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【摘要】目的探討胡椒醇提液外用對兔耳輕度凍傷的治療效果。方法用－15℃左右低溫液復(fù)制兔耳輕度凍傷模型，凍傷后48h開始在兔凍耳涂抹胡椒70%乙醇提取液治療，2d后測定血清中SOD活性、MDA和TNF-α含量，4d后評價凍耳外觀正常與否及變形程度，制作凍耳組織病理切片，顯微鏡下觀察凍耳組織病理變化，同時測定血清與凍耳組織中SOD活性、MDA和TNF-α含量。結(jié)果用胡椒70%乙醇提取液治療2d后血清中SOD活性顯著增加，MDA量顯著降低，TNF-α量無明顯變化。治療4d后血清中SOD活性、MDA和TNF-α含量均無明顯差異，但凍耳組織中SOD活性與TNF-α水平顯著提高，MDA量顯著降低。另外凍耳外觀評價與組織病理檢查顯示凍耳組織壞死范圍減少，修復(fù)速度明顯提高。結(jié)論胡椒70%乙醇提取液局部外用對輕度凍傷有治療作用。

【關(guān)鍵詞】胡椒；凍傷；治療作用

胡椒是傳統(tǒng)中藥，為胡椒科植物胡椒PipernigrumL.的干燥近成熟或成熟果實(shí)。民間有用胡椒粉煮水或泡酒擦洗患處治療凍瘡的用法，并且療效確切。筆者所在研究組欲對胡椒抗凍瘡作用進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過查閱中外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（包括中國CNKI和VIP科技論文全文數(shù)據(jù)庫，美國Gale、Pubmed和HighWirePress數(shù)據(jù)庫），未能檢索到動物凍瘡實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膱蟮?。研究組曾根據(jù)凍瘡病因病機(jī)試制動物凍瘡模型，但均未成功。臨床上認(rèn)為Ⅰ，Ⅱ度（輕度）凍傷和凍瘡的臨床表現(xiàn)及治療基本一致，因此在沒有凍瘡動物模型可用的情況下，藥物對輕度凍傷的療效仍可作為對凍瘡治療作用的參考，有積極意義。

兔耳凍傷后由于局部細(xì)胞發(fā)生變性或壞死，兔耳形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)會有所改變，變性的細(xì)胞如及時恢復(fù)供血供氧，清除損傷因子，能轉(zhuǎn)為正常，反之，如持續(xù)缺血缺氧，則損傷可進(jìn)一步加重，直至壞死。壞死表皮可由周圍正常表皮再生修復(fù)，真皮壞死則只能通過肉芽組織填補(bǔ)修復(fù)，修復(fù)后兔耳形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)不能恢復(fù)正常；另外，因凍傷后機(jī)體氧化抗氧化系統(tǒng)平衡被打破，丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）這對反映組織氧化損傷程度與抗氧化能力的生化指標(biāo)會發(fā)生相應(yīng)變化；近年來腫瘤壞死因子α（TNF-α）在創(chuàng)傷和創(chuàng)傷修復(fù)中的作用越來越受人們關(guān)注。現(xiàn)已證實(shí)，在創(chuàng)傷修復(fù)早期TNF-α能誘導(dǎo)白細(xì)胞脫顆粒，增強(qiáng)其吞噬能力，加速肉芽組織及肉芽組織內(nèi)新生血管形成［1～3］。在修復(fù)中、后期高濃度TNFα能抑制成纖維細(xì)胞膠原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄,同時可以引起膠原酶基因轉(zhuǎn)錄的顯著增加,因而TNFα在組織的重塑中具有重要意義，可減少瘢痕組織形成，提高修復(fù)質(zhì)量［4，5］。也就是說，在創(chuàng)傷修復(fù)早期適當(dāng)濃度的TNFα能加速創(chuàng)面修復(fù)，中、后期高濃度TNFα能提高修復(fù)質(zhì)量［6］。該文通過觀察凍傷兔耳治療后外觀形態(tài)與組織病理改變情況，測定血清和凍耳組織中MDA、SOD、TNF-α含量綜合評價胡椒局部外用對兔耳輕度凍傷的治療作用，進(jìn)而研究胡椒抗凍瘡的效果。

1儀器與材料

1.1儀器

2010型酶標(biāo)儀（奧地利AnthosLabtecInstruments公司）；756MC紫外可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2試藥

取白胡椒（購自東駿大藥房），用70%乙醇冷浸3次（48，24，24h），合并浸提液，靜置分層，過濾，濾液用70%乙醇配制為高、中兩種濃度供試液，每毫升分別相當(dāng)于生藥3.30，1.65g；MDA和SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為：20071228，20071227）；TNFα試劑盒（美國AdlitteramDiagnosticLaboratories公司，批號：RT110371）。

1.3動物

日本大耳白兔40只，體質(zhì)量2.0～3.0kg，雌雄兼用，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK（滇）2005-0008。

2方法

2.1凍傷模型復(fù)制與給藥

［7］取家兔分為4組，即正常、溶劑和高、中濃度胡椒供試液組，每組10只，于實(shí)驗(yàn)室正常單籠飼養(yǎng)6d后將右耳耳尖至耳根7cm范圍剪毛，隔日將右耳剪毛區(qū)域浸入（-15±1）℃冷凍液（6份碎冰+1份氯化鈉）中，正常組除外。待兔耳變白變硬后再凍30s，取出，空氣中停留20s后以35℃溫水復(fù)溫20s，取出兔耳，擦干水分，凍傷模型復(fù)制完畢。凍傷后48h開始在凍傷兔耳剪毛區(qū)域分別涂藥，1ml/次，3次/d，涂藥4d后，治療結(jié)束。

2.2凍耳治療后外觀評價

凍耳皺縮變形的范圍大小反映了組織細(xì)胞壞死和瘢痕修復(fù)的范圍大小，是藥物對凍傷所致組織細(xì)胞變性的保護(hù)和促恢復(fù)作用的直接體現(xiàn)。此處將凍耳治療后外觀評價由好到差分為4級：正常（凍耳治療后顏色、外觀、觸感和厚度與正常兔耳完全一樣）、輕度變形(凍耳耳尖至耳根方向2cm區(qū)域內(nèi)皺縮變形)、中度變形(耳尖至耳根方向4cm區(qū)域內(nèi)皺縮變形)、重度變形(耳尖至耳根方向皺縮變形范圍超過4cm)。

2.3凍耳病理檢查

治療4d后，家兔左耳耳緣靜脈空氣栓塞致死，立即沿浸凍線剪下凍耳浸凍部分，由耳尖垂直于浸凍線方向?qū)龆霾糠旨舫蓪ΨQ的兩半，一半以4%甲醛溶液固定（另一半留做SOD、MDA和TNF-α測定），分別在耳尖向耳根方向1，2，3cm處取材，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，以正常兔耳為對照，顯微鏡下觀察凍耳組織病理變化。

2.4SOD、MDA和TNFα測定

［8］涂藥2d后，左耳中央動脈取血約4ml。涂藥4d后心臟取血約4ml，取“2.3”項下病理檢查剪下的另一半凍耳，剪取耳尖部，置事先盛有預(yù)冷生理鹽水的小燒杯中，涮洗幾下，取出，濾紙吸干水分，稱1g耳尖部組織，用10ml預(yù)冷pH7.4的0.01mol/L的PBS制備組織勻漿。血液與組織勻漿4℃分別以4000r/min和2000r/min離心10min，取血清和耳組織勻漿上清，按試劑盒中操作方法測定SOD總活力、MDA與TNF-α含量。

2.5統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計，其中凍耳治療后外觀評價用秩和檢驗(yàn)Mann-WhitneyU法，SOD、MDA和TNFα測定結(jié)果用方差分析LSD法。

3結(jié)果

3.1凍耳外觀變化

復(fù)溫后兔耳開始發(fā)紅發(fā)熱，隨后變紫、腫脹、下垂。腫脹逐漸加劇，12h后部分兔耳出現(xiàn)漿液性水泡，泡液無色或淡黃色，隨后水泡增大或新水泡形成。24h后腫脹程度不再增加，水泡不再增大或無新水泡形成。48h后部分兔耳凍區(qū)有黃色液體滲出。治療后凍耳腫脹逐漸消退，治療結(jié)束（治療4d）后各組凍耳均已不見明顯腫脹。高、中濃度胡椒供試液組治療結(jié)束后分別有4只和2只家兔凍耳外觀同正常兔耳（凍耳表皮光滑平整，未見壞死，凍耳顏色、觸感、彈性和厚度均與未凍傷的左耳完全一樣），其它家兔凍耳均有不同程度的皺縮變形和硬化、表面凹凸不平、表皮壞死，個別家兔凍耳表面有硬痂產(chǎn)生。高濃度胡椒供試液組治療結(jié)束后凍耳外觀評價明顯好于溶劑組（P<0.01）。結(jié)果見表1。表1胡椒對輕度凍傷兔耳形態(tài)改變的影響（略）

3.2凍耳治療后病理變化

治療后高、中濃度胡椒供試液組兔凍耳表皮均修復(fù)完整，真皮水腫及炎癥均明顯消退，部分兔凍耳真皮已無水腫和炎癥表現(xiàn)（高濃度5只，低濃度3只），近半數(shù)兔凍耳毛囊和皮脂腺數(shù)量正常（高濃度6只，中濃度4只），未見毛囊和皮脂腺壞死，凍耳總體恢復(fù)程度和速度明顯好于溶劑組，見圖1。

3.3SOD測定結(jié)果

治療2d后，高、中濃度胡椒供試液組血清中SOD活力均顯著高于溶劑組（P<0.01）。治療4d后各組血清中SOD活力已無明顯差異，但凍耳組織中SOD活力有明顯不同，高、中濃度胡椒供試液組顯著高于溶劑組（高濃度P<0.01，中濃度P<0.05）。結(jié)果見表2。表2胡椒對兔耳輕度凍傷后血清及凍耳組織中SOD活力的影響（略）

3.4MDA測定結(jié)果

治療2d后，高、中濃度胡椒供試液組血清中MDA量顯著低于溶劑組（P<0.01）。治療4d后各組血清中MDA量均一定程度下降，與正常組相比已無明顯差異，但此時凍耳組織中MDA量有差異，高、中濃度胡椒供試液組顯著低于溶劑組（高濃度P<0.01，中濃度P<0.05）。結(jié)果見表3。表3胡椒對兔耳輕度凍傷后血清及凍耳組織中MDA含量的影響（略）

3.5TNF-α測定結(jié)果

治療2d和4d后，高、中濃度胡椒供試液組血清中TNF-α量與溶劑組相比均無明顯差異，但治療4d后凍耳組織中TNF-α量顯著高于溶劑組（P<0.01）。結(jié)果見表4。表4胡椒對兔耳輕度凍傷后血清及凍耳組織中TNF-α含量的影響（略）

4討論

兔耳凍傷后形態(tài)改變的范圍實(shí)際上反映了凍耳存活的組織細(xì)胞面積和存活量。所以，治療結(jié)束后，通過兔凍耳外觀正常與否及形態(tài)異常范圍可評價藥物抗凍傷的療效，藥物如能減少耳凍傷后細(xì)胞壞死的數(shù)量和范圍，則凍耳形態(tài)改變區(qū)域就小。此次研究結(jié)果顯示，高濃度胡椒供試液能顯著降低兔耳輕度凍傷后形態(tài)改變程度（P<0.01）,并且治療結(jié)束后4/10凍耳形態(tài)與正常兔耳完全一致。

凍傷4d（治療2d）后兔血循環(huán)中SOD活力還明顯低于正常，相應(yīng)的脂質(zhì)過氧化物MDA含量明顯高于正常，但胡椒供試液能顯著增強(qiáng)血液中SOD活力，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生。凍傷6d（治療4d）后血循環(huán)中SOD活力和MDA水平基本恢復(fù)正常，但凍耳組織中SOD活力明顯低于正常，另外MDA量也明顯高于正常，更有意義的是胡椒供試液能顯著增加凍耳組織中SOD活力并降低MDA水平。由此說明，兔耳局部輕度（主要是Ⅱ度）凍傷后不僅能打破受凍局部組織氧化抗氧化系統(tǒng)的平衡，并且因此可使全身血循環(huán)中氧化抗氧化系統(tǒng)受累，最終導(dǎo)致失衡。氧化抗氧化系統(tǒng)失衡的順序?yàn)榫植績鰝M織到全身血循環(huán)，而恢復(fù)的順序則正好相反。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明，凍傷局部應(yīng)用胡椒70%乙醇提取液能有效增加機(jī)體抗氧化能力，抑制受凍組織氧化損傷。

兔凍耳局部胡椒供試液治療2d和4d后血液中TNF-α水平與溶劑組相比均無明顯差別，值得關(guān)注的是，治療4d（凍傷6d）后凍耳組織中TNF-α含量顯著高于溶劑組。前面已經(jīng)述及在修復(fù)中、后期高濃度的TNF-α能促進(jìn)組織重塑，提高修復(fù)質(zhì)量，這與凍耳治療后外觀評價、組織病理及MDA與SOD活力測定結(jié)果相吻合。

兔足輕、重度凍傷后72h內(nèi)SOD活性和MDA量的變化［9］、大鼠重度凍傷后72h內(nèi)SOD活性、MDA和TNF-α含量的變化［10］國內(nèi)已見報道，但凍傷后更長時間的上述指標(biāo)的定量及變化還沒有文獻(xiàn)，加之凍傷后生化指標(biāo)變化的研究報道數(shù)量很有限，所以藥物抗凍傷的藥效研究都未就凍傷后這些指標(biāo)的變化進(jìn)行測定。此次胡椒對兔耳輕度凍傷的作用研究中SOD活性、MDA和TNF-α含量變化測定結(jié)果對藥物抗輕度凍傷和凍瘡藥效評價有一定參考價值。超級秘書網(wǎng)：

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