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煎餅是中國傳統(tǒng)食品之一。目前對于煎餅的研究多圍繞新產(chǎn)品的開發(fā)，生產(chǎn)過程中仍采用自然發(fā)酵，導(dǎo)致生產(chǎn)周期長、發(fā)酵過程不易控制、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。由于多采用傳統(tǒng)作坊式生產(chǎn)，衛(wèi)生狀況也跟不上現(xiàn)代食品企業(yè)的衛(wèi)生要求，使得這種具有鮮明文化特色的傳統(tǒng)食品長期處于原始落后的發(fā)展階段[1]，亟待實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。國內(nèi)外對食品中的微生物的分離鑒定已進(jìn)行了一些研究，如醬油[2]、傳統(tǒng)米酒、綠橄欖[3]。發(fā)酵是煎餅生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，對煎餅風(fēng)味形成和產(chǎn)品質(zhì)量有重要影響。酵母菌是發(fā)酵煎餅生產(chǎn)過程中重要的微生物，其具有改善產(chǎn)品風(fēng)味、延緩酸敗、增加營養(yǎng)成分及抗淀粉老化等作用。姚嶺柏[4]、龐彰等利用微生物酶浸泡蕎麥米飯能提高米飯的糊化度，使米飯抗老化能力提高。OLESENPT[5]等分別用翰遜氏德巴利酵母和產(chǎn)阮假絲酵母生產(chǎn)發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)其有助于促進(jìn)風(fēng)味的形成。本研究旨在通過對煎餅自然發(fā)酵糊中的酵母菌進(jìn)行分離鑒定，以獲得適合發(fā)酵煎餅規(guī)模化生產(chǎn)的優(yōu)良菌株[6]。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗(yàn)材料

煎餅發(fā)酵糊采自本溪寨香生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司煎餅生產(chǎn)車間的以大米、大豆、玉米、小米為原料的雜糧發(fā)酵煎餅。分離純化培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基(酵母浸出粉-蛋白胨-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基)、麥芽糖培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。理化鑒定培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源同化培養(yǎng)基、氮源同化培養(yǎng)基、無維生素培養(yǎng)基、產(chǎn)類淀粉培養(yǎng)基、高葡萄糖培養(yǎng)基、尿素分解培養(yǎng)基。

1.1.2試驗(yàn)儀器

HG303-恒溫培養(yǎng)箱、Gl01-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；立式高壓蒸氣滅菌鍋；數(shù)顯恒溫水浴箱：北京市光明醫(yī)療儀器廠；PHS-3C型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；OLYMPUS顯微鏡；DL-CJ2v單面凈化工作臺；720型分光光度計(jì)：尤尼柯儀器有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1酵母采集和擴(kuò)大培養(yǎng)

將無菌操作采集的樣品ZX-2010，浸入滅好菌的YPD液體培養(yǎng)基中，于25℃進(jìn)行72h擴(kuò)大培養(yǎng)[7]。

1.2.2酵母菌分離純化

利用梯度劃線法在YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，分離純化3代。再改用稀釋梯度分離法，用0.9g/100mL生理鹽水進(jìn)行稀釋，稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66個梯度，然后在YPD平板上用玻璃推子將菌液推平，每種涂3個平板，28℃培養(yǎng)72h。從平板中挑取單個菌落進(jìn)行平板劃線分離，28℃培養(yǎng)72h，鏡檢后，挑取形態(tài)不同的單菌落轉(zhuǎn)接5次，所得菌種接于斜面試管培養(yǎng)基于4℃冰箱保藏。

1.2.3酵母菌形態(tài)學(xué)觀察

采用美蘭染色法，觀察菌落大小，菌落質(zhì)地、菌落顏色、菌落表面特征、菌落邊緣、隆起度等特征[8]；子囊孢子形態(tài)觀察[9]、擲孢子的形成觀察、假菌絲的觀察、無絲狀營養(yǎng)細(xì)胞的顯微鏡觀察[8]。

1.2.4碳源同化試驗(yàn)

液體試管法：每管加無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基5mL，加被測試的碳源(蔗糖、麥芽糖、乳糖、乙醇、可溶性淀粉、D-木糖、半乳糖、甘油、檸檬酸、乳酸、肌醇、海藻糖)。接入新鮮菌液1mL，25℃培養(yǎng)1周后，觀察。

1.2.5氮源同化試驗(yàn)

將測試酵母進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，以消耗細(xì)胞內(nèi)多余的氮源，防止出現(xiàn)假陽性結(jié)果。將活化好的菌株接種在無菌碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，加入被測氮源(亞硝酸鈉、硝酸鉀、賴氨酸)，25℃培養(yǎng)5d。

1.2.6糖發(fā)酵試驗(yàn)

將葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、海藻糖、纖維二糖等6種糖，分別用酵母發(fā)酵，25℃培養(yǎng)2周，觀測其發(fā)酵結(jié)果。

1.2.7其他生理生化試驗(yàn)

無維生素培養(yǎng)試驗(yàn)，高糖培養(yǎng)試驗(yàn)，產(chǎn)類淀粉試驗(yàn)，尿素分解試驗(yàn)[8]。

1.2.8酵母菌耐酸能力測定

將YPD液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7分別接種分離酵母菌，28℃培養(yǎng)72h，以未接種的各酸度培養(yǎng)基作空白，于波長560nm處測定A值[10]。

1.2.9酵母菌糖化能力的測定

將分離到的菌株，分別制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的酵母浸出溶液后，用DNS法測糖化酶活力[11]。分別取1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8mL加入DNS試劑2mL，沸水浴加熱2min，冷卻，在540nm波長下測定吸光度A值，制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。用1%淀粉液、緩沖液、蒸餾水、酵母浸出液稀釋后加入DNS試劑混合，沸水加熱2min，在540nm波長下測定吸光度A值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出葡萄糖濃度數(shù)，求出糖含量。

2結(jié)果與討論

2.1結(jié)果

2.1.1菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

煎餅糊經(jīng)過自然發(fā)酵，采用YPD培養(yǎng)基從樣品中共分離純化出5種優(yōu)勢酵母菌株，分別標(biāo)記為1#、2#、3#、4#、5#，觀察分離菌株的菌落及菌體形態(tài)特征，結(jié)果見表1。酵母菌的菌落形態(tài)均為圓形，表面大多光滑濕潤有光澤、邊緣整齊、菌落均呈乳白色、不透明，菌體多為圓形或橢圓形。各菌株均有芽殖現(xiàn)象，且均有假菌絲，均不產(chǎn)生擲孢子。

2.1.2酵母菌的生理生化鑒定

樣本ZX-2010分離純化菌株的糖發(fā)酵試驗(yàn)見表2，碳源同化試驗(yàn)見表3，氮源同化試驗(yàn)見表4，其他生理生化試驗(yàn)見表5。其中3#、5#半乳糖同化陽性、硝酸鹽同化反應(yīng)陰性、無維生素不生長、不分解尿素等特征符合假絲酵母屬的特征；1#號賴氨酸同化陰性、硝酸鹽同化反應(yīng)陰性、尿素水解陰性等特征符合釀酒酵母特征；2#葡萄糖發(fā)酵陰性、淀粉生長陽性符合褶皺酵母特征；4#無維生素生長陰性符合發(fā)酵畢赤酵母特征；3#淀粉生長陽性、0.01%放射菌酮生長陽性等符合熱帶假絲酵母特征。根據(jù)上述菌落和菌體的形態(tài)學(xué)鑒定以及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，對照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[8]對酵母菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果為1#菌為釀酒酵母，2#菌為褶皺假絲酵母，3#菌為熱帶假絲酵母，4#菌為發(fā)酵畢赤氏酵母，5#菌為滑假絲酵母。

2.1.3酵母菌耐酸能力的測定

在煎餅發(fā)酵過程中，酵母菌往往需要耐受雜菌所造成的酸性環(huán)境，通常發(fā)酵煎餅糊的最終pH值可降到4。因此試驗(yàn)測定酵母菌在不同pH值下生長情況，可以更好地了解其對酸性環(huán)境的耐受能力結(jié)果見圖1。如圖1可見，酵母菌在pH值為3時(shí)均不生長，最適條件都在pH值為5~6。其中1#、2#、3#菌株長勢較好，而其他菌株都受到不同程度的影響。因此選擇1#、2#、3#適合作為發(fā)酵煎餅發(fā)酵菌。2.1.4酵母菌糖化活力的測定煎餅經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生的糖的含量直接影響煎餅的風(fēng)味和口感，因此酵母菌的糖化能力是鑒定酵母菌株的重要指標(biāo)，酵母菌糖化所得到的葡萄糖含量見表6。如表6所示，1#、2#、4#產(chǎn)糖量分別為0.854、0.639、0.716mg/mL，產(chǎn)糖能力明顯高于其他菌株。

2.2討論

自然發(fā)酵屬于多菌種混合發(fā)酵，含有多種酵母菌，發(fā)酵過程中多種微生物共同作用產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì)[12]。發(fā)酵煎餅中的主要微生物所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有類脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等酶活性。酵母菌的脂肪酶和蛋白酶能分解原料中的脂肪和蛋白質(zhì)，有利于煎餅攤制成型的形成。其中釀酒酵母的數(shù)量最多，釀酒酵母也廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中[13-14]，如面包、香腸等面食及肉食品中，酵母菌有利于改善谷物發(fā)酵制品的風(fēng)味和口感，去除發(fā)酵制品的不良風(fēng)味，而且能改善產(chǎn)品的風(fēng)味和延長保質(zhì)期。發(fā)酵煎餅中的酵母菌也有類似的作用，酵母菌等含有豐富的α-淀粉酶和糖化酶，發(fā)酵過程中酵母菌產(chǎn)生的酶將淀粉分解成各種糖類物質(zhì)，發(fā)酵過程降解淀粉產(chǎn)生醇、酸、酯、醛、酮等多種風(fēng)味物質(zhì)[15-16]，使發(fā)酵煎餅經(jīng)攤制后有自然的發(fā)酵香味，同時(shí)發(fā)酵過程產(chǎn)生的淀粉酶使一部分淀粉分解成葡萄糖，在煎餅攤制過程中與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)也使煎餅的色澤更加誘人。這就是發(fā)酵煎餅品質(zhì)優(yōu)于不發(fā)酵煎餅的原因之一。

酵母菌除了對風(fēng)味有明顯的影響外，在加工性質(zhì)及保藏品質(zhì)方面也有積極的影響[17]。發(fā)酵過程可以一定程度上降低煎餅糊的黏度，使其在加工時(shí)減少攪拌阻力，有利于煎餅攤制成型。淀粉經(jīng)過發(fā)酵，一部分淀粉粒分解成小分子的多糖和單糖，降低了淀粉的糊化溫度[18]，在煎餅攤制的過程中減少加熱時(shí)間。在保藏中可延長產(chǎn)品保質(zhì)期，延緩產(chǎn)品老化。通過對分離結(jié)果分析表明，煎餅自然發(fā)酵糊中的主要微生物為酵母菌，因此發(fā)酵溫度保持在28~30℃，酵母菌的生長最旺盛，發(fā)酵效果最好，也能有效地控制雜菌的生長，防止發(fā)酵煎餅糊酸度過大抑制酵母菌的生長，從而減少雜菌對煎餅的風(fēng)味和口感的影響[19]。

3結(jié)論

從自然發(fā)酵煎餅中分離鑒定出的5種優(yōu)勢菌株分別是釀酒酵母、褶皺假絲酵母、熱帶假絲酵母、發(fā)酵畢赤氏酵母、滑假絲酵母。通過耐酸能力和糖化能力測試，釀酒酵母、褶皺假絲酵母、熱帶假絲酵母、發(fā)酵畢赤氏酵母作為發(fā)酵煎餅的適合的發(fā)酵菌株。