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1光密度定量的意義

醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)研究隨著科技的飛速發(fā)展,常用研究方法從細(xì)胞水平(光鏡組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)、電鏡透射掃描、免疫電鏡、流式細(xì)胞技術(shù))發(fā)展到蛋白水平(免疫組化、WesternBlotting)和基因水平(原位分子雜交、PCR及測序等)。免疫組化染色方法自1986年由兩名中國人發(fā)現(xiàn)S-P法以后,以其便于交流,有配套的即用型抗體試劑盒和顯色試劑盒直接滴加,染色時間短,靈敏性高,特異性強(qiáng)等明顯優(yōu)點(diǎn),被實驗醫(yī)學(xué)研究者廣泛采用。對于用免疫組化或原位雜交法染色的組織切片、細(xì)胞涂片,測定其特異性染色陽性區(qū)的光密度值、積分光密度值,相對定量的表示某種特定蛋白的含量,受體配體、抗原抗體的結(jié)合程度或酶顯色的情況。傳統(tǒng)判定染色結(jié)果的方法是在顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù),小于25%為弱陽性(+),25-50%為陽性(++),50-75%為強(qiáng)陽性(+++),大于75%為特強(qiáng)陽性(++++)?，F(xiàn)今應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測量染色陽性區(qū)的光密度參數(shù)(光密度、積分光密度),用數(shù)值定量的表示染色程度,有利于進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析,使結(jié)論更客觀更準(zhǔn)確。

2•1光密度(OpticalDensity)

根據(jù)Beer-Lamb吸收定理:一束單色平行光透過某種分布均勻的物質(zhì),光能被吸收,光能吸收量等于物質(zhì)的克分子量;物質(zhì)對光吸收的多少與照射光強(qiáng)度無關(guān)。光密度OD=Lg(1/T),平均透射率T=Greyi/Greyo×100%,Greyi為被測對像的平均灰度值(出射光強(qiáng)度,即透射光強(qiáng)度),Greyo為空白區(qū)域的平均灰度值(入射光強(qiáng)度,即本底光或光源的強(qiáng)度)。設(shè)定圖像分析系統(tǒng)光密度值和灰度值之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系稱光密度定標(biāo)。例如八比特(Bit)圖像為256級灰度:空白本底的OD空=LgGreyo/Greyi=Lg200/200=Lg1=0,全黑圖像的OD黑=LgGreyo/Greyi=Lg255/0→∞,理論上光密度值是(0<OD<∞)大于零小于無窮大的。實際上,假設(shè)出射光強(qiáng)度比入射光強(qiáng)度低100倍OD=Lg255/2.55=Lg100=2,出射光強(qiáng)度比入射光強(qiáng)度低10倍OD=Lg255/25.5=lg10=1,所以多數(shù)情況下光密度值為0<OD<1的數(shù)。定標(biāo)時設(shè)空白本底的光密度值OD=0,全黑圖像的光密度值OD=2,計算機(jī)自動得出OD-Grey曲線,并按此關(guān)系進(jìn)行灰度值和光密度值的轉(zhuǎn)換,計算出光密度值。從另一個角度看,平均透射率反映物體的透光性,亮意味著透光多,暗意味著透光少,光被吸收的多。T=10-kcd式中k為克分子吸收系數(shù),c為物質(zhì)的濃度,d為物質(zhì)的厚度(光程),光密度值OD=lg1/T=10kcd=kcd,可見光密度OD與物質(zhì)的濃度C成正比,光密度值的大小代表染色的深淺,反映物質(zhì)的相對濃度。

2.2積分光密度(IntegratedOpticalDensity)

積分光密IOD=(GV.LgMaxGVGV)為構(gòu)成被測對像的所有像素點(diǎn)的光密度的和。從另一個角度看,物質(zhì)的濃度C=M/V(質(zhì)量/體積)=M/Area×d光密度OD=kcd=K×M/(Area×d)×d=KM/AreaBeer-Lamb吸收定律要求物質(zhì)分布是均勻的,但實際生物樣品中的被測對像分布大都是不均勻的,圖像分析軟件測量時將若干個像素定義成一個像元,像元很小,設(shè)面積為a,每個像元內(nèi)物質(zhì)分布被認(rèn)為是均勻的。所以可認(rèn)為物體整合光密度IOD=a×(OD1+OD2+OD3…ODn)=a×n×OD=Area×OD=Area×KM/Area=KM。由此可知,積分光密度與物質(zhì)的質(zhì)量M成正比,積分光密度值的大小代表被染色物質(zhì)的多少,反映物質(zhì)的相對含量。光密度定量為相對定量,需要對照組,測量時的系統(tǒng)誤差對實驗組和對照組而言是同樣的,不會對結(jié)果有影響。需要注意的是應(yīng)選擇無疵點(diǎn)、無污漬的薄厚均勻的載玻片和蓋玻片,使用相同的封片劑。嚴(yán)格控制切片的厚度和染色條件的一致,測量光密度的樣品最好不要復(fù)染,盡量減少樣品染色的不一致或不均勻。定購染色試劑時最好同時購買陽性對照片,以便做圖像分析時用它準(zhǔn)確設(shè)定陽性閾值(Thresh-oldRang)。圖像獲取時光的條件要求嚴(yán)格一致,盡量用40倍的物鏡采集圖像,以便測量時精確分割圖像。