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摘要：【目的】觀察補(bǔ)腎生精法對(duì)老齡大鼠睪丸蛋白表達(dá)譜的影響?！痉椒ā窟x用20只22月齡老齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，分別為空白對(duì)照組和補(bǔ)腎生精組；補(bǔ)腎生精組給藥劑量為0.05g·kg-1·d-1，連續(xù)灌胃給藥60d。取大鼠右側(cè)睪丸，采用雙向凝膠電泳法分析空白對(duì)照組和補(bǔ)腎生精組大鼠睪丸差異表達(dá)蛋白?！窘Y(jié)果】與空白對(duì)照組比較，補(bǔ)腎生精組大鼠睪丸中有7種蛋白表達(dá)發(fā)生了顯著變化，其中4種蛋白表達(dá)上調(diào)，3種下調(diào)。對(duì)7種差異表達(dá)蛋白點(diǎn)膠內(nèi)酶切后進(jìn)行質(zhì)譜分析，其中5種蛋白分別鑒定為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidylethanolaminebindingprotein,PEBP）、熱休克蛋白8(heatshock70kDaprotein8，HSP7C)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphateisomerase，TPIS)、3磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH）、谷胱苷肽S基轉(zhuǎn)移酶1（glutathioneStransferaseMu1，GSTM11）?！窘Y(jié)論】補(bǔ)腎生精法延緩衰老的作用可能與其能調(diào)節(jié)老齡大鼠睪丸蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎生精法/治療應(yīng)用；衰老/中藥療法；蛋白質(zhì)組；疾病模型，動(dòng)物；大鼠

睪丸功能的減退與男性衰老之間存在著重要的聯(lián)系。近來(lái)多項(xiàng)研究表明，從50歲開(kāi)始，隨著年齡的增長(zhǎng)，男性由于睪丸雄激素合成功能逐步衰退而引起一系列的臨床綜合征稱為中老年男性部分雄性激素缺乏綜合征（PADAM）［1］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎虛是衰老的主要原因，現(xiàn)代研究也證明腎虛與衰老密切相關(guān)，補(bǔ)腎方藥確有延緩衰老作用［2-3］。為了探討補(bǔ)腎生精方藥延緩衰老的機(jī)理，我們應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，觀察了補(bǔ)腎生精顆粒對(duì)老齡大鼠睪丸蛋白表達(dá)譜的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器固相pH梯度(immobilinepHgradient,IPG)膠條、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇(DTT)、甘油、蛋白質(zhì)相對(duì)分子量標(biāo)記、3［3（膽酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、膠條緩沖液(IPGbuffer)、凝膠條覆蓋液、膠槽清洗液、過(guò)硫酸胺(APS),十二烷基磺酸鈉(SDS）均購(gòu)自Amershambiotech公司;復(fù)合蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitorcocktail）購(gòu)自Pierce公司；碘乙酞胺、體積分?jǐn)?shù)37%甲醛溶液、三氟乙酸（FA)、乙腈(ACN)均購(gòu)自Sigma公司;胰蛋白酶購(gòu)自Promega公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖、硫代硫酸鈉、牛血清白蛋白(BSA)均購(gòu)自上海生工公司;乙酸、無(wú)水乙醇、甲醇、硝酸銀、無(wú)水碳酸鈉、乙二胺四乙酸鈉(EDTANa+)、考馬氏亮藍(lán)R250、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。等電聚焦系統(tǒng)（IPGphor）、GS800凝膠成像儀、ImageMaster2Dplatinumsoftware5.0軟件均由美國(guó)BIORAD提供；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDITOF，AMERICAAPPLYSYSTEM）。

1.2藥物制備補(bǔ)腎生精顆粒主要由菟絲子、枸杞子、淫羊藿等組成，由廣東省中醫(yī)院制劑室提供（批號(hào)：06071802）。配成濃度為50mg/L混懸液，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3動(dòng)物及分組選用22月齡老年雄性SD大鼠20只（購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字06493），隨機(jī)分為2組，每組各10只，分別為空白對(duì)照組（灌喂等容積生理鹽水）和補(bǔ)腎生精組（給藥劑量為0.05g·kg-1·d-1），連續(xù)給藥2個(gè)月。

1.4蛋白抽提與定量以30g/L戊巴比妥20mg/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物；取大鼠右側(cè)睪丸，剝?nèi)グ啄?，迅速置于液氮中，研碎；加入適量蛋白抽提試劑［8mol/L尿素、0.2g/LCHAPS、20mmol/LDTT、1mmol/LEDTA，1mmol/L苯甲基磺酸氟（PMSF）以及蛋白酶抑制劑混合物］；震蕩溶解后，室溫孵育1h，離心(4℃、12000g)15min，取上清，分裝保存于-70℃冰箱；蛋白定量采用Bradford法。

1.5雙向電泳選取pH值為3～10的線性IPG膠條，采用IPGphorSystem進(jìn)行第一向等電聚焦。取1mg蛋白，溶于重泡脹液(8mol/L尿素、0.2g/LCHAPS、0.02mol/LDTT、0.5g/LIPG緩沖液)；將聚焦后的膠條在SDS平衡液(6mol/L尿素，20g/LSDS，1.5mol/LTrisHCl、pH8.8，體積分?jǐn)?shù)30%甘油)中平衡2次(搖床上振蕩)，每次15min。其中，第1次平衡液中加入20mmol/LDTT，第2次平衡液中加入100mmol/L碘乙酰胺；取出膠條在PROTENIIxiCell上進(jìn)行垂直方向的第二向電泳，即SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒流40mA，40min；置固定液(乙醇和乙酸的混合水溶液，含體積分?jǐn)?shù)40%乙醇、10%乙酸)中固定30min；用1g/L考馬斯亮藍(lán)染液R250進(jìn)行凝膠染色3h，脫色過(guò)夜。

1.6圖像分析采用凝膠成像儀掃描成二值圖像格式（TIFF格式）圖像(分辨率為300dpi)，然后用ImageMaster2Dplatinumsoftware5.0軟件進(jìn)行差異分析。

1.7酶切和質(zhì)譜分析觀察差異蛋白點(diǎn)在凝膠上的原始位置，切下滿足下面兩個(gè)條件的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析：(1)在4次重復(fù)膠上均能找到，且差異顯著；(2)無(wú)明顯拖尾、變形，且完全分離。將蛋白膠粒均勻切碎，置1.5mL離心管中，用去離子水清洗2次，加入脫色液(體積分?jǐn)?shù)50%乙腈、25mmol/L碳酸氫銨)100μL，搖床振蕩20min，棄去溶液，重復(fù)2次，直至膠片中的藍(lán)色脫盡，真空離心干燥；加入適量胰酶液(0.01μg/μL，含25mmol/L碳酸氫銨，5mmol/L氯化鈣)，置于4℃冰箱泡脹20～30min，酶液被完全吸收后，補(bǔ)充5～10μL酶解緩沖液，37℃過(guò)夜(約16h);離心，吸取1μL酶解液，與飽和基質(zhì)溶液α氰基4羥基肉桂酸（αCCA）充分混勻后點(diǎn)靶，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.8生物信息學(xué)分析登陸NCBI網(wǎng)站對(duì)質(zhì)譜分析鑒定的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。2結(jié)果

2.1老齡大鼠睪丸蛋白表達(dá)譜的變化提取睪丸蛋白，對(duì)空白對(duì)照組和補(bǔ)腎生精組大鼠的睪丸蛋白一起進(jìn)行雙向電泳，其代表性考馬斯亮藍(lán)染色電泳圖譜見(jiàn)圖1。ImageMaster2Dplatinumsoftware5.0軟件分析結(jié)果表明，平均每塊凝膠上可找到600個(gè)左右蛋白點(diǎn)。選取空白對(duì)照組中一塊凝膠作參照，其蛋白點(diǎn)匹配率為89%，補(bǔ)腎生精組蛋白點(diǎn)匹配率為87%，保證了良好的重復(fù)性。

2.2差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析選取并切下滿足條件的蛋白點(diǎn)(補(bǔ)腎生精組與空白對(duì)照組之間表達(dá)水平上調(diào)5倍以上和下調(diào)0.2倍以下的蛋白點(diǎn))，共分析了7個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中4個(gè)蛋白點(diǎn)在補(bǔ)腎生精組表達(dá)高于空白對(duì)照組，其他3個(gè)點(diǎn)相反。膠內(nèi)酶切后，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定及查庫(kù)分析。其中5種蛋白分別鑒定為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidylethanolaminebindingprotein,PEBP）、熱休克蛋白8(heatshock70kDaprotein8，HSP7C)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphateisomerase，TPIS)、3磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH）、谷胱苷肽S基轉(zhuǎn)移酶1（glutathioneStransferaseMu1，GSTM11）。其中，在補(bǔ)腎生精組中HSP7C和GSTM11蛋白表達(dá)下調(diào)，而PEBP、TPIS和GAPDH蛋白表達(dá)上調(diào)。該5種蛋白的酶切產(chǎn)物質(zhì)譜分析色譜圖見(jiàn)圖2。

3討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主生殖。有研究表明［2］，機(jī)體老化是一種生理性腎陽(yáng)虛，腎陽(yáng)虛是未老先衰的一種表現(xiàn)。睪丸功能的減退與男性衰老之間存在著重要的聯(lián)系。腎陽(yáng)虛證具有下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）功能紊亂，補(bǔ)腎中藥能明顯提高男性老年人血清睪酮水平，能改善老年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞曲細(xì)精管的結(jié)構(gòu)。

補(bǔ)腎生精顆粒主要由菟絲子、枸杞子、淫羊藿等組成，具有補(bǔ)腎生精之功效。我們臨床用于治療男性更年期綜合征、男性不育癥、少弱精子癥等病均具有較好療效?，F(xiàn)代藥理研究證明［4］，方中淫羊藿辛溫，入肝、腎經(jīng)，補(bǔ)腎助陽(yáng)，含鋅、錳水平較高，具有雄性激素樣作用，`能興奮性機(jī)能，使精液分泌亢進(jìn)，為精子獲能創(chuàng)造良好的內(nèi)環(huán)境。菟絲子主要補(bǔ)養(yǎng)肝腎、益精，能促進(jìn)性腺及附屬性腺發(fā)育，提高精子質(zhì)量，對(duì)過(guò)氧化損傷（ROS）造成的精子膜、頂體結(jié)構(gòu)和精子線粒體功能損傷具有明顯的干預(yù)作用。

本實(shí)驗(yàn)共分析了7個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中4個(gè)蛋白點(diǎn)在補(bǔ)腎生精組表達(dá)高于空白對(duì)照組，其他3個(gè)點(diǎn)相反，且HSP7C和GSTM11蛋白在補(bǔ)腎益精組中表達(dá)下調(diào)，而PEBP、TPIS和GAPDH蛋白表達(dá)上調(diào)。PEBP又稱為Raf激酶抑制蛋白（RKIP)，是Raf/MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)子和轉(zhuǎn)移性腫瘤(metastaticcancer)抑制劑［5］，PEBP可能與生精過(guò)程中生殖細(xì)胞分裂活動(dòng)有關(guān)。熱休克蛋白基因hsp702、hsc70t是生精細(xì)胞特異表達(dá)基因［6］，其中hsc70t在減數(shù)分裂后表達(dá)，hsp702敲除雄性大鼠的精子產(chǎn)生被阻斷在第一次減數(shù)分裂，導(dǎo)致不育，而雌性大鼠正常。免疫共沉淀和體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示hsp702在大鼠睪丸中直接與周期蛋白依賴性蛋白激酶1(CDK1)作用，表明它可能作為分子伴侶參與CDK1和細(xì)胞周期蛋白cyclinB1形成M期促進(jìn)因子(MPF)復(fù)合物。GSTM11是二聚體蛋白［7］，除在肝臟大量表達(dá)外，還存在于睪丸組織，催化還原性谷胱苷肽與化學(xué)物質(zhì)販親電子基團(tuán)結(jié)合，對(duì)精子的抗氧化損傷具有保護(hù)作用。TPIS是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，附睪精子糖酵解活動(dòng)受到抑制則能產(chǎn)生抗生育作用。精子尾巴的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生了精子的運(yùn)動(dòng)力，但這種運(yùn)動(dòng)需要ATP提供足夠的能量［8］。一般認(rèn)為，細(xì)胞中的線粒體能夠提供精子運(yùn)動(dòng)所需的ATP。精子運(yùn)動(dòng)力和ATP的制造主要依賴于糖酵解過(guò)程，GAPDH能夠緊密地結(jié)合到精子尾巴的特定結(jié)構(gòu)區(qū)域上。利用基因靶向或稱基因敲除技術(shù)制造出缺失這種酶的小鼠，因?yàn)槿鄙貵APDH，小鼠精子中的糖酵解就被有選擇地抑制并因此無(wú)法產(chǎn)生ATP，雌性小鼠表現(xiàn)正常，而雄性小鼠具有正常的睪丸和精蟲(chóng)數(shù)卻無(wú)法授精。顯微鏡觀察結(jié)果表明缺少GAPDH的精子缺乏運(yùn)動(dòng)力。糖酵解并不能像線粒體那樣高效地制造出能量，但是這個(gè)途徑中的GAPDH酶卻對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)非常重要［9］。因此，這項(xiàng)研究證明GAPDH可能是避孕藥劑的一個(gè)有效的靶標(biāo)。

本研究通過(guò)觀察補(bǔ)腎生精法對(duì)衰老過(guò)程睪丸蛋白表達(dá)的影響，有助于從蛋白質(zhì)組水平闡釋中醫(yī)腎主生殖以及補(bǔ)腎中藥延緩睪丸衰老的本質(zhì)。

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