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【關鍵詞】細胞凋亡

EffectsofgossypolaceticacidonapoptosisanddifferentiationinleukemiaHL60cells

【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofgossypolaceticacid(GAA)onapoptosisanddifferentiationinclassichumanactuepromylocyticleukemiacelllineHL60andstudythepossibilitytotreatleukemiawithit.METHODS:ThecytotoxicactivityofGAAonHL60cellswasdetectedbymeansofMTTassay.Apoptosiswasidentifiedandanalyzedwiththehelpoftransmissionelectronmicroscopy,cellcycle,andDNAgelelectrophoresis,etc.ThedifferentiationofHL60cellsintomorematuregranulocyteswasdetectedbynitrobluetetrazolium(NBT)reductiontest.RESULTS:Morethan6μmol/LGAAcouldsuppresstheproliferationandinducetheapoptosisinHL60cellsinadosedependentmanner.NBTreductiontestdemonstratedthatHL60cellscouldalsobeinducedtodifferentiateintomorematuregranulocytesbylowdoseGAA(1,4μmol/L,P<0.05).CONCLUSION:GAAcouldselectivelyinducetheapoptosisofleukemiaHL60cellsinasmallerdosethanthatforhumanperipheralbloodmononuclearcells,whichsuggeststhatitmaybeanidealdrugforleukemiatherapy.

【Keywords】gossypol;HL60cells;celldivision;apoptosis;celldifferentiation

【摘要】目的：通過醋酸棉酚（GAA）對經(jīng)典白血病細胞系hl60的研究，探索GAA治療白血病的可能性.方法：用細胞培養(yǎng)、四唑鹽比色試驗（MTT）、細胞形態(tài)學、DNA電泳及NBT還原試驗等方法觀察不同濃度GAA促進HL60細胞凋亡及誘導分化的作用.結果：GAA在濃度>6μmol/L時可顯著抑制HL60細胞的增殖，促進其凋亡，并表現(xiàn)出劑量效應；在誘導分化濃度下（1,4μmol/L），GAA可促進HL60細胞向成熟粒細胞分化(P<0.05).結論：GAA對白血病細胞HL60的選擇性促凋亡作用表明其可能是一種理想的高效低毒抗白血病藥物.

【關鍵詞】棉酚；HL60細胞；細胞分裂；細胞凋亡；細胞分化

0引言

白血病發(fā)病率有顯著升高的趨勢［1］.近年來，多酚類藥物的抗腫瘤作用日益受到重視［2］.作為多酚類藥物的一分子，棉酚天然存在于錦葵科某些植物的根、莖、種子中，其化學結構為2,2′聯(lián)二萘8,8′二羧基醛1,1′,6,6′,7,7′六羥基5,5′二異丙基3,3′二甲基，分子質量為518.54，具有多種生物學活性［3］.然而，以往曾經(jīng)報道棉酚的抗腫瘤作用卻未得到多數(shù)學者的認可.近年隨著研究的深入，其顯著的抗腫瘤作用又重新得到了人們的重視［4］.棉酚對白血病細胞的作用效果如何，有無臨床使用價值？我們通過使用其衍生物醋酸棉酚（GAA）對經(jīng)典的白血病HL60細胞系進行研究，觀察其對HL60細胞增殖、分化的影響.

1材料和方法

1.1材料人急性白血病HL60細胞系由本室保存.正常人單個核細胞（PBMNCs）來自第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院輸血科正常獻血員供血離心白細胞層.RPMI1640（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料研究所）.GAA、四唑氮藍（MTT）及硝基藍四氮唑（NBT）購自Sigma公司.電子顯微鏡（日本JEOL公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioRad公司）；流式細胞儀（美國BeckmanCoulter公司）.

1.2方法

1.2.1試劑準備用二甲基亞砜（DMSO）溶解GAA，濃度為12.5mmol/L，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?RPMI1640按說明配制.FBS于56℃30min滅活，分裝，-20℃凍存?zhèn)溆?MTT用0.01mmol/LPBS配制成濃度5g/L溶液，NBT用9g/L生理鹽水配成為2g/L溶液，分別過濾除菌，避光4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2細胞培養(yǎng)HL60細胞以1×108/L密度接種于含100mL/LFBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃,50mL/LCO2，飽和濕度的孵箱培養(yǎng)，每3～4d傳代1次.將正常獻血員分離的白細胞層用比重為1.077的淋巴細胞分離液分離，收集PBMNCs，經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液洗滌，調整到所需細胞濃度培養(yǎng)［5］.

1.2.3不同濃度GAA抑制HL60細胞增殖的作用GAA濃度從100μmol/L開始.以含同樣梯度濃度DMSO的PRMI1640培養(yǎng)基為平行孔.將HL60細胞以4×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μL.培養(yǎng)24h后按倍比稀釋濃度梯度加入GAA，繼續(xù)培養(yǎng).每孔加入5g/LMTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，離心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO震蕩10min，使結晶物充分溶解.用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測A490nm.以濃度為橫軸，A值為縱軸繪制細胞生長曲線并計算半數(shù)抑制濃度值（IC50）［6］.檢測GAA對PBMNCs的作用方法同上，接種密度為1.5×105/孔.

1.2.4超微結構觀察將終濃度為20μmol/L的GAA作用于對數(shù)生長期的HL60細胞，24h后收獲細胞，PBS洗滌2次，轉移至Eppendorf管，1500r/min離心15min.40mL/L戊二醛固定，電子顯微鏡觀察.

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期將終濃度為20μmol/L的GAA作用于對數(shù)生長期的HL60細胞，16h后收獲細胞，PBS洗滌2次，700mL/L冷乙醇固定.流式細胞儀檢測細胞周期.

1.2.6DNA梯度電泳按參考文獻［7］進行，將終濃度為20μmol/L的GAA作用于對數(shù)生長期的HL60細胞，24h后收獲細胞，PBS洗滌2次，裂解緩沖液混勻，加入蛋白酶K56℃消化過夜，酚氯仿抽提，冷乙醇沉淀，TE溶解.18g/L瓊脂糖凝膠50V電壓電泳1h，觀察DNAladder.

1.2.7形態(tài)學觀察根據(jù)MTT實驗結果選用1μmol/L與4μmol/L作為GAA誘導分化用濃度.在含100mL/LFBS的RPMI1640,4×107/L的HL60細胞培養(yǎng)體系中加入不同濃度的GAA培養(yǎng)5d，將細胞離心涂片，WrightGiemsa染色，油鏡下觀察細胞形態(tài).

1.2.8NBT還原試驗將用終濃度1μmol/L與4μmol/L的GAA處理的HL60細胞培養(yǎng)1~5d.收集細胞，以不含血清的RPMI1460洗滌離心，棄上清，每管加2g/LNBT0.5mL和0.1mL佛波酯（TPA）200mg/L溶液，搖勻，37℃反應30~60min.吸取少量細胞懸液，涂片，空氣干燥，常規(guī)WrightGiemsa染色.以細胞質出現(xiàn)藍紫色斑者為陽性.隨機在光學顯微鏡下觀察200個細胞，計算陽性百分率.

統(tǒng)計學處理：實驗結果以x±s表示，各組間差異采用方差分析.半數(shù)抑制濃度（IC50）的計算采用SPSS統(tǒng)計軟件包的Probit回歸分析完成.

2結果

2.1GAA對人白血病HL60細胞系增殖的影響隨著GAA濃度的升高，GA對HL60細胞表現(xiàn)出明顯的抑制增殖作用.說明GAA對HL60細胞有著明顯的濃度依賴效應（圖1）.

圖1不同濃度的GAA對HL60細胞生長的影響（略）

2.2GAA對PBMNCs增殖的影響當GAA>12μmol/L時，GAA才對PBMNCs表現(xiàn)出明顯的殺傷效應.提示GAA對正常PBMNCs的作用濃度要顯著高于對白血病細胞作用濃度，提示GAA對白血病細胞存在明確的選擇殺傷作用（圖2）.

圖2不同濃度的GAA對PBMNCs細胞生長的影響（略）

2.3電子顯微鏡超微結構觀察大量的細胞表現(xiàn)出染色質邊集等凋亡現(xiàn)象（圖3）.

圖3大量的20μmol/L終濃度GAA處理24h后的HL60細胞表現(xiàn)出染色質邊集等凋亡現(xiàn)象TEM×7500（略）

2.4流式細胞儀觀察細胞周期檢測結果提示出現(xiàn)明顯的亞G1凋亡峰（圖4）.

圖420μmol/L終濃度GAA處理16h后HL60細胞，有明顯的亞G1凋亡峰（略）

2.5梯度DNA電泳可見明顯的DNAladder形成，提示GAA可以促進HL60細胞凋亡（圖5）.

2.6GAA對HL60細胞的誘導分化作用形態(tài)學觀察結果表明：陰性對照組HL60細胞體積大，外形不規(guī)則；核大，染色質疏松細致，可見多個核仁，核質比例大.經(jīng)GAA處理的HL60細胞形態(tài)產(chǎn)生明顯變化，細胞體積變小，核染色質濃縮，核質比例變小，胞質呈灰藍色，原始細胞減少.NBT還原試驗結果顯示，1μmol/L與4μmol/LGAA處理的HL60細胞NBT還原試驗陽性率呈時間依賴性增高，并與劑量有關(P<0.05).1μmol/L與4μmol/L濃度GAA處理5d的HL60細胞NBT還原試驗陽性率分別為34%和45%(P<0.05，表1）.

2.7IC50經(jīng)計算，GAA對HL60細胞的IC50值為9.4μmol/L，而對PBMNCs的IC50值為48.0μmol/L.

1:100bpmarker;2:20μmol/L濃度GAA作用16h后可見少量的ladder;3:20μmol/L濃度GAA作用24h后可見明確的ladder.

圖5GAA作用后HL60細胞DNA電泳圖（略）

表1低濃度GAA對HL60細胞誘導分化后NBT還原試驗陽性率（%）變化（略）

aP<0.05vs空白對照,cP<0.05vs1μmol/LGAA.

3討論

目前臨床用于白血病的化療藥物包括烷化劑、抗代謝藥、抗生素及激素等.這些藥物不僅毒副作用較強，對骨髓抑制作用明顯，而且在長期使用后會逐漸產(chǎn)生耐藥性，導致治療失敗.作為天然藥物的棉酚具有顯著的抗實體瘤作用，且副作用較小.體外研究提示該藥物對多種腫瘤細胞系有著明顯的抗增殖和抗轉移作用，如乳腺癌、直腸癌、肝癌、黑素瘤等.在24h以上的細胞存活實驗中，對于黑素瘤，棉酚的活性要大于順鉑、馬法蘭、達卡巴嗪等.還有人將該藥物用于治療進展期的膠質瘤和難治性腎上腺癌、乳腺癌等患者，均取得了令人滿意的效果，但均缺乏進一步的深入研究［4］.棉酚口服后部分被小腸吸收，大部分經(jīng)膽汁分泌，主要代謝場所是肝臟.其生物半衰期為48h，各組織活性依次為胃腸道、肝臟、心臟、腎臟、血液、肌肉等.因此，口服棉酚后能維持較長時間的有效血藥濃度［8］.提示棉酚比多數(shù)經(jīng)典的化療藥物有著更顯著的抗腫瘤活性，很有希望應用于臨床治療白血病.我們的結果表明，GAA在＞6μmol/L的濃度范圍對HL60細胞有著顯著的抑制增殖、促進凋亡作用，且與作用劑量有關，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴效應.發(fā)現(xiàn)對于正常PBMNCS,GAA的有效抑制濃度要明顯高于對HL60細胞的抑制濃度，說明GAA對白血病細胞有選擇性殺傷作用.

惡性腫瘤的發(fā)生與腫瘤細胞增殖和分化之間的平衡失調有關，表現(xiàn)為增殖失控而分化受阻.許多藥物如維甲酸及某些天然成分可以促進白血病細胞向成熟分化，這也是目前治療白血病的措施之一［9］.可見，許多天然藥通過誘導白血病細胞分化來發(fā)揮抗白血病作用.在分化誘導劑作用下，HL60細胞可向成熟粒細胞分化，表現(xiàn)為NBT還原試驗陽性［10］.我們的結果發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)體系中，1μmol/L與4μmol/L的GAA均能使HL60細胞形態(tài)發(fā)生改變，NBT還原試驗陽性率也明顯增高，呈時間與劑量依賴關系.這表明在誘導分化劑量下，GAA可促使HL60細胞向成熟粒系分化.通過誘導白血病細胞向成熟粒細胞分化，從而抑制其增殖，這可能也是GAA抗白血病作用的機制之一.

與傳統(tǒng)的化療藥物相比，棉酚的副作用就顯得簡單易于處理.過去在用于節(jié)育目的長期服用時發(fā)現(xiàn)主要表現(xiàn)為低鉀血癥、個別患者睪丸生精上皮的嚴重損傷等，但發(fā)生率僅為1%左右，且臨床處理也較容易，而且相對于致命的白血病來說，這些副作用顯得微不足道.而且長期口服治療劑量的棉酚不會引起骨髓抑制，這相對其他治療白血病的化療藥物而言具有無法比擬的優(yōu)勢［11-12］.更為重要的是，其代謝產(chǎn)物氧化棉酚同樣具有顯著的抗腫瘤作用，甚至比其原體活性還高.以上特點表明，棉酚是一種非常有前途的新型抗腫瘤藥物［13-14］.

我們的研究結果表明，GAA對白血病細胞具有選擇性殺傷及誘導分化作用，提示其可能成為一種新型、高效低毒的抗白血病藥物.

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