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葡萄為我國主要的經(jīng)濟類水果之一，加工和消費需求量極大，商業(yè)價值很高。但葡萄作為典型的非躍變型果實，其含水量高、組織嬌嫩且生理代謝旺盛，采后衰老進程很快，果實極易自果穗上脫落形成落粒，這極大降低了葡萄果實的商品性[1]。葡萄采后落粒作為一種典型的植物器官脫落現(xiàn)象，其與葡萄離區(qū)(果實脫落區(qū)域及鄰近部分)組織中生理代謝失調(diào)以及細(xì)胞衰老進程密切相關(guān)[2]。大量研究表明，采后葡萄果實在低溫貯藏期間，隨著貯藏時間的延長，其離區(qū)組織中脂氧合酶活性逐漸上升，顯示細(xì)胞膜脂逐漸出現(xiàn)過氧化癥狀，細(xì)胞物化結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，從而最終導(dǎo)致果實自果梗分離[3]。因此，延緩葡萄離區(qū)細(xì)胞膜脂過氧化進程是控制葡萄采后落粒癥狀發(fā)展的有效措施。茉莉酸甲酯(meja)為植物中的天然精油成分，可在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用來調(diào)控植物生長發(fā)育、后熟衰老、抗逆性和次生代謝產(chǎn)物合成等一系列生理生化反應(yīng)[4]。大量研究表明，外源MeJA處理可有效提高枇杷[5]、番木瓜[6]和桃[7]等果實中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)或過氧化物酶(POD)等活性氧代謝酶活性，清除果實中過量的活性氧自由基，減慢細(xì)胞膜脂過氧化進程和透性的上升，從而控制了果實采后衰老或冷害癥狀的發(fā)展。我們先期研究也證實，濃度為10μmol/LMeJA熏蒸處理可顯著誘導(dǎo)采后葡萄果實抗病相關(guān)酶活性的上升，降低貯藏期間擴展青霉導(dǎo)致青霉病的發(fā)病率[8]，但現(xiàn)階段有關(guān)MeJA處理對采后葡萄離區(qū)細(xì)胞膜脂過氧化及果實落粒的影響卻尚未見報道。因此，本研究以“巨峰”葡萄為試材，首先分析了外源10μmol/LMeJA熏蒸處理對冷藏期間葡萄落粒的影響，再從離區(qū)細(xì)胞膜脂過氧化的角度探討相關(guān)機理，以期為MeJA處理在葡萄保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

本研究以棚栽“巨峰”葡萄為試材，于2011年7月26日采自重慶市萬州區(qū)新田鎮(zhèn)葡萄種植基地，于采收后2h內(nèi)運回實驗室。除去尚有機械損傷、病蟲害及未成熟的果實，挑選大小基本一致、無明顯落?，F(xiàn)象和轉(zhuǎn)色均勻的完熟果穗，于實驗臺上攤開并風(fēng)涼。采摘當(dāng)天用手持硬度計測定的葡萄果實硬度為(7.83±0.28)N，可溶性固形物和可滴定酸含量經(jīng)測定分別為(9.73±0.09)%和(1.36±0.10)%。

1.2試劑與儀器

α-萘胺、氮藍四唑、鹽酸羥胺：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸：重慶怡景化工有限公司；鄰菲羅啉、核黃素、甲硫氨酸：西隴化工有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、抗壞血酸、色譜純甲醇：重慶西南化學(xué)試劑公司；MeJA(純度大于95%)：美國Sigma公司；其余常用試劑如鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、醋酸、醋酸鈉、丙酮、乙醇等：萬州醫(yī)藥試劑公司，純度為分析純。WYT-4型手持折光儀：泉州光學(xué)儀器廠；PHS-3C型pH計：杭州雷磁分析儀器廠；OKD-656精密臺式電導(dǎo)率儀：深圳歐克儀表科技有限公司；UV-1600型分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；GL-20G-H型冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；GHP-9080型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；YP3001N型電子天平：上海精密儀器儀表有限公司；超低溫冰箱：海爾公司；SP-6800A型氣相色譜儀：山東魯南瑞虹化工儀器有限公司。

1.3處理方法

在前期實驗中，我們將葡萄果穗分別放在密閉室內(nèi)在20℃下以0(對照)、1、10、100、1000μmol/LMeJA熏蒸處理6h。處理結(jié)束后，將果穗通風(fēng)1h后用聚乙烯塑料袋分裝，于(1±1)℃下貯藏28d后測定果實落粒率、腐爛率以及其他品質(zhì)參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10μmol/LMeJA處理對葡萄果實采后腐爛的抑制效果最佳，同時最為明顯的維持了果實貯藏品質(zhì)[8]，故以此作為MeJA處理的條件。本實驗將挑選出的葡萄果穗隨機分為2組，處理組于密閉室內(nèi)在20℃下用10μmol/LMeJA熏蒸處理6h，對照組在20℃下密閉放置6h，處理結(jié)束后，將果實通風(fēng)1h后分裝，在(1±1)℃、相對濕度(90~95)%下貯藏28d。分別在處理前(0d)和處理后貯藏期間每隔7d取果實鮮樣測定落粒率、腐爛率、褐變指數(shù)以及其他品質(zhì)參數(shù)，并同時用刀片切取果穗離區(qū)組織(漿果與果蒂接合部組織4～5mm厚的位置)來測定脂肪酸含量和電導(dǎo)率；此外，再對離區(qū)組織進行取樣并液氮中速凍，隨后在-60℃的超低溫冰箱中保存，用于其余指標(biāo)的測定。每個處理約6kg葡萄果穗，分裝60袋，整個實驗重復(fù)3次。

1.4測定方法

1.4.1落粒率

葡萄果實自果穗自然脫落即記為落粒。落粒率(%)=(落粒數(shù)/總粒數(shù))×100

1.4.2腐爛率

葡萄果實表面出現(xiàn)霉菌性病斑即記為爛果。腐爛率(%)=(爛果數(shù)/總果數(shù))×100

1.4.3果實可溶性固型物(TSS)和可滴定酸(TA)含量以及pH值測定

用WYT-4型手持折光儀測定果實可溶形固型物含量；采用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定法測定可滴定酸，結(jié)果以蘋果酸百分含量表示；用pH計(PHS-25B)測定果汁pH值。

1.4.4離區(qū)細(xì)胞膜透性和丙二醛(MDA)含量的測定

離區(qū)組織細(xì)胞膜完整性以相對電導(dǎo)率作為評價標(biāo)準(zhǔn)，以煮沸前后的電導(dǎo)率比值表示相對電導(dǎo)率。MDA含量參照TBA比色法進行測定[9]，結(jié)果以nmol/gFW表示。

1.4.5離區(qū)活性氧代謝酶活性的測定

隨機稱取10g果穗離區(qū)凍樣，用50mL內(nèi)含2mmol/LEDTA和1g/LPVPP的200mmol/LPBS磷酸緩沖液(pH7.0)進行冰浴勻漿，10000×g冷凍離心20min(2℃)后取上清液用于測定活性氧代謝酶(SOD、CAT、APX和POD)活性和蛋白質(zhì)含量。SOD活性參考Beauchamp等[10]的方法進行測定，將反應(yīng)液1h內(nèi)抑制NBT光還原50%為1個酶活力單位；CAT活性參考Cakmak等[11]的方法進行測定，將酶促反應(yīng)液在240nm處1min降低0.001吸光值定義為1個酶活性單位；APX活性參照Nakano等[12]的方法進行測定，將酶促反應(yīng)液在290nm處1min降低0.001吸光值定義為1個酶活性單位；參考Kochba等[13]的愈創(chuàng)木酚法測定POD活性，將酶促反應(yīng)液在460nm處1min增加0.01吸光值定義為1個酶活性單位。以考馬斯亮藍法測定提取液中蛋白質(zhì)含量[14]。

1.4.6離區(qū)超氧陰離子(O2-•)和羥基自由基生成量(•OH)測定

隨機稱取5g果穗離區(qū)凍樣，用20mL冷丙酮冰浴勻漿，經(jīng)10000×g冷凍離心20min(2℃)后取上清液，沉淀另用10mL冷丙酮振蕩溶解并冷凍離心后取上清液，合并2次的上清液并定容至50mL備用。超氧陰離子和羥基自由基生成量的測定分別參考NBT光還原法[15]和脫氧核糖法進行[16]，結(jié)果均以nmol/gFW•min表示。

1.4.7離區(qū)細(xì)胞脂肪酸含量測定

取4g果穗離區(qū)鮮樣用10mL提取液[氯仿:甲醇:0.1mol/LHCl(200:100:1)]勻漿并離心，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用色譜純甲醇溶解。隨后采用C18Sep-Pak(購自Supelco公司，預(yù)先用甲醇活化)固相萃取小柱以內(nèi)含3%甲酸的色譜純甲醇溶液進行分離洗脫操作將其中色素吸附于固相中，洗脫液再用色譜純甲醇定容至25mL用于測定。脂肪酸組成的測定參照Valero-Garrido等[17]的氣相色譜法進行，使用配備FID檢測器的SP-6800A型氣相色譜儀進行測定，進樣口溫度、柱溫和檢測器溫度分別為180、195、165℃，載氣為氮氣。采用脂肪酸甲酯流出的保留時間定性，各脂肪酸甲酯按其碳原子數(shù)增加的次序依次流出色譜柱，若碳原子數(shù)相同，則按不飽和程度增加的次序流出。以外標(biāo)法測定相關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果均以μg/kgFW表示。

1.5數(shù)據(jù)分析

以上各測定指標(biāo)除腐爛率、落粒率、褐變指數(shù)和硬度重復(fù)10次外，其余指標(biāo)均重復(fù)3次。運用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，用Tukey多重比較方法進行差異顯著性檢驗，5%為顯著水平。

2結(jié)果與分析

2.1MeJA處理對葡萄果實采后落粒、腐爛及品質(zhì)的影響

如表1所示，葡萄果實在1℃貯藏期間，其落粒率、腐爛率和褐變指數(shù)均在貯藏前14d呈緩慢上升趨勢，而在貯藏14d后，落粒率、腐爛率和褐變指數(shù)急劇上升，至貯藏28d后，對照果實中落粒率、腐爛率和果心褐變指數(shù)分別達到54.43%、45.76%和15.32%；同時，葡萄果實在冷藏期間，其果肉TSS和TA含量逐漸下降，pH值逐漸升高，貯藏結(jié)束時，對照果實中TSS和TA含量較貯藏前下降了21.5%和13.6%，而pH值上升了15.8%。這些數(shù)據(jù)顯示，冷藏28d后葡萄果實食用和感官品質(zhì)明顯下降，基本失去商品性。10μmol/LMeJA處理顯著(p<0.05)抑制了葡萄果實在冷藏期間落粒率、腐爛率和褐變指數(shù)的上升，并延緩了果肉TA含量的下降和pH值的上升；1℃貯藏28d后，經(jīng)MeJA處理的葡萄果實中落粒率、腐爛率和褐變指數(shù)較對照果實下降了78.2%、70.1%和50.6%，TA含量和pH值較對照果實高出11.2%和8.6%。因此，10μmol/LMeJA處理可有效減慢葡萄果實采后貯藏期間品質(zhì)劣變速度，改善果實食用品質(zhì)。

2.2MeJA處理對葡萄果穗離區(qū)相對電導(dǎo)率和MDA含量的影響

如圖1所示，在1℃貯藏期間，對照葡萄果穗離區(qū)細(xì)胞中相對電導(dǎo)率和MDA含量均呈急劇上升趨勢，顯示離區(qū)細(xì)胞逐漸出現(xiàn)膜脂過氧化和衰老癥狀。10μmol/LMeJA處理顯著(p<0.05)抑制了貯藏期間離區(qū)細(xì)胞膜相對電導(dǎo)率和MDA含量的上升，從而有效控制了組織衰老癥狀的發(fā)展。

2.3MeJA處理對葡萄果穗離區(qū)組織中活性氧代謝酶和自由基生成量的影響

我們測定了貯藏期間葡萄果穗離區(qū)組織中活性氧代謝酶SOD、CAT、APX和POD活性以及主要的2種活性氧自由基超氧陰離子和羥基自由基的生成量，以分析離區(qū)細(xì)胞中活性氧代謝水平。如表2所示，在1℃貯藏期間，對照葡萄果穗離區(qū)組織中活性氧代謝酶SOD、CAT和APX活性在貯藏時間前14d緩慢上升，隨后呈現(xiàn)急劇下降趨勢，POD活性則隨貯藏時間的延長而緩慢下降；同時，對照葡萄果穗離區(qū)組織中超氧陰離子和羥基自由基生成量在貯藏期間逐漸增加，特別是貯藏14d后，其增加速度明顯加快。這些數(shù)據(jù)顯示，離區(qū)細(xì)胞中活性氧代謝在貯藏后期逐漸失調(diào)，從而導(dǎo)致活性氧自由基的大量積累。10μmol/LMeJA處理顯著(p<0.05)誘導(dǎo)了葡萄果穗離區(qū)組織中SOD、CAT和APX活性在貯藏前期的上升，而在貯藏14d后仍延緩了SOD、CAT和APX活性的下降；同時，MeJA處理有效抑制了離區(qū)POD活性的下降。與此相對應(yīng)，經(jīng)10μmol/LMeJA處理的果穗離區(qū)組織中超氧陰離子和羥基自由基生成量在整個貯藏期間均顯著(p<0.05)低于對照水平。

2.4MeJA處理對葡萄果穗離區(qū)細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響

為分析葡萄果穗離區(qū)細(xì)胞膜中脂肪酸的組成，我們測定了離區(qū)中不飽和脂肪酸亞油酸和亞麻酸以及飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸含量。如表3所示，對照葡萄果穗離區(qū)中不飽和脂肪酸亞油酸和亞麻酸含量在貯藏期間逐漸下降，但飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸含量卻緩慢上升。10μmol/LMeJA處理顯著(p<0.05)抑制了亞油酸和亞麻酸含量的降低，同時延緩了棕櫚酸和硬脂酸含量的上升，從而維持了細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度，延緩了細(xì)胞膜過氧化癥狀的發(fā)展。

3討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)10μmol/LMeJA的熏蒸處理可以顯著降低葡萄果實在采后貯藏期間腐爛率、落粒率和褐變指數(shù)，維持果實TSS和TA含量以及pH值，從而維持了果實食品品質(zhì)。這驗證了我們有關(guān)MeJA熏蒸處理可有效提高采后葡萄果實抗病性的結(jié)論[8]，同時也與我們前期有關(guān)10μmol/LMeJA熏蒸處理可有效抑制漿果類果實如楊梅[18]和草莓[19]采后腐爛發(fā)生和品質(zhì)下降的結(jié)論相一致。這表示外源MeJA處理在葡萄果實貯運保鮮中具有較好的應(yīng)用前景。

植物細(xì)胞中活性氧代謝水平與細(xì)胞衰老和死亡進程密切相關(guān)：正常植物細(xì)胞中活性氧代謝處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但高鹽、高溫、缺水和病原菌侵染等逆境脅迫會破壞植物體活性氧代謝的平衡，使其細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基過度生成，而過量自由基會攻擊細(xì)胞膜，導(dǎo)致膜脂逐漸過氧化和硬化，細(xì)胞膜流動性下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的崩潰。活性氧代謝酶SOD、CAT、APX和POD是植物中主要的酶促活性氧清除系統(tǒng)，這些活性氧代謝酶協(xié)同作用可清除植物組織中過量的活性氧自由基從而延緩膜脂過氧化進程[20]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)葡萄果穗在1℃貯藏期間，其離區(qū)組織中活性氧代謝酶活性逐漸下降，而活性氧自由基生成量卻逐漸上升，離區(qū)細(xì)胞膜也逐漸出現(xiàn)脂肪酸飽和度上升、相對電導(dǎo)率和MDA含量增加等過氧化癥狀，同時伴隨著葡萄果實落粒率的顯著上升。這說明在冷藏期間，葡萄果穗離區(qū)組織中活性氧代謝酶活性的下降造成了自由基的過度積累，從而導(dǎo)致離區(qū)細(xì)胞膜脂過氧化和果實落?，F(xiàn)象的發(fā)生。因此，活性氧代謝的失調(diào)導(dǎo)致的離區(qū)細(xì)胞衰老是采后葡萄果實落粒率增加的重要因素。

MeJA為茉莉酸(JA)的衍生物，具有較強揮發(fā)性且不易被離子化，可高效透過植物細(xì)胞膜發(fā)揮信號分子作用來誘導(dǎo)植物抗逆性反應(yīng)[4]。大量研究證實，外源MeJA處理可有效提高貯藏期間枇杷[5]和桃[7]果實中SOD、CAT、APX和POD活性的上升，從而有效抑制這些果實貯藏期間活性氧自由基的積累，抑制相對電導(dǎo)率或MDA含量的上升。我們先期研究也發(fā)現(xiàn)，10μmol/LMeJA也可明顯提升楊梅果實中抗氧化物質(zhì)的合成，從而有效延緩果實中超氧陰離子和羥基自由基生成量的上升[18]。在本實驗中，我們同樣發(fā)現(xiàn)10μmol/LMeJA可顯著誘導(dǎo)在1℃貯藏期間葡萄離區(qū)組織中SOD、CAT、APX和POD活性的上升并有效抑制超氧陰離子和羥基自由基的積累；同時，經(jīng)MeJA處理的果穗離區(qū)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量明顯高于對照水平，而飽和脂肪酸和MDA含量以及相對電導(dǎo)率則顯著低于對照水平。這些結(jié)果說明，10μmol/LMeJA處理可有效誘導(dǎo)貯藏期間果穗離區(qū)細(xì)胞中活性氧代謝酶活性的上升，維持活性氧代謝的平衡，從而有效抑制了自由基對離區(qū)膜脂的攻擊，提高了細(xì)胞膜不飽和度和流動性，并延緩了貯藏期間離區(qū)細(xì)胞的衰老進程，最終顯著降低了采后葡萄果實落粒率，改善果實品質(zhì)。