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【摘要】目的觀察燈盞花素磷脂復(fù)合物(BerPC)對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦損傷的影響。方法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注損傷模型，觀察缺血后大鼠神經(jīng)功能障礙情況，測(cè)定再灌注后缺血側(cè)腦梗死范圍及腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPX)的活性及丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果BerPC劑量依賴性減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能障礙，減少腦梗死面積，拮抗缺血腦組織MDA含量的增加，提高腦組織SOD、GSHPX活性。結(jié)論BerPC對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠具有明顯的保護(hù)作用，具有良好的新藥開(kāi)發(fā)前景。

【關(guān)鍵詞】燈盞花素磷脂復(fù)合物；腦缺血；再灌注；大鼠

Abstract:ObjectiveTostudytheprotectiveeffectsofbreviscapinephosphatidylcholinecomplex(BerPC)againstbraininjuryinratsundergonefocalischemiareperfusion.MethodsWistarratsweretreatedwithBerPCfor14daysandweresubjectedtofocalischemiareperfusionbymiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)usingintraluminalthread.After2hoursofMCAOreperfusionwasallowedbyretractingthethread.Thenervesymptomswereobservedafter1hourofreperfusionandtheinfractedarea,thelevelofMDA,theactivityofSOD,andGSH-PXinischemicbraintissuewereobservedafter24hours.ResultsBerPCcouldimprovebehaviordisorderinducedbyMCAOandreducebraininfractedareathroughincreasingtheactivityofSODandGSHPX,decreasingthelevelofMDAinbraintissue.ConclusionBerPCcouldprotectagainstfocalbraininjuryinducedbyreperfusioninjuryinmiddlecerebralarteryofratsandcouldbeapromisingproduct.

Keywords:Breviscapinephosphatidylcholinecomplex；cerebralischemia；perfusion;rat

燈盞花素(Ber)是從菊科植物短葶飛蓬中提取的有效活性成分，是治療心腦血管疾病的常用天然藥物。它能有效清除氧自由基和過(guò)多的NO，防止腦缺血造成的細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，阻止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，保護(hù)腦細(xì)胞，增加腦血流量，改善腦血管循環(huán)等［1，2］。但其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定其口服不易吸收，生物利用度較低［3］。因此筆者將燈盞花素與磷脂(PC)復(fù)合，形成燈盞花素磷脂復(fù)合物(BerPC)，以提高生物利用度，改善臨床療效。本實(shí)驗(yàn)研究BerPC對(duì)大鼠腦缺血再灌注(IR)損傷的保護(hù)作用，并與Ber進(jìn)行比較，旨在為新藥開(kāi)發(fā)提供藥效學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥物與試劑

Ber（云南植物藥廠，批號(hào)000908），PC（上海試劑二廠，批號(hào)031104）。BerPC由武漢俊民醫(yī)藥研究所提供，批號(hào)010311，其制備方法為：取Ber溶于丙酮中，加溫至60℃促溶，以質(zhì)量比1∶1.6比例加入大豆磷脂，攪拌2.5h后，揮除有機(jī)溶劑，殘余物室溫減壓干燥10h后得磷脂復(fù)合物。三苯基氯化四氮唑(TTC)染液（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)010411）?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)030307），超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒（批號(hào)030704），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPX)測(cè)定試劑盒（批號(hào)030715），丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒（批號(hào)030715）均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量300～350g，10～12月齡，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（鄂）2003-0002。

1.3儀器

754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司分析儀器廠），BPS130電子分析天平（北京賽多麗斯天平有限公司），電熱灼燒器（上海醫(yī)療器械八廠生產(chǎn)）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組及給藥

取上述大鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只，即單純?nèi)毖俟嘧?IR)組及假手術(shù)（Sham）組；Ber200mg·kg-1組；BerPC50、100、200mg·kg-1組（劑量以Ber計(jì)）；PC320mg·kg-1組（相當(dāng)于BerPC200mg·kg-1組中PC的量）。其中Sham組及IR組均給予等體積的0.5%CMC（10mL·kg-1）溶液。動(dòng)物每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥14d。

2.2大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的制備［4］

末次給藥后1h，大鼠稱重，腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液1mL·kg-1麻醉，仰臥固定于恒溫手術(shù)臺(tái)上。頸部皮膚正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈及其分支。將直徑為0.26mm，頭端灼燒膨大且光圓的尼龍線經(jīng)頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈入大腦中動(dòng)脈分支處，進(jìn)線深度均距頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉18mm處，阻斷左側(cè)大腦中動(dòng)脈血流2h，拔出尼龍線予以再灌注24h，Sham組僅手術(shù)分離，不插尼龍線。

2.3對(duì)大鼠神經(jīng)功能的影響

大鼠清醒后，觀察其行為學(xué)變化，神經(jīng)癥狀按文獻(xiàn)［4］5級(jí)4分制評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀為0分；不能完全伸展右側(cè)前爪為1分；向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時(shí)向右側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走或意識(shí)昏迷為4分。

2.4對(duì)大鼠腦梗死面積的影響

各組大鼠再灌注24h后，開(kāi)顱取腦，取梗死側(cè)腦組織冰浴上（4℃以下）冠狀切成5片，迅速將腦片置于2%TTC染液中，37℃染色20min，10%（φ）甲醛固定。經(jīng)染色后非缺血區(qū)腦組織呈玫瑰紅色，梗死區(qū)呈白色，將白色組織挖下稱重。以梗死區(qū)腦質(zhì)量與總切片腦質(zhì)量的百分比作為梗死范圍。

2.5對(duì)SOD、GSHPX活性及MDA含量的影響

各組大鼠于再灌注24h后，取缺血側(cè)同一部位腦組織用0.9%冰氯化鈉溶液制成10%腦組織勻漿，將勻漿以3000r·min-1離心10min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書操作，分別測(cè)定SOD、GSHPX活性及MDA含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各樣品中蛋白質(zhì)含量。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。

3結(jié)果

3.1對(duì)神經(jīng)功能評(píng)分的影響

與Sham組比較，IR組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙。腹腔注射BerPC50、100、200mg·kg-1，連續(xù)14d，可劑量依賴性降低大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，且100、200mg·kg-1組與IR組比較，差異具有極顯著性（P<0.01）。與Ber組相比較，BerPC200mg·kg-1組作用明顯強(qiáng)于相同劑量的Ber組（P<0.01），見(jiàn)表1。

表1對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的影響略

3.2對(duì)腦梗死面積的影響

與Sham組比較，IR組大鼠腦梗死面積百分率顯著增加（P<0.01），顯示缺血再灌注引起腦組織明顯壞死。腹腔注射給予BerPC50、100、200mg·kg-1，連續(xù)14d，可劑量依賴性縮小腦梗死面積，且50、100、200mg·kg-1組與IR組比較，差異具有極顯著性（P<0.01）。且BerPC200mg·kg-1組作用明顯強(qiáng)于相同劑量的Ber組（P<0.01）。見(jiàn)表2。

3.3對(duì)SOD、GSHPX活性及MDA含量的影響

與Sham組比較，IR組SOD、GSHPX活性明顯降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)。與IR組比較，Ber組、BerPC3個(gè)劑量組SOD活性顯著升高，差異有顯著性（P<0.05或P<0.01），且BerPC200mg·kg-1組作用明顯強(qiáng)于相同劑量的Ber組（P<0.05）。與IR組比較，Ber組、BerPC3個(gè)劑量組GSHPX活性顯著升高，差異有顯著性（P<0.05或P<0.01）。與IR組比較，所有給藥組MDA含量均顯著降低，差異有極顯著性（P<0.01）。見(jiàn)表3。

表2對(duì)大鼠腦梗死面積的影響略

表3對(duì)SOD、GSHPX活性及MDA含量的影響(略)

4討論

在缺血性腦損傷的過(guò)程中，由于大量自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，破壞了膜脂質(zhì)的代謝和結(jié)構(gòu)，從而改變酶蛋白的微環(huán)境。另一方面，自由基也可直接氧化酶蛋白氨基酸殘基，引起酶蛋白構(gòu)象改變，使酶失活。GSHPX在細(xì)胞質(zhì)中直接參與清除H2O2，SOD能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。大鼠腦缺血后，SOD和GSHPX活性明顯低于正常，清除自由基能力下降，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA生成增多。從本文結(jié)果看：預(yù)先給予BerPC可明顯減輕大鼠缺血后的行為障礙，減小腦梗死體積百分比，明顯降低SOD和GSHPX的活性抑制，減少M(fèi)DA的生成，與文獻(xiàn)［2］報(bào)道Ber藥理作用基本一致，顯示BerPC對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與其抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載是引起腦缺血再灌注的重要因素，BerPC對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響，我們將另行研究。

燈盞乙素是Ber的主要有效成分之一，為黃酮木脂素類化合物，其結(jié)構(gòu)決定Ber溶解度較低，口服不易吸收，這在一定程度上影響了其療效的發(fā)揮。磷脂為體內(nèi)細(xì)胞膜的基本組成物質(zhì)，與細(xì)胞膜的親合力強(qiáng)。文獻(xiàn)［5］報(bào)道，磷脂在一定條件下與天然活性成分藥物進(jìn)行復(fù)合,得到天然活性成分磷脂復(fù)合物(phytosomes),其理化性質(zhì)和生物特性較原化合物均有不同程度的改變。phytosomes以磷脂作載體，可以使黃酮類化合物很容易透過(guò)細(xì)胞的脂質(zhì)膜，顯著地改變其生物有效性。本文實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BerPC的藥理作用明顯強(qiáng)于等劑量的Ber，且PC無(wú)明顯的藥理作用，提示Ber和磷脂形成一種全新的復(fù)合化合物，可能提高了Ber的生物利用度。

【參考文獻(xiàn)】

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［3］葛慶華，周臻，支曉瑾.燈盞花素在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和絕對(duì)生物利用度研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2003，34(12)：618-621.

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