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探討大麥遺傳多樣性的功用

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探討大麥遺傳多樣性的功用

本研究以栽培青稞品種(系)為材料,采用IT-ISJ標(biāo)記技術(shù)分析了該標(biāo)記在大麥中應(yīng)用的可行性,并評價(jià)了這些材料間的遺傳關(guān)系,可為大麥育種、品種鑒定、新品種保護(hù)與利用提供依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料供試材料共34份,包括西藏材料9份(XZ1-XZ9)、甘肅材料5份(GS1-GS5)、四川材料5份(SC1-SC5)及9份青海材料(QH1-QH9)和6份國外材料(AB1-AB6)。其名稱及來源見表1。這些材料現(xiàn)保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)大麥研究中心。1.2方法1.2.1gDNA的提取。gDNA提取采用CTAB法[6]。

每份材料取新鮮健康的幼葉約300mg,置于液氮中迅速研磨至粉末,隨后將粉末轉(zhuǎn)移到2ml離心管中,加入800μL65℃預(yù)熱的2×CTAB提取液[0.2mmol/LTris-HCL(PH約8.0),0.02mmol/LEDTA,55mmol/LCTAB,2%β-巰基乙醇)]于65℃水浴至少50min,期間輕輕顛倒混勻幾次,取出離心管冷卻至室溫,然后加入800μL氯仿:異戊醇(24:1)輕搖10min后靜置30min,11000r/min離心15min,取上清液加入等體積的異丙醇沉淀DNA,用70%乙醇沖洗2次,90%乙醇再?zèng)_洗1次,干燥后加入50μl滅菌的ddH2O,用紫外分光光度計(jì)檢測其濃度與質(zhì)量。將DNA稀釋至20ng/μL于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2IT-ISJ反應(yīng)體系。PCR引物(表2)采用鄭靚等[2]已發(fā)表的引物,由上海英捷貿(mào)易有限公司合成。引物組合以正反向引物名稱的最后兩個(gè)字母組合表示。PCR擴(kuò)增通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選出最佳體系,總體積20μL,包括20ng/μL模板DNA2μL,1.5mmol/L的MgCl2,0.2mmol/L的dNTPs,0.5μmol/L引物,1UTaq聚合酶,2μL10×PCRbuffer。在PTC-200擴(kuò)增儀上完成。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min,94℃變性45s,53℃退火45s,72℃延伸lmin,40個(gè)循環(huán),72℃延伸10min,4℃保存。1.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物加3×Loading-Buffer10μL,95℃變性5min后,用預(yù)熱30min的8%變性聚丙烯酰胺凝膠恒功率75w電泳,至指示劑離膠板底部三分之一處(約45min),取下膠板。采用銀染法檢測[5]。用數(shù)碼相機(jī)拍照,統(tǒng)計(jì)帶型。1.2.4數(shù)據(jù)的處理。對IT-ISJ擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果采用0、1、-9統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫,在相同遷移位置有帶記為1,無帶記為0,模糊不清或其他原因記為-9。

遺傳多樣性指數(shù)(H)按H=1-∑Pi2(Nei等,1979)[7]計(jì)算,其中Pi為某座位第i個(gè)等位變異的頻率。利用NTSYS-pc統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)(GS)。計(jì)算公式為:GS=2Nij/(Ni+Nj),其中Nij為材料i和j共有的擴(kuò)增片段數(shù),Ni為材料i中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù),Nj為材料j中出現(xiàn)的擴(kuò)增片段數(shù)。2結(jié)果與分析2.1引物組合篩選用10個(gè)正向引物和12個(gè)反向引物組成的120對引物組合,對選取的兩個(gè)品種(北青2號(hào)、北青3號(hào))進(jìn)行多態(tài)性篩選,其中74對引物能擴(kuò)增出條帶,占引物組合總數(shù)的61.67%。有55對引物組合能擴(kuò)增出多態(tài)性,多態(tài)性比例占45.83%。并用相同引物對和模板進(jìn)行多次擴(kuò)增和電泳,其帶型沒有變化,表明IT-ISJ標(biāo)記在大麥上具有較好的重現(xiàn)性。從這55對引物中選取擴(kuò)增性較好、重復(fù)性較高的20對引物對所有材料進(jìn)行多態(tài)性分析,統(tǒng)計(jì)在100~2000bp之間能夠清晰可辨的電泳條帶。其中,引物組合IT-ISJ02F47R可區(qū)分11個(gè)品種,而引物組合IT-ISJ08F52R、IT-ISJ08F54R、IT-ISJ08F55R和IT-ISJ11F54R各自能區(qū)分10個(gè)品種。特別是可用5個(gè)引物組合(IT-ISJ02F08R、IT-ISJ02F42R、IT-ISJ08F52R、IT-ISJ08F54R、IT-ISJ08F55R)就能將本試驗(yàn)中的34份材料區(qū)分開,占引物組合總數(shù)的25.00%。2.2多態(tài)性分析圖1為引物組合IT-ISJ05F18R擴(kuò)增產(chǎn)物部分電泳圖。發(fā)現(xiàn)不同的引物對擴(kuò)增的條帶數(shù)、擴(kuò)增帶型都不同(表3)。從表3看出,在總樣本中,20對引物組合共產(chǎn)生清晰可辨的條帶數(shù)為1~8條,大部分在4條以上,總計(jì)87條,平均每個(gè)引物對4.35條,其中81條具有多態(tài)性,平均多態(tài)性條帶為4.05條,多態(tài)性條帶為93.10%。在這20對引物中,3個(gè)引物對IT-ISJ02F18R、IT-ISJ11F46R、IT-ISJ05F18R的多態(tài)性條帶比率分別為50.00%、60.00%、71.42%,其余17對引物的多態(tài)性條帶比率為100%。這表明IT-ISJ標(biāo)記適合于對大麥進(jìn)行DNA多態(tài)性分析。2.3等位變異與遺傳相似性從表3可知,20對引物共擴(kuò)增出134個(gè)等位變異(帶型),變幅在2~11個(gè),平均每個(gè)引物對檢測到6.70個(gè)。34份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變幅在0.437~0.931之間,平均為0.743±0.094。其中,l來自墨西哥的CI-424(AB4)和北青3號(hào)系選的SC5間相似系數(shù)最小(0.436),而北青1號(hào)(QH2)和北青2號(hào)(QH3)間相似系數(shù)最大,達(dá)0.931。

供試材料中,相似系數(shù)<0.75的材料組合有238個(gè),占組合總數(shù)的42.42%,相似系數(shù)>0.75的材料組合有323個(gè),占所有供試組合的57.58%。材料間平均遺傳距離較低,僅為0.257,遺傳多樣性在0.2509~0.8460之間,平均為0.59。這表明供試材料間的遺傳差異較小。3討論與小結(jié)IT-ISJ(introntargeredintron-exonsplicejunction,內(nèi)含子-外顯子拼接位點(diǎn))DNA分子標(biāo)記技術(shù)是近年來由鄭靚等(2008)[2]開發(fā)出的,具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、引物設(shè)計(jì)簡便、操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn),已在陸地棉[2]、花生[3]、蘋果[4]上有報(bào)道。但該標(biāo)記應(yīng)用于大麥上還未見報(bào)道。

在本研究中,我們首次用IT-ISJ的10個(gè)正向引物和12個(gè)反向引物組成120對引物,對選取的2個(gè)青稞品種(北青2號(hào)、北青3號(hào))進(jìn)行了引物對的篩選。篩選出多態(tài)性較高、帶型豐富、條帶清晰的引物組合55個(gè),占引物組合總數(shù)的45.83%,遠(yuǎn)高于紀(jì)君超等(2010)[4]在加工蘋果品種中報(bào)道的結(jié)果。從55對引物組合中選取20對引物組合對34份青稞品種(系)進(jìn)行了多態(tài)性分析,共擴(kuò)增出87條帶,其中多態(tài)性帶81條,平均每對引物組合擴(kuò)增出4.05條帶,多態(tài)性百分率為93.10%。而多態(tài)性高達(dá)100%的引物組合數(shù)達(dá)17個(gè),占85.00%,明顯高于鄭靚等(2008)[2]在陸地棉、于樹濤等(2009)[3]在花生上及紀(jì)君超等(2010)[4]在蘋果中所得結(jié)果。在這20對引物中,3個(gè)引物對IT-ISJ02F18R、IT-ISJ11F46R、IT-ISJ05F18R的多態(tài)性條帶比率分別為50.00%、60%、71.42%。從圖1和表3看出,不同的引物對擴(kuò)增的條帶數(shù)、擴(kuò)增帶型都不同。引物組合IT-ISJ02F47R可區(qū)分11個(gè)品種,而引物組合IT-ISJ08F52R、IT-ISJ08F54R、IT-ISJ08F55R和IT-ISJ11F54R各自能區(qū)分10個(gè)品種。特別是僅用5個(gè)引物組合(IT-ISJ02F08R、IT-ISJ02F42R、IT-ISJ08F52R、IT-ISJ08F54R、IT-ISJ08F55R)就能將本試驗(yàn)中的34份材料區(qū)分開,占引物組合總數(shù)的25.00%。

上述結(jié)果表明,采用IT-ISJ引物組合對青稞品種(系)能擴(kuò)增得到條帶清晰、穩(wěn)定性較好、多態(tài)性較高的條帶、且操作簡單、成本較低,這表明IT-ISJ標(biāo)記應(yīng)用在大麥上是可行的,將在大麥遺傳多樣性分析、品種鑒定,遺傳圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助選擇育種中得到廣泛的應(yīng)用。34份材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變幅在8大麥與谷類科學(xué)BARLEYANDCEREALSCIENCESNO.4.20120.437~0.931之間,平均為0.743±0.094。供試材料中,相似系數(shù)<0.75的材料組合有238個(gè),占組合總數(shù)的42.42%,相似系數(shù)>0.75的材料組合有323個(gè),占所有供試組合的57.58%。材料間平均遺傳距離僅為0.257,平均遺傳多樣性為0.59。這表明供試材料間的遺傳差異較小,遺傳基礎(chǔ)較窄,遺傳關(guān)系較近。因此,大麥育種者在雜交育種中應(yīng)廣泛發(fā)現(xiàn)和挖掘優(yōu)異青稞資源,擴(kuò)大青稞種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ),提高青稞育種效率。

作者:余春磊劉家嫻齊國昌羅小嬌劉新春馮宗云單位:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物遺傳育種學(xué)系大麥研究中心四川甘孜藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所

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