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本文作者：吳鋮鋮李麗張慧娟李大勇宋鳳鳴作者單位：浙江大學(xué)植保系農(nóng)業(yè)部作物病蟲分子生物學(xué)重點開放實驗室

黑點根腐病最重要的診斷癥狀是發(fā)病植株根表面形成的黑色、球形的病菌子囊殼，散生于根部，在生長季節(jié)后期很容易觀察到［4］，但一般在植株死亡幾天后才是子囊殼最多的時期。這可能會造成病害誤診或延遲診斷。埋生于壞死根部的子囊殼，在根從土中拔出之前已經(jīng)脫落，所以很難觀察到。當(dāng)子囊殼成熟時，向土壤釋放子囊孢子。

黑點根腐病菌的生物學(xué)性狀

1974年P(guān)ollack和Uecker［5］從洋香瓜黑點根腐病罹病株根部分離得到病原菌，創(chuàng)立Monospo-rascus新屬，并將黑點根腐病病原菌命名為M．cannonballus。M．cannonballus為子囊菌門，主要特征:子囊中僅具1～3個(最多6個)子囊孢子，子囊孢子球形，烏黑色，較大(25～55μm)。Monosporascus屬下已報道4種，除M．cannonbal-lus外，還有擬彎孢單孢囊菌M．eutypoides、M．ibericus和M．monosporus，其中M．cannonballus和M．eutypoides都可以為害瓜類作物引起病害，差別在于M．cannonballus的子囊內(nèi)只有一個子囊孢子且不發(fā)芽，而M．eutypoides的子囊內(nèi)常見有2個子囊孢子且迅速發(fā)芽［4］。M．cannonballus子囊殼具孔口，初埋生，成熟后突破寄主表皮而外露，球形，碳質(zhì)，黑色，直徑可達500μm;子囊殼壁厚，由數(shù)層厚壁的密絲組織構(gòu)成，外層殼壁有色，內(nèi)層無色;側(cè)絲細長，具隔膜;子囊梨形、囊狀、棍棒狀或近三角形，壁單層，具柄，無色，含1個或偶2～3個子囊孢子［4］;一個子囊內(nèi)只產(chǎn)生一個大而圓形的子囊孢子，子囊孢子多核，一般8個核，偶16個核［4］。子囊孢子萌發(fā)時有1～3個芽管，芽管自子囊孢子上的一條線型裂縫萌發(fā)，而不是萌發(fā)孔。芽管穿過根部表皮時，不形成附著包結(jié)構(gòu)［6］。菌絲在根部細胞內(nèi)不分枝生長，直達維管柱，可定殖于原聲木質(zhì)部和次生木質(zhì)部的導(dǎo)管，但不會通過維管系統(tǒng)到達植物組織的地上部分［7］。M．cannon-ballus未見無性世代。M．cannonballus為同宗配合，易在寄主植物根部產(chǎn)生子囊殼，可在人工培養(yǎng)基上體外培養(yǎng)［4］。其子囊孢子厚壁，易抗旱及其他因子。子囊孢子在人工培養(yǎng)基上不易發(fā)芽［4］，但瓜類幼苗的根部滲出液可促進子囊孢子的萌發(fā)，因此子囊孢子一般只在葫蘆科植物根圍萌發(fā)［8］。大田試驗證明，無菌土壤中僅有瓜類幼苗的根部滲出液不足以刺激子囊孢子的萌發(fā)，還需根際微生物，特別是放射菌類的誘導(dǎo)［9］。黑點根腐病菌適應(yīng)炎熱、干旱的氣候環(huán)境［4］。體外培養(yǎng)時菌絲最適生長溫度為25～35℃，子囊殼最易產(chǎn)生的溫度為25～30℃;該菌55℃仍可存活，但60℃處理90min即死亡;菌絲生長的pH范圍為5～9，最適6～7，pH≤4不能生長［4］。M．cannonballus也能在鹽堿土中存活。M．cannonballus在PDA、V-8等常用培養(yǎng)基均可生長，一般2～3周即可形成成熟的黑色子囊殼。人工培養(yǎng)條件下，菌落呈淺灰色或暗白色，黑色子囊殼埋生在培養(yǎng)基中。環(huán)境因子對菌絲生長和子囊殼形成具有直接影響，如培養(yǎng)基的水勢在－0.6～－0.8MPa時菌絲生長最好，水勢＜－1.8MPa時菌絲生長下降;子囊殼形成對水勢更為敏感，一般只能在水勢≥－0.7或－0.8MPa的PDA培養(yǎng)基中才會產(chǎn)生子囊殼［10］。菌落可以產(chǎn)生色素，使菌絲顏色逐漸改變，從黃色到橙色，再到咖啡色，變色菌落中可以確定有5種有色代謝物［11］。變色菌落生長緩慢，幾乎不形成子囊殼，毒力降低，菌落容易退化或死亡，這可能與己烯酮類物質(zhì)有關(guān)［12］，三環(huán)唑可以抑制新鮮野生菌株的黑色素合成，但對退化菌株產(chǎn)生的己烯酮類物質(zhì)沒有絲毫影響［13］。另外，含有dsRNA病毒的M．cannonballus菌株通常會有菌落異常表現(xiàn)［14－16］。美國、日本、西班牙等國采集的M．cannon-ballus菌株在菌落形態(tài)、子囊孢子產(chǎn)量、致病性、ITS和5.8SrRNA等方面都很一致，種間幾乎沒有明顯差異，但美國菌株的營養(yǎng)體親和性與世界其他地區(qū)菌株有差異［4］。

黑點根腐病菌的寄主范圍

甜瓜和西瓜是M．cannonballus的主要寄主。在人工接種條件下，M．cannonballus也可侵染其他葫蘆科植物，如黃瓜、瓠瓜和南瓜屬植物等，但大田條件下很難成功侵染。據(jù)報道，其他非葫蘆科植物可在人工接種或大田條件下，支持M．cannonballus生長，但不引起病害［4］。

病害循環(huán)

研究表明，黑點根腐病的初侵染源主要來自已經(jīng)萌發(fā)的子囊孢子和土壤中、病殘組織上存活的菌絲。病菌子囊殼產(chǎn)生最多的時期是瓜類生長季節(jié)后期，但在病菌生活史中都可形成子囊殼。每個子囊殼成熟破裂，向土壤中釋放幾百個子囊孢子，一個瓜類作物根系可以產(chǎn)生40萬個以上的子囊孢子［17］。子囊孢子在植株根部附近萌發(fā)形成芽管，芽管穿過根部表皮使菌絲侵入健康植株根部，定殖于皮層和木質(zhì)部，造成小根死亡，大根上則呈現(xiàn)很多病斑。病菌持續(xù)定殖寄主根部組織，侵入木質(zhì)部引起植物形成侵填體。黑點根腐病菌侵入木質(zhì)部后，癥狀類似于枯萎病或黃萎?。?］。最近發(fā)現(xiàn)，黑點根腐病菌子囊孢子只在瓜類作物根圍萌發(fā)，特定的根系滲出物有利于子囊孢子萌發(fā)后在瓜類作物根部的附著，而且黃瓜油壺菌定殖甜瓜根部組織后，可以促進黑點根腐病菌子囊孢子在植株根圍的萌發(fā)［18］。

病害流行規(guī)律

黑點根腐病是單年流行病害，既沒有氣流傳播階段，也沒有無性世代［4］。子囊孢子是最重要的接種體，可以在土壤和植物病殘體上存活，甚至在寄主存在情況下可休眠存活很多年。病菌適應(yīng)水含量高的土壤［19］，作物殘體上的菌絲體雖可作為接種體來源，但目前還不知道病菌菌絲體在土壤中到底能存活多長時間。相對于輪作來說，瓜類作物連作土壤中子囊孢子的數(shù)量要高得多［4，20］，但是發(fā)病所需的起始孢子數(shù)量目前不清楚。在每克土壤含1～15個孢子的田塊，都可能引起病害嚴重發(fā)生。從播種到初見癥狀期間，土壤孢子量下降，可能是孢子萌發(fā)和對寄主根部侵染引起的，但在藤蔓凋萎期，土壤孢子含量明顯上升［21］。土壤中孢子密度與土壤pH呈負相關(guān)，而與發(fā)病率、粘土比例和對比與其他土壤的變性土呈正相關(guān)［22］。子囊孢子在土壤中分布并不均一，土表25cm以內(nèi)孢子含量最高［23］。病菌可以在其他單雙子葉植物根部定殖和繁殖，為其存活和繁殖提供條件，但這些植物一般不表現(xiàn)病害癥狀。此外，在美國德克薩斯州、亞利桑那州和巴西的天然沙質(zhì)土壤和非種植田塊，也發(fā)現(xiàn)黑點根腐病的子囊孢子［24］。因此，黑點根腐病是典型的土傳病害，而且病害的發(fā)生流行比我們想象的要復(fù)雜得多。病菌主要靠栽培、流水、風(fēng)、作物殘體和帶菌土壤等因子在田間傳播蔓延，但由于子囊孢子體積大，缺少無性孢子，子囊孢子很難空中傳播。目前還沒有證據(jù)表明種子可以帶菌。果實和葉片表現(xiàn)的病害癥狀是由于根部為害引起的，但病菌并不能直接侵染果實和葉片。病菌侵染為害容易受到土壤環(huán)境因子的影響，土溫25～35°C有利于發(fā)病，特別是瓜類作物生長早期的土溫是病害發(fā)生的重要影響因子［25］。夏末或秋季播種瓜類作物的黑點根腐病發(fā)生更加嚴重。土壤的電導(dǎo)率和含水量也影響病害的發(fā)生，在高溫、高電導(dǎo)率但水分含量低的土壤中，病害發(fā)生嚴重［26］。在果實成熟期，摘除受侵植株上的果實，會延遲癥狀表現(xiàn)，甚至可以阻止植株萎蔫和死亡［4，27］。根、莖維管束組織中侵填體的形成以及次生根和二級側(cè)根的死亡造成藤蔓很快凋萎、甚至死亡，常見大批瓜蔓“一夜凋萎”現(xiàn)象。

防治方法

黑點根腐病的防治十分困難，目前還沒有一個有效的防治技術(shù)體系，主要原因是:(1)病菌寄主范圍較廣，可在多種單、雙子葉植物上定殖和繁殖;(2)多年連作使得土壤中積累大量病菌;(3)病菌厚壁子囊孢子在土壤中存活多年，植物根圍和土壤固有的緩沖能力使得病菌耐干旱和化學(xué)試劑;(4)農(nóng)事操作如蓋膜和灌溉為病菌的侵染和存活創(chuàng)造了適宜的環(huán)境;(5)耕作粗放，根系發(fā)育不良，長勢不旺，抗病力較低;(6)缺少瓜類抗病資源。盡管防治難度很大，但是通過各種有效手段的有機結(jié)合，可以提高黑點根腐病的防治效果。

1土壤化學(xué)處理

最有效的方法是土壤熏蒸。有效的熏蒸劑有溴甲烷、三氯硝基甲、啶酰菌胺、1，3-二氯丙烯或威百畝等。溴甲烷已經(jīng)禁止使用，但氟啶胺由于其移動率高，滴灌使用有一定防效［28］，在以色列春季種植期能有效控制黑點根腐病，但對夏季作物黑點根腐病的防效較差。嘧菌酯、咪鮮胺等常用農(nóng)藥土壤處理可以控制黑點根腐病的發(fā)生，秋季瓜施用2次、春季瓜施用3次有較好的防效［29］。美國不允許使用氟啶胺，而采用咯菌睛滴灌施藥。在加利福尼亞，采用分階段土壤熏蒸技術(shù)來防治黑點根腐病，如種植前土壤熏蒸，可減少土壤中病原接種體數(shù)量，種植后土壤熏蒸則可抑制病菌在瓜類作物根部的定殖，而采收后施用威百畝來防止殘存病菌子囊孢子形成，減少土壤病菌數(shù)量。農(nóng)藥殘留檢測發(fā)現(xiàn)在甜瓜果實中有啶酰菌胺殘留，因此只在座果前才可使用啶酰菌胺［30］。

2曬田

由于病原菌可在高溫條件下生長，在美國和以色列采用傳統(tǒng)的曬田手段對防治黑點根腐病無效。在以色列，采用一種改進的曬田方式，即開放套管式曬田，并結(jié)合低劑量土壤熏蒸劑施用，對黑點根腐病有很好的防治效果，并可防治其他土傳病害［29，31］。

3選育抗病品種

抗病品種是防治的最佳手段。但是，目前缺乏黑點根腐病的抗源。目前，甜瓜亞種、加利亞瓜和菠蘿型瓜等瓜類家族具有耐病性。在美國，目前還沒有對黑點根腐病有抗性或耐性的甜瓜品種［4］，但根系發(fā)育良好、長勢旺的品種不容易發(fā)病。以往選育耐病品種，僅根據(jù)不同接種條件下品種的耐病程度，很少涉及品種形態(tài)、生態(tài)學(xué)上的抗病機制。研究發(fā)現(xiàn)，根部壞死程度、根構(gòu)型及根蔓比例平衡同樣也是耐病品種的評價標準［32］。

4嫁接防病

把感病香瓜和西瓜嫁接到南瓜屬或葫蘆屬砧木，是防治黑點根腐病的有效手段［33］。在亞洲和地中海地區(qū)，嫁接西瓜主要用于防治枯萎病，但用南瓜屬和瓠瓜砧木嫁接西瓜，可以防治黑點根腐病的發(fā)生。在許多葫蘆科植物的砧穗組合親和性較好，南瓜屬或葫蘆屬作物大而廣的根系可以抵御黑點根腐病菌侵入。在使用嫁接技術(shù)的過程中應(yīng)注意，由于同一個砧木品種的長期使用很容易感染病原菌，從而幫助病菌在土壤中形成潛在接種體［28，34］。

5生物防治

dsRNAs侵染黑點根腐病菌后常導(dǎo)致毒性下降［14－16］，導(dǎo)致生長速率和繁殖能力降低［35］，因此可以利用低毒分離株系防治黑點根腐?。?6］。dsRNA經(jīng)菌絲融合轉(zhuǎn)導(dǎo)進入正常野生型毒性菌株，使其變?yōu)榈投揪?，降低發(fā)病。但是，低毒菌株可通過高溫擴大培養(yǎng)回復(fù)到野生型菌株的致病力。同時，用磷酸鹽、苯并噻二唑、茉莉酸甲酯等誘抗因子浸種或葉面噴施可以提高甜瓜植株抗性，在溫室試驗中減輕黑點根腐病發(fā)病嚴重度，成為一種潛在的防治策略［37］。

6清除菌源

銷毀作物殘體是很多病害防治的常用手段。黑點根腐病的孢子作為侵染根部的接種體，主要在作物收獲結(jié)束后在寄主根部形成。在病原菌繁殖之前就銷毀罹病植株，特別是罹病根部殘體，是一實用性很高的防治方法，可以有效阻止土壤中病菌的存活和繁殖［38，39］。

展望

黑點根腐病是甜瓜上的一種毀滅性土傳真菌病害，建立切實可行的防治技術(shù)體系需要研究解決諸多的問題。(1)抗病品種選育。雖然目前沒有發(fā)現(xiàn)瓜類作物中對黑點根腐病抗病資源，但是研究發(fā)現(xiàn)根系發(fā)育良好、長勢旺的品種不容易發(fā)病，因此結(jié)合根系性狀開展甜瓜耐病品種選育可能是一條可行的途徑。(2)病菌在土壤中的生物學(xué)特性。黑點根腐病是土傳病害，其防治需要從土壤處理著手;另外，長期連作會引起病菌在土壤中大量積累，加重發(fā)病。因此，研究明確土壤中病菌子囊孢子萌發(fā)與侵染等生物學(xué)特性及其影響因子有助于開發(fā)新的防治策略，如土壤處理藥劑等。(3)病害快速診斷。黑點根腐病發(fā)病初期在植株地上部分不表現(xiàn)明顯癥狀，因而給病害的早期診斷和防治增加了難度，建立病菌快速、簡便的分子診斷技術(shù)有助于病害的早期發(fā)現(xiàn)，國外學(xué)者以真菌核糖體RNA上的保守ITS區(qū)段引物，利用實時定量PCR方法建立根部組織中M．cannonballus的早期檢測技術(shù)［40］，也可用于篩選抗病品種或植株［40］。(4)對國內(nèi)甜瓜產(chǎn)業(yè)的風(fēng)險。目前我國甜瓜上未見黑點根腐病大面積發(fā)生的報道，但是最近在甘肅省中部半干旱地區(qū)發(fā)現(xiàn)甜瓜黑點根腐?。?］。因此，黑點根腐病是我國甜瓜上一種潛在的危險性真菌病害，需引起高度重視。