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基因重組范文第1篇

關(guān)鍵詞：基因突變；基因重組

中圖分類號：G632 文獻標(biāo)識碼：B 文章編號：1002-7661（2013）33-151-01

一、教材內(nèi)容

本章內(nèi)容既是對前四章內(nèi)容合乎邏輯的延續(xù)，又是學(xué)習(xí)第六章《從雜交育種到基因工程》和第七章《現(xiàn)代生物進化理論》的重要基礎(chǔ)。學(xué)好這節(jié)課有助于學(xué)生更好地理解“誘變育種”和 “基因突變是新基因產(chǎn)生的途徑，是生物變異的根本來源，是生物進化的原始材料” 。所以在知識上它起到了承上啟下的作用，這決定了本節(jié)內(nèi)容的重要性。

二、三維目標(biāo)

知識目標(biāo)：掌握基因重組的本質(zhì)和特點，會辨別不同情況下的基因重組。

能力目標(biāo)：借助類比活動揭示基因結(jié)構(gòu)改變的類型、原因，提高學(xué)生判斷、推理等能力。

情感目標(biāo)：通過生物變異的事例，增強學(xué)生對生物世界的好奇心。引領(lǐng)學(xué)生自主合作探究.

三、重點難點

（1）重點：基因突變的類型、原因、概念、特點。（2）難點：基因突變的意義。

四、教學(xué)方法

（1）針對基因重組，選擇的教學(xué)模式為：借助孟德爾的實驗Ⅱ設(shè)置問題情境，引導(dǎo)學(xué)生對提出的問題進行探究―觀察現(xiàn)象―分析探索―得出結(jié)論。實現(xiàn)由舊知到新知的躍遷。

（2）針對基因突變，選擇的教學(xué)模式為：借助類比活動：全班同學(xué)抄寫黑板上5位司機的身份證號統(tǒng)計抄錯的原因？增添、缺失、替換，結(jié)果？

五、課前準(zhǔn)備

教師準(zhǔn)備：一個堿基序列為ATGGCATGT產(chǎn)生了大量的基因，其中絕大多數(shù)基因的堿基序列是正常，但偶爾也產(chǎn)生了如下4種新基因.如果這四種新基因也能正常表達，試寫出它們轉(zhuǎn)錄和翻譯的產(chǎn)物。

學(xué)生準(zhǔn)備：1、做好相應(yīng)的知識準(zhǔn)備（減數(shù)分裂、DNA結(jié)構(gòu)和復(fù)制、中心法則、孟德爾遺傳規(guī)律的相關(guān)內(nèi)容） 2、提前完成課前熱身題小組長準(zhǔn)備：（要求組長提前完成統(tǒng)計工作，上課要做為材料要進行類比活動）

六、課時安排：1課時

七、教學(xué)過程 （打開多媒體展示素材）

情景一：

（1）姐妹皮膚的白與黑，油菜籽粒飽滿的種子與普通種子相比，太空椒與普通青椒相比，性狀有明顯的差異，原因何在？

（2）把子粒大而飽滿的種子種下去長不出同樣好的種子，而是普通種子；把肥大的太空青椒籽種下去可以結(jié)出肥大的青椒。這些現(xiàn)象說明什么問題？

（3）從上述可以看出生物的變異有幾種類型？思維訓(xùn)練：“由環(huán)境引起的變異都是不可遺傳的變異”，對嗎？

【小結(jié)】可遺傳的變異是生物變異的主要類型。它的來源主要由三個方面：基因突變、基因重組和染色體變異。？

情景二：孟德爾的兩對相對性狀的雜交實驗的現(xiàn)象：

小組討論：1、F1自交得到的F2代出現(xiàn)了幾種性狀表現(xiàn)？比例分別是多少？ 2、F2代中與親代有什么不同的表現(xiàn)型？3、從性狀來看，變異的概率是多少？4、這種變異產(chǎn)生的原因是什么？

情景三：請分析：1.同源染色體上的非等位基因在什么時期重新組合？有哪些組合情況？ 2.非同源染色體上的非等位基因在什么時期重新組合？有哪些組合情況？ 3.基因重組的結(jié)果是什么？它能產(chǎn)生新基因嗎？ 4. 人的體細胞中有23對染色體，請你根據(jù)自由組合定律計算，一位父親可能產(chǎn)生多少種染色體組成不同的，一位母親可能產(chǎn)生多少子種染色體組成不同的卵細胞？如何理解人群中個體性狀是多種多樣的？

師生總結(jié)：“基因重組”的概念、時間、結(jié)果、意義。 “基因重組是可遺傳變異來源之一”

情景四：基因突變實例-鐮刀型細胞貧血癥病因的圖解。

學(xué)生嘗試：結(jié)合鐮刀型細胞貧血癥的實例，嘗試總結(jié)基因突變的概念，進一步理解 “基因突變產(chǎn)生新基因，基因突變也是產(chǎn)生可遺傳變異的來源之一”。教師總結(jié)：基因突變?nèi)绻l(fā)生在配子中，將會遺傳給后代，發(fā)生在體細胞中的基因突變，一般是不能夠遺傳的。發(fā)生在植物體細胞中的基因突變，如何能夠遺傳？指導(dǎo)學(xué)生閱讀：教材中有關(guān)基因突變原因的內(nèi)容。

情景五：癌細胞是體細胞發(fā)生基因突變的結(jié)果，在生活中有什么因素容易引發(fā)癌癥，從而發(fā)生基因突變呢？即癌基因突變的具體原因（外因？內(nèi)因？）

情景六： 資料①正常人紅綠色盲?、?？人的正常人細胞癌細胞③普通羊短腿羊 ④果蠅的紅眼白眼⑤果蠅長翅殘翅⑥小麥的有芒無芒⑦低產(chǎn)青霉高產(chǎn)青霉 。

小組活動：結(jié)合投影資料1、2能分析出基因突變有什么特點？

教師小結(jié)：即基因突變是新基因產(chǎn)生的途徑，是生物變異的根本來源

學(xué)生填表：比較基因突變和基因重組

八、教學(xué)反思

適當(dāng)改變了課本內(nèi)容的呈現(xiàn)順序：先講基因重組發(fā)生的時期、特點，再講基因突變的類型、原因、概念、特點和意義，在知識上實現(xiàn)了由舊知到新知的躍遷，有利于學(xué)生對知識的理解和掌握。在共同探究概念、動手體驗、合作交流部分注意時間的分配，一定要給學(xué)生留夠觀察、閱讀、思考、分析、合作的時間。教師不要獨霸課堂，真正落實學(xué)生為主體，教師為主導(dǎo)的理念。

基因重組范文第2篇

關(guān)鍵詞：重組腺病毒；山羊SKIP基因；基因過表達；感染細胞

中圖分類號：Q78 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5258-04

Construction of A Recombinant Adenovirus Vector pAd-SKIP

XIONG Qi，ZHANG Nian，SUO Xiao-jun，LI Xiao-feng，LIU Yang，CHEN Ming-xin

（Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding / Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China）

Abstract： In this study， the Gateway technology was used to construct a recombinant adenovirus vector pAd-SKIP. The SKIP gene was amplified first by PCR and inserted into pcDNA3.1（+） vector， then cloned into adenovirus adshuttle vector pYr-adshuttle-2 to obtain recombinant plasmid pYradshuttle-2-SKIP. The expression cassette of SKIP-EGPF was transferred to pAd/PL-DEST with LR recombinant reaction to acquire recombinant adenovirus plasmid pAd-SKIP-EGFP. The correct clone was linearized and tranformed into 293A cells. Recombinant adenovirus pAd-SKIP was obtained and identified. The transfection efficiency was observed under the fluorescent microscope. The results confirmed that the recombinant adenovirus vector contained goat SKIP gene. This vector was found to infect C2C12 cells efficiently. It indicated that the recombinant adenovirus expressing SKIP gene and green fluorescence was successfully constructed， laying the foundation for further study.

Key words： recombinant adenovirus vector； goat SKIP gene； gene overexpression； infected cells

5′肌醇磷酸酶（SKIP）由Ijuin等[1]首先發(fā)現(xiàn)并分離，在動物各組織中廣泛表達，尤其在心臟骨骼肌和腎臟中高表達，因此SKIP被稱為骨骼肌和腎臟富含的5′肌醇磷酸酶。SKIP被鑒定為通過水解PI（3，4，5）P3為PI（3，4）P2而調(diào)控胰島素信號的5′-脂質(zhì)磷酸酶。PI（3，4，5）P3的下游PI（3，4，5）P3/Akt信號在成肌分化進程中有重要作用[2-4]。SKIP雜合突變小鼠比目魚肌和股四頭肌的質(zhì)量顯著提高[5]也提示SKIP具有調(diào)節(jié)骨骼肌纖維發(fā)育的功能。因此有必要進一步研究該基因在體內(nèi)外參與骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機制。本試驗采用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建了SKIP基因重組腺病毒，為下一步在體內(nèi)外研究SKIP對成肌分化的作用機制以及SKIP基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達載體pcDNA3.1（+）和腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-2購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司；腺病毒骨架載體pAd/PL-DEST、LR重組酶、DMEM培養(yǎng)液及新生牛血清購自Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；CloneEZ試劑盒購自Genescript公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、dNTPs、Taq酶及DNA Maker購自天根生化科技（北京）有限公司；酵母粉和胰蛋白胨購自O(shè)xide公司；腺病毒包裝細胞HEK293購自美國ATCC；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計、合成及PCR擴增 應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計引物，在上、下游引物5′端分別引入用于定向克隆的限制性酶切位點KpnⅠ、XhoⅠ，同時在上游引物中添加kozak序列GCCACC，用以增強基因表達。提取山羊體細胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板擴增目的基因，引物序列如下：SKIP-F：5'GGTACCGCCACCATGGAGGCCATGAG3′；SKIP

-R：5'CTCGAGTCAGATCTGTGGCTGGGCTTCAT3′。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s， 75 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否出現(xiàn)預(yù)期中的SKIP基因帶。

1.2.2 pcDNA3.1（+）-SKIP質(zhì)粒的構(gòu)建 將pcDNA3.1（+）和兩端帶酶切位點的SKIP基因分別以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，分別回收的線性化pcDNA3.1（+）質(zhì)粒和SKIP cDN段以定向克隆的方式用T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選菌落擴增，小量提取質(zhì)粒后以KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，若電泳后得到1.3 kb和5.4 kb兩個片段，則證明SKIP cDNA已插入到真核表達載體pcDNA3.1（+）上。

1.2.3 SKIP基因克隆至腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-2 用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切穿梭載體pYr-adshuttle-2和重組表達載體pcDNA3.1（+）-SKIP，凝膠電泳回收線性化的pYr-adshuttle-2和SKIP基因，用T4 DNA連接酶連接過夜，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。次日挑取卡那霉素選擇性培養(yǎng)基篩選的陽性克隆子進行菌落PCR鑒定；提取質(zhì)粒進行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定；同時送陽性菌落到北京奧科生物公司測序。

1.2.4 采用LR體外同源重組將SKIP表達框克隆至腺病毒表達載體pAd/PL-DEST 在10 μL LR體外同源重組反應(yīng)體系（含pYr-adshuttle-2-SKIP、pAd/PL-DEST和LR Clonase Ⅱ）中，加入蛋白酶K消化LR Clonase Ⅱ。將充分反應(yīng)后得到的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含AmpR抗性（終濃度為100 μg/mL）的LB平板上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。接著再次從每個培養(yǎng)皿上隨機挑取若干個單克隆菌落接種于50 mL含AmpR抗性（終濃度為100 μg/mL）的LB培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫搖床（250 r/min）培養(yǎng)過夜。用中量提取試劑盒提取質(zhì)粒，對提取的質(zhì)粒進行PCR驗證XbaⅠ酶切鑒定。

1.2.5 重組腺病毒pAd-SKIP的包裝 HEK293A細胞的準(zhǔn)備：提前12～24 h將1 mL HEK293A細胞懸液（1.5×106 個細胞/mL）接種在培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前1 h換成無血清的DMEM培養(yǎng)基250 μL。

轉(zhuǎn)染HEK293 A細胞包裝病毒：用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)，由PacⅠ線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293 A細胞。當(dāng)有明顯的細胞病態(tài)反應(yīng)（CPE）現(xiàn)象，且有>50%脫壁時即收細胞，加入500 μL無菌PBS緩沖液重懸，干冰浴和37 ℃間快速反復(fù)凍融3次裂解細胞，室溫下1 000 r/min離心15 min，沉淀細胞碎屑。將上清液再次感染HEK 293 A細胞擴增病毒，直至細胞在1周內(nèi)有明顯的CPE現(xiàn)象，且有>50%脫壁時即收細胞。同樣用無菌PBS緩沖液重懸，干冰浴和37℃間快速反復(fù)凍融3次裂解細胞，室溫下1 000 r/min 離心15 min，收集上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80 ℃保存。并進行PCR鑒定。

1.2.6 測定重組腺病毒滴度 取純化后的病毒液100 μL，10%SDS 20 μL、PBS 880 μL，65 ℃熱浴30 min后，渦旋3次，離心后測定病毒基因組DNA的OD260 nm和OD280 nm，據(jù)此計算病毒的顆粒數(shù)和純度，1 OD260 nm =1012 PFU/mL，若OD260 nm /OD280nm >1.3，表明純度較高。病毒滴度（PFU/mL）=OD260 nm×稀釋度×1012。

1.2.7 病毒感染C2C12細胞 將C2C12細胞（1×106個細胞/mL）接種于12孔板，每孔1 mL，12 h后將培養(yǎng)液吸出，各孔分別加入MOI 50～150的Ad-SKIP，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，在倒置熒光顯微鏡下分別用可見光和熒光觀察、成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 pcDNA3.1（+）-SKIP的酶切鑒定結(jié)果

用KpnⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，PCR擴增SKIP基因的正反向引物分別帶有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點。將含有插入方向正確的SKIP cDNA的重組pcDNA3.1（+）-SKIP經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)生大小分別為1.3 kb和5.4 kb的片段（圖1）。

2.2 pYr-adshuttle-2-SKIP的重組鑒定結(jié)果

將SKIP基因連接入pYr-adshuttle-2載體，陽性克隆經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，pYr-adshuttle-2載體大小為4 470 bp，SKIP基因大小約為1 350 bp，由酶切結(jié)果（圖2）可知，該克隆為正確克隆。將酶切鑒定正確的pYr-adshuttle-2-SKIP送去測序。并將測序結(jié)果與欲得到的目的序列相比對，顯示獲得的SKIP基因片段序列完全正確，證實pYr-adshuttle-2-SKIP構(gòu)建成功。

2.3 重組腺病毒載體pAd-SKIP的鑒定

將SKIP基因表達框采用LR體外重組技術(shù)克隆至表達載體pAd/PL-DEST，陽性克隆經(jīng)XbaⅠ單酶切鑒定，可切出一條約550 bp和一條約2.3 kb的條帶，且大帶大于8 kb（實際有3條大帶，即18 kb、8 kb、8 kb，但是一般很難分開，所以看上去就是一條粗帶）。由圖3結(jié)果可以初步判斷pAd-SKIP構(gòu)建成功。接著以質(zhì)粒pAd-SKIP為模板，設(shè)計引物擴增SKIP片段，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖4。由圖4可見，PCR擴增出的片段大小與SKIP基因片段大小一致，證實pAd-SKIP載體構(gòu)建成功。

2.4 重組腺病毒rAd-SKIP的產(chǎn)生和PCR鑒定

將PacⅠ線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293A，當(dāng)細胞有明顯的CPE現(xiàn)象，且有>50%脫壁時即收細胞進行裂解收病毒。提取腺病毒基因組DNA，以之為模板進行PCR反應(yīng)。引物用載體上自帶的CMV和BGH引物驗證。由PCR鑒定結(jié)果（圖4）可知，用載體上自帶的引物擴增出與SKIP基因長度同樣大小的片段，表明此腺病毒中有SKIP基因，而且相關(guān)表達框都在。證實rAd-SKIP包裝成功。

2.5 重組腺病毒對成肌細胞C2C12的感染

用不同MOI的重組腺病毒感染C2C12細胞，當(dāng)MOI為150時，超過80%的細胞出現(xiàn)熒光（圖5），表明所構(gòu)建的重組腺病毒生物活性高，可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因表達。

3 小結(jié)與討論

SKIP是調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路的關(guān)鍵5′肌醇磷酸酶。在肌源細胞中，血清饑餓可誘導(dǎo)IGF2自分泌。IGF2與IGF1受體互作，激活PI3K，產(chǎn)生PI-3，4，5-P3，PI-3，4，5-P3募集到細胞膜上激活A(yù)kt（蛋白激酶B），接著激活成肌基因的轉(zhuǎn)錄[5]。因此PI3K-Akt信號與成肌分化緊密相關(guān)。近年來，一些新的信號通路、分泌因子和信號分子不斷被發(fā)現(xiàn)能調(diào)控PI3K-Akt信號。如肌醇磷酸酶SKIP，它通過水解PI3K合成的脂質(zhì)第二信使PI-3，4，5-P3，參與Akt（蛋白激酶B）的激活[6-8]。但SKIP是否調(diào)控PI3K-Akt信號介導(dǎo)的成肌分化仍有待研究。

基因的過表達是研究基因功能的重要手段之一，將外源基因有效地導(dǎo)入靶細胞表達是后續(xù)研究的先決條件。腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重組病毒表達系統(tǒng)之一，可用于在哺乳動物細胞中瞬時及高水平地表達目的蛋白。具備宿主范圍廣，不依賴細胞周期，病毒滴度高，有較好的生物安全性等優(yōu)點[9]。腺病毒表達系統(tǒng)中的難點主要在于如何將外源基因表達框或者外源的shRNA表達框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上。由于腺病毒骨架載體比較大（～30 kb），而且載體中的一些常用酶切位點幾乎都有多個，如果用常規(guī)的酶切-連接的方式將外源基因或者shRNA表達框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上，則成功率很低，因此，目前的腺病毒表達系統(tǒng)基本上都是用同源重組的方法將外源基因構(gòu)建至腺病毒骨架載體上。

本試驗采用了Invitrogen公司的BLOCK-iT腺病毒表達系統(tǒng)和Gateway 技術(shù)，與市面上其他腺病毒表達系統(tǒng)往往利用大腸桿菌或者293細胞自身的同源重組系統(tǒng)不同，即利用LR 重組酶進行體外重組。與當(dāng)前其他腺病毒表達系統(tǒng)相比，這種體外重組更加方便、快速，重組效率更高。在本研究中，構(gòu)建了含山羊SKIP基因的腺病毒載體，并且經(jīng)酶切鑒定分析和PCR結(jié)果證實SKIP重組病毒構(gòu)建成功。病毒滴度高，并且可以高效感染C2C12細胞，表達能有效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，為下一步證實SKIP對骨骼肌細胞成肌分化的調(diào)控等研究奠定了基礎(chǔ)。

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[7] MANNING B D， CANTLEY L C. AKT/PKB signaling： navigating downstream[J]. Cell， 2007，129（7）：1261-1274.

基因重組范文第3篇

【摘要】 目的 構(gòu)建鴨乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆，通過體外細胞轉(zhuǎn)染獲得單一來源、基因序列清楚的體內(nèi)實驗的感染毒種。方法 以湖北麻鴨DHBV分離株（DQ276978）為模板，用PCR法從該DHBV全基因組克隆質(zhì)粒（pMD-DHBV）和DHBV陽性血清中獲取3部分基因片段，總長44kb，克隆至載體PCR21的SacI和NotI酶切位點，構(gòu)建含15倍鴨乙型肝炎病毒全基因的重組質(zhì)粒，并酶切鑒定其插入方向。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體LipofectineTM 2000導(dǎo)入雞肝癌細胞系(LMH)細胞中轉(zhuǎn)染表達，收集純化后的轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清液作為體內(nèi)實驗感染的標(biāo)準(zhǔn)毒種。結(jié)果 PCR鑒定、酶切鑒定及序列測定，證實成功獲得正向插入的1.5倍鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot檢測表明，該重組質(zhì)粒在LMH細胞內(nèi)存在各種病毒復(fù)制中間體；通過電鏡觀察，轉(zhuǎn)染細胞上清液中存在DHBV完整病毒顆粒。結(jié)論 經(jīng)體外重組，構(gòu)建出攜帶1.5倍加長DHBV基因組片段的重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15，并可在雞肝癌細胞LMH中介導(dǎo)高水平病毒復(fù)制，從而獲得含可自我復(fù)制病毒顆粒的轉(zhuǎn)染細胞上清液作為動物體內(nèi)感染接種物。

【關(guān)鍵詞】 鴨乙型肝炎病毒

鴨乙型肝炎病毒（DHBV）與人類乙型肝炎病毒（HBV）同屬嗜肝DNA病毒科，它們在形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因序列、病毒復(fù)制、致病機制及感染宿主規(guī)律等方面均較為相似，DHBV感染鴨模型使人們認識了嗜肝病毒的復(fù)制周期以及病毒持續(xù)存在和病毒徹底清除的機制。我們在對湖北麻鴨DHBV自然感染率調(diào)查的基礎(chǔ)上，選擇對DHBV易感且取材方便的湖北麻鴨作為實驗鴨種，并分離出1株DHBV新毒株（DQ276978）〔1〕。進而以該毒株為模板，構(gòu)建了15倍DHBV全基因重組質(zhì)粒，通過該質(zhì)粒在雞肝癌細胞系(LMH)中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達出含有可自我復(fù)制的病毒顆粒的細胞培養(yǎng)上清液作為單一來源、基因序列清楚的實驗毒種，以期建立標(biāo)準(zhǔn)化的湖北麻鴨乙型肝炎病毒體內(nèi)模型。另外，將該DHBV重組質(zhì)粒與不同劑量人類載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LMH細胞，通過抑制實驗以證實該DHBV體外實驗?zāi)Ｐ偷某醪綉?yīng)用。

1 材料與方法

11 材料

111 質(zhì)粒 pMD-DHBV為本實驗室構(gòu)建的含有湖北麻鴨（DQ276978）DHBV DNA全長基因組的質(zhì)粒；pSP65-DHBV16為雙拷貝頭尾相接的全基因DHBV DNA重組質(zhì)粒，該克隆質(zhì)粒(美國 Mandart 教授饋贈)；APOBEC3G真核表達質(zhì)粒為本實驗室構(gòu)建保存；PCR21載體(美國Invitrogen公司)。

112 DHBV陽性血清 取自擴增出DHBV DNA全長基因組（DQ276978）的陽性血清。

113 細胞 禽類雞肝癌細胞系LMH，為本室傳代保存。

114 工具酶 LA Taq酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、Sac I、Kpn I、Not I及凝膠回收試劑盒(大連 TAKARA公司)；Taq DNA聚合酶(美國Promega公司)；T4DNA連接酶(美國GIBICO公司)。

115 生化及其它試劑 地高辛(DIG)標(biāo)記及檢測試劑盒(德國Roche公司)；Waymouth 細胞培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；LipofectineTM2000(美國Invitrogen公司)。DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(德國QIAGEN公司)；質(zhì)粒提取試劑盒和動物培養(yǎng)細胞基因組DNA純化試劑盒(大連TaKR公司)。

12 方法 通過對湖北麻鴨（DQ276978）DHBV DNA的全長克隆質(zhì)粒的序列限制酶切圖譜分析〔1〕，已明確其基因組的結(jié)構(gòu)及與復(fù)制相關(guān)的重要元件的序列位置，在此基礎(chǔ)上運用3片法構(gòu)建出能自我復(fù)制的重組質(zhì)粒。

121 構(gòu)建質(zhì)粒PCR 21-DHBV15 用EcoRI和BamHI雙酶切pMD-DHBV，得到目的片段DA（DHBV3024/0nt-1473nt）；設(shè)計引物DB1/DB2和DC1/DC2分別經(jīng)PCR擴增DHBV陽性血清獲得目的片段DB（1473nt-2870nt）和DC（1395-3024/0nt）。將上述3片段插入PCR21的相應(yīng)酶切位點后即得到15倍DHBV全基因重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15。

122 PCR鑒定 引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2為DHBV基因S區(qū)和C區(qū)的高度保守序列段，引物序列如下：Ps1（1318F）5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3′，Ps2（1739R）5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′；Pc1（187F）5′-GCAATCACTAGACCAATCCA-3′，Pc2（397R）5′-GAGATCTATGGTGGCTGCTC-3′。PCR反應(yīng)液組成：10×Buffer5μl;MgCl2（25mmol/L）3μl;dNTP（10mmol/L）1μl;Ps1/Ps2或Pc1/Pc2各1μl；Taq酶1μl；DHBV模板5μl；加滅菌純水至50μl。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃5min；94℃50s，61℃45s，72℃50s，40個循環(huán)；72℃10min。

123 酶切鑒定 用BamHI，SacI和EcoR I，Not I和EcoRI，Sac I和BamH I分別進行酶切鑒定。

124 序列測定 取一株陽性克隆質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司測序。

125 脂質(zhì)體LipofectineTM2000介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染 在LMH細胞達到80%～90%融合時進行轉(zhuǎn)染，設(shè)未轉(zhuǎn)染LMH細胞對照和pSP65-DHBV16質(zhì)粒對照。

126 蛋白印跡(Southern Blot)分析 提取轉(zhuǎn)染LMH細胞內(nèi)總DNA后，用DIG標(biāo)記的DHBV全長基因組探針雜交，X-ray膠片發(fā)光顯影。

127 轉(zhuǎn)染細胞上清液中病毒顆粒電鏡觀察 收集轉(zhuǎn)染細胞的上清液，離心后用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解沉淀，將該沉淀溶解物通過磷鎢酸負染法進行電鏡觀察。

128 APOBEC3G真核表達質(zhì)粒對DHBV的抑制效應(yīng)實驗 質(zhì)粒PCR21-DHBV15分別與不同劑量（20和40μg）的APOBEC3G真核表達質(zhì)粒pXF3G-HA通過LipofectamineTM2000共同轉(zhuǎn)染LMH細胞，72h后收集細胞。

2 結(jié)果

21 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15的PCR鑒定 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15經(jīng)不同引物C1/C2、S1/S2、DB1/DB2和DC1/DC2擴增后可產(chǎn)生依次為211，452，1 430和1 600的目的片段（圖1）。

22 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15的酶切鑒定 未酶切的重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15為84kb；用SacI和EcoRI雙酶切該重組質(zhì)粒可產(chǎn)生29和55kb的片段；該重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生31和53kb的目的片段；用NotI和EcoRI雙酶切PCR21-DHBV15可產(chǎn)生16和68kb的片段；用SacI和BamHI限制性內(nèi)切酶消化該重組質(zhì)粒后則產(chǎn)生16和68kb的目的片段。上述酶切結(jié)果均與預(yù)期相符（圖2）。

23 轉(zhuǎn)染細胞上清液中DHBV病毒顆粒的檢測 在轉(zhuǎn)染細胞上清液中檢出大量直徑為30～65nm的球形顆粒，其中一種為大小較均一，直徑為40～50nm的實心病毒，有核心和球形包膜，即完整病毒顆粒；另一種是直徑為30～65nm的類球形空心病毒，中央凹陷，未見絲狀、管狀體，即病毒表面抗原顆粒（圖3）。

24 轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)DHBV DNA的檢測 分別將pSP65-DHBV16和PCR21-DHBV15轉(zhuǎn)染LMH細胞，72h后收集細胞，提取DNA進行Southernblot檢測。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15與雙拷貝DHBV全長基因組質(zhì)粒pSP65-DHBV16一樣，均在轉(zhuǎn)染細胞中檢出大量DHBV DNA復(fù)制中間體（圖4）。

M：DL2000 Marker;1：primer C1/C2;2：primer S1/S2;3：primer DB1/DB2；4：primer DC1/DC2

圖1 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15的PCR鑒定（略）

M1：1Kb Marker;1：PCR2.1-DHBV1.5；2：PCR2.1-DHBV1.5/SarI+EcoR I;3：PCR2.1-DHBV1.5/BamH I;4：PCR2.1-DHBV1.5/Not I+EcoR I;5：PCR2.1-DHBV1.5V/Sac I+BamH I;M2：500bp Lad der

圖2 重組質(zhì)粒PCP2.1-DHBV1.5的酶切鑒定（略）

25 APOBEC3G對DHBV核衣殼相關(guān)DNA水平具有劑量依賴的抑制效應(yīng) 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15分別與不同劑量（20和40μg）的APOBEC3G真核表達質(zhì)粒pXF3G-HA共同轉(zhuǎn)染LMH細胞，轉(zhuǎn)染后Southern blot檢測細胞內(nèi)的DHBV核衣殼相關(guān)DNA的結(jié)果顯示，APOBEC3G對轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)DHBV核衣殼相關(guān)DNA水平具有劑量依賴的抑制效應(yīng)（圖5）。

圖3 重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15轉(zhuǎn)染細胞上清液(×60000)（略）

1：pSP65-DHBV16;2:PCR2.1-DHBV1.5;RC：松弛環(huán)狀DNA；L：線性DNA；SS：單鏈DNA

圖4 Southern blot 檢測轉(zhuǎn)細胞內(nèi)DBBV復(fù)制水平（略）

PCR21-DHBV1.5(μg)

20 20 20

pX F3G-HA (μg)

- 20 40

pXF3H(μg)

40 20 -

pXF3H：真核表達載體；

pXF3H-HA：APOBEC3G真核表達質(zhì)粒

圖5 APOBE3G對細胞內(nèi)DHBV核衣殼相關(guān)DNA水平的抑制（略）

3 討論

在HBV己證實，構(gòu)建13倍加長或頭尾相接雙拷貝的基因組，可以產(chǎn)生所有HBV轉(zhuǎn)錄子，并啟動HBV的復(fù)制〔2〕。土拔鼠肝炎病毒(WHV)研究也有類似的結(jié)果〔3〕。LMH是DHBV穩(wěn)定表達細胞系〔4，5〕，它能支持DHBV克隆病毒的復(fù)制，并能分泌完整病毒顆粒。本實驗通過對湖北麻鴨DHBV分離株(DQ276978)的DNA全長基因組核苷酸水平和氨基酸水平的序列分析研究〔1〕，成功構(gòu)建了15倍加長DHBV基因組重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定以及序列測定均證明所構(gòu)建的重組體與預(yù)期相符，包含能高效自我啟動DHBV復(fù)制的全部元件。核酸水平研究和電鏡觀察也證實該重組質(zhì)粒能夠在LMH細胞中利用DHBV固有的增強子和啟動子進 行有效復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及表達，由此也證明所構(gòu)建的重組體可以用于體內(nèi)基因免疫，為其后建立鴨體內(nèi)實驗感染標(biāo)準(zhǔn)化模型提供實驗依據(jù)。另外，我們進一步用本實驗室構(gòu)建的APOBEC3G真核表達質(zhì)粒和PCR21-DHBV15重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染LMH細胞系進行抑制實驗以證實該DHBV體外實驗?zāi)Ｐ偷某醪綉?yīng)用。APOBEC3G是一種天然免疫分子，具有抗病毒感染的效應(yīng)〔6，7〕。實驗結(jié)果顯示，APOBEC3G能明顯降低DHBV核衣殼相關(guān)DNA的水平，并且顯示出劑量依賴性，表明APOBEC3G也可能非特異性地抑制DHBV復(fù)制，但其作用機制尚待進一步研究。

【參考文獻】

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基因重組范文第4篇

【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒

關(guān)鍵詞 :肝炎病毒，乙型;聚合酶鏈反應(yīng);腺病毒科 中圖號:Q74 文獻標(biāo)識碼:A

0 引言

乙型肝炎是一種常見傳染病，危害極大.我們通過PCR及基因重組技術(shù)將adr亞型乙型肝炎病毒表面抗原HB-sAg基因克隆到腺病毒穿梭載體，構(gòu)建了重組HBsAg腺病毒穿梭載體，為制備HBsAg腺病毒疫苗的研制打下了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

模板pⅡ1.2（含HBV adr亞型全基因序列）根據(jù)《分子克隆》的操作，采用堿裂解法大量制備質(zhì)粒pⅡ1.2，紫外分光光度法定量.PCR引物的設(shè)計用于擴增HBV S區(qū)基因的引物，由上海生工公司合成，序列:For:cgtcta-gagggaacaagagctacagcatg.Rev:cgtctagataagggaatagccccaacg 1.2 方法 根據(jù)ExpandTM High Fidelity PCR System

（寶靈曼公司）操作說明進行PCR擴增，反應(yīng)體系:pⅡ1.2100ng，HBsFor及Rev300nmol?L

-1 ，dNTP200mol?L-1 ，總反應(yīng)體積50μL.循環(huán)參數(shù)如下:94℃2min;94℃，15s;56℃，30s;68℃，1min;循環(huán)30次，72℃，7min.Klenow酶（Promega公司）補平PCR片段，KpnⅠ/HindⅢ（華美公司）雙酶切，用T4DNA連接酶（Promega公司）將酶切片段克隆入pUC18載體的相同酶切位點，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，挑單菌落擴增，各取2μL菌液進行PCR反應(yīng)，并提取質(zhì)粒用KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定陽性克隆，重組質(zhì)粒命名為pUC/HBs.任選一陽性克隆提取質(zhì)粒進行DNA自動測序.將KpnⅠ/HindⅢ雙酶切pUC/HBs所得片段按上述方法亞克隆入pAdCMV載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，PCR法及KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定陽性克隆，重組質(zhì)粒命名為pAdCMV/HBs.

2 結(jié)果

經(jīng)PCR反應(yīng)擴增出HBV S區(qū)基因片斷大小約1250bp.隨機挑5個轉(zhuǎn)化菌單菌落擴增，其中4個轉(zhuǎn)化菌PCR反應(yīng)及酶切鑒定同時陽性.隨機挑4個轉(zhuǎn)化菌單菌落擴增，4個轉(zhuǎn)化菌PCR反應(yīng)及酶切鑒定皆陽性.

基因重組范文第5篇

關(guān)鍵詞：uPA；GFP；腺相關(guān)病毒載體；基因轉(zhuǎn)染

中圖分類號：Q786　文獻標(biāo)識碼：A　文章編號：1007－7847(2007)03－0242－06

尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase typeplasminogen activator，uPA)自身有直接降解基底膜及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的作用，uPA還可通過激活纖溶酶及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解ECM，uPA激活肝細胞生長因子間接對損傷腎臟起保護作用，因此uPA在降解ECM、逆轉(zhuǎn)纖維化方面起重要作用，腎臟纖維化的病理改變主要是腎小球硬化和，腎小管間質(zhì)纖維化，是腎臟ECM合成與降解失衡，導(dǎo)致ECM過度積聚的結(jié)果，因此，我們設(shè)想采用高效表達載體-腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus，AAV)載體，將uPA基因全長序列轉(zhuǎn)移到有纖維化病變的部位，以增強病變局部uPA的表達，發(fā)揮其降解ECM的作用，從而緩解腎纖維化的進程，為臨床治療腎臟纖維化提供理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1．1　材料

AAV Helper-Free System(#240071)、pAAV-IRES-hrGFP(#240075)、AAV-293細胞(#240073)和XL10-Gold感受態(tài)細菌(#200314)購自美國Stratagene公司，TRIzol regent(15596-018)購自美國invitrogen公司，Reverse Transcription System(A3500)、pGEM-T EasyⅡ(A1380)，L4 DNA ligase(#M1801)、Wizard PureFection Plasmid DNA Pu-rification System(A1330)購自美國Promega公司，DNA Ladder Mix(#SM033 1)、Taq DNA polymerase(EP0404)、dNTP Mix(R0191)購自美國Fermen-tas MBI公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamH](R0136V)、Xho I(R0146V)購自美國NEW ENG-LAND Biolabs公司，Gel Extraction Mini Kil(Z0021A)購自中國長沙安比奧公司，引物For-ward Primer：5′-TYCGGATCCCCATGAGAGTCTG-GCTTGC-3′，Reverse Primer：5′-TGGCTCGAGTCAGAAGGCTAGGCCATTC-3′，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成，兔抗Flag M2抗體(F1804-200UG)購自美國Sigma公司，2周齡SD雄性大鼠購自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動物實驗中心，腎小管上皮細胞由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院小兒腎臟病研究室保存。

1．2　方法

1．2．1　大鼠腎臟uPA基因的獲得

取Spragoc-Dawleg 2周齡雄性幼鼠，按TRI-ZOL一步法提取腎臟總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成eD-NA第一鏈，PCR法特異擴增uPA cDNA，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，uPA cDNA為1299bp，用GelExtraction Mini Kit回收酶切產(chǎn)物，置pH8.0 TE緩沖液中，uPA cDNA-20℃保存。

1．2．2　pGEM-T-uPA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將uPA cDNA用T4 DNA ligase連接到pGEM-T Easy載體上，并轉(zhuǎn)染到JM 109感受態(tài)細菌，涂于含氨芐青霉素的瓊脂平板表面，置37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)14～16h，作氨芐青霉素抗性篩選，挑選固體平板上長勢良好的白色菌落6個，分別接種于3mLLB培養(yǎng)液內(nèi)(Amp)，于37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)14h增菌，將6管菌液各取1.5mL，按Puprep PIasmid Miniprep Kit說明書提取質(zhì)粒，得到pGEM-T-uPA重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒用BamHI/Xho I雙酶切后，證實含相應(yīng)的uPA基因片斷，用Gel Extraction Mini Kit回收uPA基因片斷，-20℃保存。

1．2．3　pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將上一步驟中獲得的uPA基因片段用T4DNA ligase連接到pAAV-IRES-hrGFP質(zhì)粒的多克隆位點，并轉(zhuǎn)染到XL 10-Gold感受態(tài)細菌，涂于含氨芐青霉素的瓊脂平板表面，置37℃溫箱倒置培養(yǎng)14～16h，作氨芐青霉素抗性篩選，挑選固體平板上長勢良好的白色菌落6個，分別接種于3mL LB培養(yǎng)液內(nèi)(Amp)，于37℃搖床內(nèi)振搖培養(yǎng)14～16h增菌，將6管菌液各取1.5mL，按Puprep Plasmid Miniprep Kit說明書提取質(zhì)粒，得到DAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒用BamH I/Xho I雙酶切后，證實含uPA基因片斷，DAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒送檢測序，準(zhǔn)備足夠的pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒和其他兩個輔助質(zhì)粒oAAV-RC和pHelper，用Wizard Pure FectionPlasmid DNA Purification System提取超純質(zhì)粒，供下一步轉(zhuǎn)染實驗。

1．2．4　AAV-293細胞培養(yǎng)

AAV-293細胞來源于普通的HEK293細胞系，但是可以產(chǎn)生較高的病毒滴度，HEK293是轉(zhuǎn)染了腺病毒5型DNA的人胚胎腎細胞，AAV-293細胞在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長，AAV-293細胞貼壁不牢，輕吹大瓶壁即可傳代，在細胞達到50％融合時傳代，且傳代不宜超過20代，同時注意傳代和接種時不要讓細胞

成塊。

1．2．5　pAAV-hrGFP-uPA的產(chǎn)生及鑒定

接種3×106個AAV-293細胞于100mm培養(yǎng)皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)2d細胞達到70％～80％融合時，吸取每個質(zhì)粒溶液pAAV-hrGFP-uPA質(zhì)粒、pAAV-RC和pHelper(濃度均為1g/L)各10μg加入到15mL柱狀試管中，再加入1mL 0.3mol/L的CaCl2，輕輕混勻，加入1mL 2×HBS于另一柱狀試管中，滴加上述1.03mL DNA/CaCl4混合物，反復(fù)吹打混勻，以點滴方式加入DNA/CaCl2/HBS懸液于AAV-293細胞的培養(yǎng)皿中，旋轉(zhuǎn)均勻分散該DNA懸液，將培養(yǎng)皿放人37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，培養(yǎng)結(jié)束后，添加10mL新鮮的含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)基和細胞于15mL的柱狀試管中，經(jīng)過4次冰凍和解凍(37℃)循環(huán)，每次持續(xù)10min，然后于室溫中離心(10000g)10min，轉(zhuǎn)移上清(初病毒儲存液)于另一新的試管中置-80℃保存，Buffer TE代替質(zhì)粒作陰性對照，轉(zhuǎn)染后48h倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達，以確定轉(zhuǎn)染成功；轉(zhuǎn)染后72h收集病毒顆粒，并將獲得的病毒顆粒再次感染AAV-293細胞，以確定其感染能力。

1．2．6　病毒載體的純化與滴度測定

對重組的pAAV-hrGFP-uPA用親和層析、離子交換層析和分子篩層析進行純化：純化后用斑點雜交方法檢測重組病毒的滴度；利用高壓液相層析(HPLC)法檢測重組病毒的純度，具體方法參照文獻。

1．2．7　uPA基因轉(zhuǎn)染腎小管細胞及其表達的測定

按每孔1.5×105個腎小管細胞接種于12孔培養(yǎng)平板中，培養(yǎng)細胞達到70％融合，每孔添加終濃度為4mol/L羥基脲和1mol/L丁酸納，混勻后，放人培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5～6h，吸出培養(yǎng)基，加入1.5mL預(yù)溫的含20％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基和相應(yīng)的病毒存儲液0.5mL，繼續(xù)培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后。倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達，uPA基因的表達以Flag標(biāo)記蛋白進行免疫組化染色來判斷，一抗為兔抗Flag M2抗體(1:200)，二抗為生物素化的羊抗兔抗體，加SABC孵育后進行DAB顯色。

2　結(jié)果

2．1　uPA cDN段的獲得

用RT-PCR法擴增大鼠uPA eDNA 1299 bP片段，瓊脂糖凝膠電泳證實所得到的基因片段是正確的(圖1)。

2．2 pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒的酶切鑒定

pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切后得到1299 bp的uPA基因片段，表明pAAV-hrGFP-uPA重組質(zhì)粒的構(gòu)建正確(圖2)。

2．3　pAAV，hrGFP-uPA重組質(zhì)粒DNA序列分析

證實pAAV-hrGFP-uPA序列完全正確，無堿基突變。

2．4　pAAV-hrGFP-uPA的產(chǎn)生

分別取 pAAV-hrGFP-uPA和pAAV-RC、pHelper質(zhì)粒各10μg，經(jīng)磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞2～3d，Buffer TE代替質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞作陰性對照，陰性對照平皿中AAV-293細胞長滿后有少量細胞漂浮，但平皿上一直布滿細胞，培養(yǎng)基變成桔黃色，提示陰性對照沒有病毒顆粒產(chǎn)生，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的AAV-293細胞逐漸聚集成團并漂離平皿，培養(yǎng)基中有大量漂浮細胞，培養(yǎng)基的顏色由桔黃色變?yōu)辄S色，細胞腫脹、變圓，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見細胞呈綠色，表明轉(zhuǎn)染成功(圖3、4)。

2．5　uPA基因轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞及其表達

AAV-293細胞產(chǎn)生的病毒顆粒轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察約60％～70％的腎小管上皮細胞表達綠色熒光蛋白，免疫組化法觀察到腎小管上皮細胞可有效表達flag蛋白，細胞質(zhì)中具有較多的棕黃色顆粒，陰性對照組均沒有綠色熒光蛋白和flag蛋白的表達(圖5、6)。

3 討論

腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化歸根結(jié)底是腎臟ECM合成與降解失衡導(dǎo)致ECM過度積聚的結(jié)果，目前已知參與ECM降解的酶主要有3類：1)絲氨酸蛋白酶；2)基質(zhì)金屬蛋白酶；3)半胱氨酸蛋白酶，其中主要是前兩類，uPA屬于絲氨酸蛋白酶家族，uPA的主要作用是器官形態(tài)發(fā)生、組織修復(fù)和腫瘤浸潤，uPA自身有直接降解基底膜及ECM的作用，uPA還能切斷纖溶酶原中脯氨酸-甘氨酸-精氨酸-纈氨酸序列中的精氨酸-纈氨酸連接，催化無活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，uPA對纖溶酶原的激活是一個正反饋逐級放大效應(yīng)，纖溶酶是一廣譜蛋白酶，能夠降解存在于基底膜和，ECM的各種糖蛋白包括血纖維蛋白、粘連蛋白、層連蛋白和蛋白多糖中的核心蛋白，進而溶解血管內(nèi)的纖維蛋白凝塊和ECM成分，并形成細胞外局部溶解區(qū)。構(gòu)成細胞轉(zhuǎn)移的通道，有利于新生的內(nèi)皮細胞遷移、生長進入周圍基質(zhì)，形成新的微血管；uPA又可激活MMPs，該酶是鋅依賴性內(nèi)肽酶，是參與基質(zhì)降解的主要成分；還能激活肝細胞生長因子，肝細胞生長因子是一個有力的抗纖維化因子，對損傷腎臟有保護作用，基因治療器官組織纖維化已成為慢性疾病治療領(lǐng)域的研究熱點，利用各種有效的和組織特異性的載體系統(tǒng)將降解ECM的外源基因?qū)爰毎麅?nèi)，到達纖維化的組織和器官，可緩解纖維化程度，有研究報道腺病毒攜帶人uPA基因可誘導(dǎo)實驗性肝硬化動物模型的肝硬化緩解，uPA促進HGF從基質(zhì)中釋放并活化，緩解肺纖維化，因此，利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)增強uPA基因的表達可能會大大降解ECM成分，緩解腎臟纖維化。

由于腎臟細胞的有絲分裂指數(shù)較低，腎臟基因的轉(zhuǎn)移效率至今仍不理想，因此，我們以新型的無輔腺相關(guān)病毒AAV-2作為載體，采用基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了攜帶uPA基因和綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因的腺相關(guān)病毒重組質(zhì)粒，用來轉(zhuǎn)移基因，本實驗中所選用的pAAV-IRES-hrGFP質(zhì)粒作為攜帶目的基因的主要載體，能同時表達目的基因蛋白、GFP和Flag蛋白，質(zhì)粒中的GFP可作為病毒顆粒轉(zhuǎn)染細胞成功與否及細胞定位的有效標(biāo)記，F(xiàn)lag蛋白僅作為標(biāo)簽提示目的基因蛋白的表達，還可用來分析未知基因表達的情況，腺相關(guān)病毒(adeno-asso-ciated virus，AAV)屬微小病毒科，能高效轉(zhuǎn)染到各種宿主細胞中，AAV作為基因治療載體的優(yōu)勢主要有：1)AAV是一種人源性的病毒，對人體無

致病性，免疫反應(yīng)輕微，有利于體內(nèi)轉(zhuǎn)染；2)可定點整合至人的19號染色體，并能較穩(wěn)定的存在，從而避免了其它病毒隨機整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危險；3)AAV攜帶的外源基因可以長期持續(xù)穩(wěn)定表達，并可調(diào)控；4)AAV的宿主范圍很廣，包括分裂期和非分裂期的多種細胞：5)具有較好的熱穩(wěn)定性和抗酸堿性(pH 3.0～9.0)以及抗有機溶劑處理的特點，便于儲存，AAV基因組具有兩個開放的閱讀框架(ORF)，兩端各有1個145bp的末端反向重復(fù)序列(ITR)，ORF編碼非結(jié)構(gòu)性蛋白(Rep)和衣殼蛋白(Cap)，Rep蛋白在病毒的整合、復(fù)制、包裝中起重要作用，Cap蛋白是包裝成完整病毒所需的衣殼蛋白，因此，重組AAV載體(rAAV)是用外源目的基因單位(包括啟動子)替換AAV兩端ITR系列之間的基因系列(Rep和Cap基因)而產(chǎn)生，傳統(tǒng)制備rAAV載體包裝系統(tǒng)主要包括：重組載體、輔助質(zhì)粒(如Ad8)、輔助病毒(如Ad5)和宿主細胞，該方法的缺點是可導(dǎo)致腺病毒蛋白的污染，容易導(dǎo)致機體對載體的免疫反應(yīng)，各項研究通過改造AAV載體基因結(jié)構(gòu)、包裝細胞以及改進病毒顆粒的純化方法，可達到更高的病毒產(chǎn)率，rAAV載體經(jīng)過不斷改進和完善，已經(jīng)克服了容量小和解決無腺病毒輔助的大量包裝和復(fù)制問題：近年來又由于包裝細胞系的誕生，加上其固有的優(yōu)點，因而成為治療遺傳性疾病和慢性疾病最有前途的基因載體。

本實驗在培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中直接觀察到GFP的表達，提示病毒顆粒成功轉(zhuǎn)染細胞，pAAV-hrGFP-uPA能高效在腎小管細胞中表達，大約有60％～70％的腎小管細胞可感染此病毒顆粒，并整合到腎小管細胞中穩(wěn)定、高效表達，F(xiàn)lag蛋白的表達反應(yīng)了uPA蛋白表達的情況，GFP可在450-490nm的藍光激發(fā)下發(fā)出綠光，GFP的多肽中含有絲氨酸-脫氫酪氨酸-甘氨酸的環(huán)化結(jié)構(gòu)，使GFP具有強烈的熒光性，GFP作為一種基因表達的標(biāo)記物優(yōu)于傳統(tǒng)的報告基因，如LacZ、CAT、luc等編碼酶蛋白的基因，GFP優(yōu)點在于：1)GFP基因序列短、分子質(zhì)量小、融合后不影響目的基因的表達和靶蛋白生理功能，不干擾細胞的生長和功能，且對細胞無毒性作用，因而能在活細胞狀態(tài)下檢測基因表達；2)觀察更為方便，GFP是一種能在活細胞內(nèi)直接觀測、無需底物和內(nèi)對照的報告基因，將GFP基因轉(zhuǎn)染至真核細胞中表達后，可以方便地通過觀察活細胞中GFP融合蛋白的綠色熒光分布，分析未知基因表達蛋白在細胞中的分布和定位，因此GFP作為一種極具潛力的標(biāo)記物為研究基因功能及表達調(diào)控提供了極大的便利。

本實驗成功構(gòu)建了高效轉(zhuǎn)染多種宿主細胞的重組載體質(zhì)粒，為今后建立AAV-μPA基因治療的體內(nèi)腎纖維化模型奠定了良好的基礎(chǔ)，并且為無特殊標(biāo)記細胞移植治療提供了一種穩(wěn)定、有效的標(biāo)記方法，可以追蹤該細胞在體內(nèi)的分布或分化情況。