種質研究論文：種質研究生物科技運用簡述
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本文作者：王真真郭新苗辛杰張榮超郭慶梅周鳳琴作者單位：山東中醫(yī)藥大學
生化標記技術
1用于親緣關系的判斷
不同品種、產地栝樓的蛋白電泳圖譜都會出現(xiàn)不同程度的差異[31]。孫稚穎等[32]采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對山東栝樓農家栽培品種、野生種以及湖北栝樓的種子蛋白進行了分析。研究表明，山東優(yōu)質農家品種仁瓜蔞、牛心瓜蔞的種子蛋白電泳譜圖具有明顯的相似性；小光蛋與野生栝樓的蛋白電泳譜圖最相似；湖北栝樓與各山東品種在蛋白電泳圖譜上有明顯差異。這些結果結合性狀特征從蛋白水平上說明：仁瓜蔞和牛心瓜蔞屬于優(yōu)質品種；小光蛋與野生品種較接近，品質稍差；湖北栝樓與栝樓是同科同屬不同組別的物種。
2用于栽培品種的鑒定
同工酶電泳圖譜譜帶發(fā)生多態(tài)性變化，反映了生物在蛋白質水平上的多型性，可作為生物遺傳變異的證據[33]。孫稚穎等[34]以過氧化物酶同工酶及酯酶同工酶分析為手段，以山東栝樓的各農家栽培品種以及野生種的幼苗為實驗材料，進行了同工酶電泳分析，結果表明，各農家栽培品種間及與野生種之間的酶帶數量、帶級、位點及活性強度等的差異可作為品種鑒定的依據；根據其同工酶譜圖的相似程度判斷，牛心瓜蔞與仁瓜蔞，野生栝樓與小光蛋，大瓜蔞、八棱瓜蔞及地瓜蔞彼此間親緣關系較近，這與貯藏蛋白電泳圖譜相結合可以更準確的判斷各品種親緣關系的遠近。
3用于雌雄性別的研究
栝樓種植時雌、雄比例對瓜蔞的產量起著關鍵性作用，在雌、雄植株區(qū)分方面生物技術優(yōu)于傳統(tǒng)的鑒別方法。于鳳池等[35]對栝樓雌、雄不同器官進行過氧化物酶同工酶活性和電泳分析，成熟雌株葉片的過氧化物酶同工酶譜帶比雄株多了第5條譜帶（Rf=0.643）；在成熟器官（葉片、卷須）中，雌株中的過氧化物酶同工酶活性比雄株強，但在幼嫩器官中兩者差別不大。另有研究表明[29]，雌、雄株的葉片、葉柄、卷須、莖尖的各種同工酶圖譜均存在不同程度差異。過氧化物酶同工酶圖譜分析：葉柄的圖譜中出現(xiàn)了4條相關譜帶；多酚氧化酶同工酶分析：幼苗葉柄、莖尖圖譜中雄株各出現(xiàn)1條特征譜帶，卷須、葉片、莖尖圖譜中雌株各出現(xiàn)1條特征譜帶。雌雄株的酯酶同工酶圖譜、雌雄株不同部位的同工酶含量也表現(xiàn)出一定的差異性。
細胞學標記技術
細胞學標記技術主要是指染色體核型和帶型分析，是細胞遺傳學研究的基本方法。
1用于物種的鑒定
根據傳統(tǒng)的理念，栝樓染色體的核型對稱性、隨體大小和數目等方面的差異可以作為分析栝樓不同基因型材料的親緣關系及種質鑒定的方法。黃璐琦等[36]對國內栝樓屬的8個物種進行了形態(tài)學觀察和鑒定，發(fā)現(xiàn)了中藥瓜蔞和天花粉的染色體特點為表現(xiàn)為八倍體，二倍體一般不能入藥或甚至有毒副作用；并且，多倍體與器官特化以及地理分布尚未發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的聯(lián)系。
2用于染色體倍數與次生代謝物質相關性研究
楊福紅等[37]人研究了人工誘變不同倍性染色體栝樓的生長發(fā)育及果實糖、酸含量變化，結果表明四倍體栝樓的長勢、葉片中葉綠素含量、果實中總糖和總酸的含量明顯優(yōu)于二倍體；四倍體栝樓果實大小、質量、結實率和百粒重明顯小于二倍體，差異極顯著。黃秋波等[38]以五個不同產地的9種栝樓品系為實驗材料研究了染色體倍性與物質積累之間的關系，9個品系中一類是染色體數目為2n=6X=66的六倍體，另一類是染色體數目為2n=8X=88的八倍體。八倍體栝樓在整個生長發(fā)育時期其葉片可溶性糖含量均高于六倍體，在盛花期時的差異達顯著水平；二者葉片可溶性蛋白含量無明顯差異，總體來看，以盛花期為限，之前，六倍體栝樓葉片可溶性蛋白質含量高于八倍體，之后，八倍體栝樓葉片中可溶性蛋白質含量相對更高；八倍體栝樓葉片葉綠素含量都低于六倍體，不同發(fā)育時期的相對差異幅度為4％～10％。這為栝樓優(yōu)良品種的培育和多倍體育種提供了指導依據。
種苗快繁技術
1外植體選擇研究
在已有的關于栝樓試管苗快速繁殖體系[39]和外植體取材研究[40]的基礎上，楊曉伶等[41]以栝樓莖段、葉片、塊莖幼苗的莖尖和帶芽莖段進行了快繁外植體選擇研究。結果表明，培養(yǎng)基MS+2mg/L芐氨基腺嘌呤（BA）+0.5～0.05mg/Lα-萘乙酸（NAA）可誘導塊莖幼苗莖尖及帶芽莖段產生叢生芽，在培養(yǎng)基MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/LBA作用下生根，能夠在移栽后實現(xiàn)快速繁殖，而莖段和葉片可形成愈傷組織，但不能形成根。
2最佳快繁條件研究
余慧琳等[42]通過對莖段腋芽的離體快繁研究，確定了形成無菌試管苗的最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+BA0.2～0.3mg/L+NAA0.1～0.2mg/L組合；繼代增殖最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+BA0.1mg/LNAA0.1～0.2mg/L組合；生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.2mg/L組合。陳惠等[43]研究發(fā)現(xiàn)將不定根根尖，接種在MS＋BA4mg/L的培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)效果最佳。蘭偉等[44]研究并確定了適宜栝樓芽誘導、愈傷組織誘導與繁殖、生根的最佳培養(yǎng)基條件。有研究[45]對不同激素對栝樓試管苗生根影響進行了研究，6-芐基氨基嘌呤（6-BA）為1.5mg時對芽的誘導效果最好；采用MS培養(yǎng)基附加6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L+NAA0.05mg/L增殖效果好；IBA比NAA更能促進生根。各種最佳條件的確立對于栝樓優(yōu)質種苗選育、大規(guī)模細胞培養(yǎng)以提取有效成分的研究有著重要意義。
3其它
近年對栝樓細胞培養(yǎng)、雌雄株組織培養(yǎng)和發(fā)根農桿菌誘導的研究也有報道[46]，建立起了分散程度較好的栝樓懸浮細胞系，發(fā)現(xiàn)了雌雄栝樓愈傷組織的分化具有性別差異，培養(yǎng)基也有所不同。寧志怨[47]、丁婷等[48]分別對發(fā)根農桿菌誘導栝樓組培苗莖段和葉片生根、無菌苗毛狀根發(fā)生進行了實驗，發(fā)現(xiàn)該種方法可以成功地整合基因，后者發(fā)現(xiàn)LBA9402農桿菌對毛狀根的產生誘導率最高，并且毛狀根不定芽最佳分化培養(yǎng)基為6-BA（6-芐基氨基嘌呤）2.0mg/L+KT（激動素）2.0mg/L+NAA0.5mg/L。
