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摘要】目的：觀察阿司匹林調(diào)節(jié)小鼠H22移植性肝癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和p53的表達(dá),探討該藥抑制腫瘤的作用機(jī)制.方法：昆明種雄性小鼠60只，按隨機(jī)分組為A~F6組；A~E組于前肢右腋皮下接種H22腫瘤細(xì)胞懸液(1×1010/L)0.12mL,24h后灌胃給藥.A~C組分別給予80g/L，40g/L，20g/L阿司匹林1mL，D組予20g/L5FU1mL,E組予生理鹽水1mL，每日1次，連續(xù)用藥10d,停藥24h,稱質(zhì)量并處死動物,剝?nèi)×鰤K稱質(zhì)量,計(jì)算出腫瘤生長抑制率,用免疫組化法檢測癌細(xì)胞中VEGF和p53蛋白的表達(dá).F組予飼料及水分正常飼養(yǎng).結(jié)果：A，B，C，D組均有明顯的抑瘤作用（分別為49.84%，23.89%，29.07%，54.63%）,其中以A組和D組的抑瘤作用最明顯(與B,C組比較P<0.05).造模各組動物的肝癌細(xì)胞中均見VEGF和p53陽性染色,但陽性表達(dá)程度不同,與B，C，E組比較,阿司匹林大劑量（A）組和5FU(D)組可降低肝癌細(xì)胞中VEGF，p53的陽性表達(dá)(P<0.05).結(jié)論：阿司匹林對小鼠H22移植性肝癌有抑瘤作用,抑制腫瘤生長的機(jī)制可能與下調(diào)VEGF和p53的水平有關(guān).

【關(guān)鍵詞】阿司匹林H22癌肝細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子類基因p53

0引言

不少學(xué)者認(rèn)為在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各階段,至少有兩個或兩個以上功能不同異常激活的癌基因各自發(fā)揮不同作用,并在時間和空間上相互配合，突變的p53基因增強(qiáng)了蛋白激酶C對血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表達(dá)的誘導(dǎo)［1］.肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,估計(jì)每年新發(fā)患者在10萬以上,死亡率高,生存期短,其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚.因此,研究VEGF,p53與肝癌發(fā)生的關(guān)系具有一定的意義［2］.阿司匹林可調(diào)節(jié)很多基因的表達(dá)，我們研究了阿司匹林對肝癌細(xì)胞內(nèi)的VEGF，p53表達(dá)的影響.

1材料和方法

1.1材料昆明種雄性小鼠60只,清潔級,體質(zhì)量（20±2）g,購買于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心.試驗(yàn)藥物阿司匹林和5FU為醫(yī)用藥物,瘤株H22肝癌細(xì)胞系由武漢大學(xué)病理學(xué)教研室提供.試劑VEGFmAb,p53mAb均購自晶美生物技術(shù)公司.

1.2方法昆明種雄性小鼠60只,隨機(jī)分為A~F6組；F組為正常飼養(yǎng)組,A~E組進(jìn)行造模.無菌抽取接種H22瘤種8d的小鼠的腹水,調(diào)細(xì)胞密度至1×1010/L,迅速右腋皮下接種0.12mL.24h后A組予80g/L阿司匹林；B組予40g/L阿司匹林；C組予20g/L阿司匹林；D組予20g/L5Fu；E組予生理鹽水,皆為1mL，1次/d.10d停藥,24h后稱質(zhì)量并處死動物,用無菌操作完全剝?nèi)×鰤K稱質(zhì)量,計(jì)算出腫瘤生長抑制率：抑制率=［(陰性對照組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量)/陰性對照組平均瘤質(zhì)量］×100%.生理鹽水沖洗瘤塊后,制成石蠟切片.未造模的10只為正常飼養(yǎng)組(F組),不作任何處理,予以上5組飼以正常飼料及水分,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時取肝組織,制成石蠟切片觀察VEGF和p53表達(dá).VEGF和p53表達(dá)按免疫組化說明書進(jìn)行，選擇切片中4個染色反應(yīng)最強(qiáng)的視野,在400倍顯微鏡下,每例計(jì)數(shù)

至少800個腫瘤細(xì)胞,細(xì)胞染色呈淺黃色至棕褐色均認(rèn)為是陽性染色.計(jì)算出陽性染色腫瘤細(xì)胞與所計(jì)數(shù)之腫瘤細(xì)胞的百分比,根據(jù)百分比和著色深淺計(jì)分.無陽性細(xì)胞計(jì)為0分,陽性細(xì)胞百分比在0%~25%之間計(jì)為1分,在25%~75%之間計(jì)為2分,>75%計(jì)為3分［3］.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示,多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)(SPSS10.0),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

.1H22移植性肝癌的抑瘤效果及VEGF,p53表達(dá)水平由表1可知，A,B,C,D各組瘤質(zhì)量均低于E組(P<0.05)；A組和D組的瘤質(zhì)量低于B,C組(P<0.05),抑制率均高于B,C組(P<0.05)；B組與C組瘤質(zhì)量、抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).VEGF積分和p53積分A,B,C,D組均低于E組(P<0.05)；A,D組低于B,C組(P<0.05)；A組與D組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).表1各組小鼠體質(zhì)量、腫瘤抑制率的比較

2.2VEGF和p53表達(dá)VEGF僅在正常小鼠肝臟內(nèi)皮細(xì)胞有表達(dá),而肝細(xì)胞未見陽性染色,也未發(fā)現(xiàn)p53陽性染色（圖1A）.瘤組織中VEGF肝癌細(xì)胞漿染成棕黃色,呈陽性染色(圖1B),造模各組均可見到,但陽性程度不同.造模各組中可見p53為細(xì)胞核陽性染色（圖1C）.A：肝組織VEGF表達(dá)；B：瘤組織VEGF表達(dá)；C：瘤組織p53表達(dá).

3討論

VEGF,p53在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各階段發(fā)揮著重要作用，目前的研究認(rèn)為，它們之間的作用不是孤立的,可能在時間和空間上相互配合,協(xié)同促進(jìn)了細(xì)胞的癌變［4］.Folkman認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是一個多步驟的過程,而血管生成是腫瘤發(fā)展的限速步驟,在腫瘤進(jìn)展中血管生成這一表型可能是原癌基因激活和抑癌基因失活的結(jié)果,這一點(diǎn)在Olga的試驗(yàn)中得到了證實(shí):p53突變使VEGF的表達(dá)量升高,p53突變在腫瘤血管生成開關(guān)中起到了重要作用.從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,肝癌組織VEGF,p53表達(dá)較正常肝組織有明顯差異,說明肝癌的發(fā)生與VEGF，p53有一定關(guān)系.阿司匹林對H22移植性肝癌的抑瘤效果顯示,接種H22移植性腫瘤給藥10d后,A,B,C,D各組瘤質(zhì)量均低于E組；A組和E組的瘤質(zhì)量均低于B，C組,抑制率均高于B，C組；B組與C組瘤質(zhì)量、抑制率,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.說明阿司匹林和5FU均能發(fā)揮一定抑瘤作用且阿司匹林抑瘤作用存在著量效關(guān)系,劑量越大,抑瘤效果越明顯.免疫組化結(jié)果顯示VEGF和p53積分A,B,C,D組均低于E組；A低于B,C組；A組與D組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.說明阿司匹林和5FU均能抑制VEGF和p53的表達(dá)，且存在量效關(guān)系，高劑量阿司匹林與5FU有同樣的抑制效果.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿司匹林抑瘤作用可能是通過下調(diào)VEGF和p53的水平來發(fā)揮作用的.

【參考文獻(xiàn)】

［1］王爭.VEGF及其受體基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制［J］.國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊，2002,25(3):1291-1293.

［2］ParkSY,LeeSM,YeSK.Benzo［a］pyreneinducedDNAdamageandp53modulationinhumanhepatomaHepG2cellsfortheidentificationofpotentialbiomarkersforPAHmonitoringandriskassessment［J］.ToxicolLett,2006,167(1)27-33.

［3］SladeN.Twofacesofp73,amemberofp53family［J］.PeriodBiolog.2004.106(3):223-231.

［4］GeR,UchR,BreC.Genetherapyofhepatocarcinoma:Alongwayfromtheconcepttothetherapeuticalimpact［J］.CancerGeneTher,2003,10(9):649-660