨后的過程中卻變化不劇烈，這有可能是因?yàn)橛椭藭r(shí)的主要變化是進(jìn)行聚合反應(yīng)，分解氧化反應(yīng)緩慢。建議食用油煎炸不要超過2h，尤其顏色發(fā)生變化后要丟棄不再用。

3討論

一種較普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為：天然油脂的環(huán)氧化反應(yīng)是在雙鍵上發(fā)生的，并得到環(huán)氧基和羰基。“高碘值雙鍵氧化理論”強(qiáng)調(diào)的是：碘值越高雙鍵越多，且雙鍵越易氧化。這種觀點(diǎn)沒有考慮雙鍵的相對位置、構(gòu)型、活性基等，包括活性基引入后對結(jié)構(gòu)的反作用。假如油脂氧化發(fā)生在雙鍵上，必然導(dǎo)致雙鍵破壞或是氧化后的油脂碘值會(huì)發(fā)生明顯下降。在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，對樣品油進(jìn)行過氧化值和碘值的測定，發(fā)現(xiàn)過氧化值的增加和碘值的下降不成比例。在用高效液相色譜對樣品中的脂肪酸成分分析時(shí)發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸并沒有增加，而是都降低，營養(yǎng)價(jià)值急劇下降。與測定的碘值不一致，說明氧化反應(yīng)以非雙鍵反應(yīng)為主。這些結(jié)論與周華龍[4]等人的結(jié)論一致。不論是魚油還是植物油脂，不管是精制的色拉油還是普通的未精制油脂，經(jīng)深度氧化，過氧化值達(dá)到極大值后，實(shí)際新增的游離酸很小，一般在4~10mgKOH/g。這說明油脂氧化生成氫過氧化物是主要反應(yīng)，酸敗是氧化反應(yīng)物的二次反應(yīng)的結(jié)果。在用高效液相色譜分析樣品的游離脂肪酸時(shí)(非皂化)，其游離酸的含量很少，與酸價(jià)的測定結(jié)果一致。以上的結(jié)果說明可以利用高效液相色譜驗(yàn)證食用油的營養(yǎng)價(jià)值，并判斷是否是回鍋油即是否是二次用油。同時(shí)，需要更精確快速的方法來檢測回鍋油并與其他方法結(jié)合互相驗(yàn)證。