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本文作者：宋霖蔡春芳葉元土王永玲劉猛孔麗作者單位：蘇州大學

材料與方法

1試驗飼料

試驗所用魚粉(FM)購自通威股份有限公司，為俄羅斯進口魚粉(粗蛋白64.5%、粗灰分14%、粗脂肪5.6%、組胺334mg/kg);魚油購自浙江金大地飼料有限公司，豆粕(粗蛋白43.5%、粗纖維5.1%)、花生粕(粗蛋白44.7%、粗纖維5.9%)、菜籽粕(粗蛋白38.6%、粗纖維18%)和棉籽粕(粗蛋白47%、粗纖維10.2%)購自東海糧油工業(yè)張家港有限公司。對照組魚粉含量為60%。試驗飼料中豆粕、花生粕、棉粕和菜粕的添加水平分別為25%和50%(表1)。本試驗未采用傳統(tǒng)營養(yǎng)學研究使用的等氮等能配方，一是因為飼料原料中的抗營養(yǎng)因子［9-11］會影響到腸道形態(tài)，設計等氮等能飼料必然要加入其它原料，可能會干擾結果的可靠性。二是因為實驗目的是評價原料安全性，不需要飼料等氮等能。三是大量關于腸道健康研究的文獻也都采用了非等氮等能的飼料［12-14］。各飼料原料粉碎至全部通過60目篩，按配方比例混合均勻后制成直徑2mm的硬顆粒飼料，通風場所內自然風干，于－20℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩ｏ暳吓浞浇M成及營養(yǎng)水平見表1。

2試驗魚及分組

試驗用黃顙魚購于蘇州市水產養(yǎng)殖總場澄湖場，為當年池塘養(yǎng)殖魚種。運回實驗室后用對照組飼料馴養(yǎng)，適應實驗室環(huán)境后(1周)，選取大小均勻、體格健壯，體質量為(295±0.35)g的魚種，稱重后隨機分配到45個玻璃鋼水族箱中(110cm×70cm×65cm)，每缸15尾。各試驗組按完全隨機化配置法分布以避免位置的差異造成的試驗誤差。

3飼養(yǎng)管理

所有水族箱在同一半開放式可控溫循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，以充分曝氣的自來水為水源，每天換水為總水量的1/3。養(yǎng)殖水經過濾、沉淀后流回蓄水池，經過增氧、控溫后由水泵抽回各水族箱。飼養(yǎng)期從2010年4月7日至2010年6月2日，為期8周。養(yǎng)殖期間光周期12h∶12h，水面照度(2500±300)Lx，水溫(25±2)℃，DO＞5.0mg/L，pH7.5±0.2，NH4+-N(0.25±0.05)mg/L，NO2－N(0.04±0.01)mg/L，硫化物＜0.05mg/L。每種飼料投喂5缸黃顙魚，每日投飼3次(8∶00，13∶00，18∶00)，飽食投喂。

4采樣與分析方法

采樣均在攝食后半小時進行，迅速將魚撈起，使用MS-222麻醉，統(tǒng)計各組試驗魚的尾數(shù)，計算成活率;稱量每缸魚的總體質量，計算蛋白質效率。測定體長，解剖取腸道并測定腸長，計算腸長指數(shù)。成活率(SR)=(Nt/N0)×100%蛋白質效率(PER)=(Wt－W0)/CP×100%腸長指數(shù)=GL/BL上式中，Nt表示試驗末魚尾數(shù)，N0表示試驗初魚尾數(shù)，Wt表示試驗末每缸魚體總重，W0表示試驗初每缸魚體總重，CP表示每缸飼料蛋白攝入量，GL表示腸長，BL表示體長。每個處理隨機取10尾魚，分離出腸道，剔除表面脂肪組織，在腸道第一個回折后1cm處剪取中腸1cm左右大小的組織塊(圖1)，迅速固定于Bouin’s液中。試驗取中腸是因為對黃顙魚的前期研究發(fā)現(xiàn)，黃顙魚中腸對于飼料組分比較敏感。按常規(guī)組織切片制備程序，進行水流沖洗、梯度乙醇脫水，二甲苯中透明以及石蠟包埋。然后使用YD-202型切片機橫向切片，厚度為5μm，展片后采用H-E染色，中性樹膠封片。使用OLYMPUSDP72光學顯微鏡觀察并拍片，腸道形態(tài)的評價參ST:胃;FG:前腸;MG:中腸;HG:后腸;SL:取樣部位數(shù)包括:消化管橫切面上的黏膜皺褶個數(shù);腸道黏膜褶皺的高度與寬度;褶皺中固有層的寬度;黏膜下層厚度;嗜堿粒細胞向固有層和黏膜下層的滲透程度;核上空泡的存在與多少;肌層厚度。

5數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗結果采用“平均值±標準差”表示，所有統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件，數(shù)據(jù)經方差分析后用Turkey’s多重比較，以分析組間的差異顯著性程度，顯著水平為0.05。

結果與分析

1黃顙魚生長及四種植物蛋白對其影響

整個試驗過程中無異常情況發(fā)生，黃顙魚增重一倍左右，各組成活率均為100%。對照組的蛋白質效率高于所有實驗組，除豆粕組外其余試驗組蛋白質效率隨著飼料中植物蛋白水平提高而下降。豆粕組和棉粕組與對照組無顯著差異(P＞0.05)，50%花生粕組和50%菜籽粕組的蛋白質效率均顯著小于對照組(P＜0.05)。

2黃顙魚腸道形態(tài)及四種植物蛋白對其影響

飼喂不同含量的四種植物蛋白8周黃顙魚中腸組織形態(tài)發(fā)生了一定程度的改變(表3)。各試驗組腸長指數(shù)相較對照組均有所增大，但無顯著性差異(P＞0.05)。觀察黃顙魚中腸的組織切片發(fā)現(xiàn):腸道組織結構可分為黏膜層(mucosa)、黏膜下層(submucosa)、肌層(muscularis)和漿膜層(serosa)，攝食魚粉飼料的對照組黃顙魚中腸黏膜層向腸腔內折疊形成豐富的黏膜褶，黏膜褶形狀完整，有的筆直伸入腸腔內，有的彎曲伸展，有分支，排列密集。腸黏膜由單層柱狀上皮細胞組成，上皮細胞排列緊密而整齊，核圓形位于細胞中部。黏膜褶高度及寬度均大于各植物蛋白組，肌層厚而致密(圖版Ⅰ－1，2)。25%豆粕組黏膜褶數(shù)目較對照組有所減小，是試驗組中密度最大的(表3)。黏膜褶略有缺刻，頂端與食糜接觸的部分有損傷，黏膜褶中單層柱狀細胞破損，細胞核擠在一起。固有層中略有淋巴細胞浸潤，空泡數(shù)目略有增多(圖版Ⅰ－3)。50%豆粕組黃顙魚黏膜褶之間排列變稀疏，根部的黏膜上皮細胞即被破壞，有的黏膜褶整個受損，上皮細胞核上移且排列紊亂，邊緣缺刻較多(圖版Ⅰ－4)。黏膜褶高度顯著小于對照組，腸壁厚度亦顯著變薄且肌層稀疏(P＜0.05;表3)。25%花生粕組黏膜褶較密集，黏膜褶高度較對照組降低了24.4%(表3)。黏膜褶頂部有破損且明顯變細，腸黏膜上皮細胞之間界限不清晰，空泡較多，且大小不一。黏膜下層有所增厚，但未見淋巴細胞侵入(圖版Ⅰ－5，6)。添加水平為50%的花生粕組黏膜褶數(shù)目及寬度進一步減少。黏膜高度顯著低于對照組(P＜0.05;表3)。黏膜褶呈倒伏狀，邊緣缺刻嚴重，空泡變大，有的黏膜褶的上皮細胞均被破壞，核排列紊亂。固有層仍較寬(圖版Ⅰ－7)。25%菜粕組黏膜褶外側遍布空泡，有的黏膜褶中上皮細胞核明顯上移，淋巴細胞侵入黏膜褶中，大片上皮細胞破損(圖版Ⅰ－8，9)。上述結構在50%菜粕組中同樣出現(xiàn)(圖版Ⅰ－10)，且各項腸道生長指標較25%水平進一步減小。棉粕組黃顙魚的黏膜高度與肌層厚度均與對照組有顯著性差異(P＜0.05;表3)。25%水平時，淋巴細胞侵入固有層和黏膜下層中，數(shù)量上較其余試驗組顯著增多，空泡密集且大小不一(圖版Ⅰ－11)。50%水平時，黏膜褶最少，但沒有大量淋巴細胞浸潤情況，空泡較大，上皮細胞邊界不清(圖版Ⅰ－12)。

討論

本試驗日糧中分別添加了豆粕、菜粕、花生粕和棉粕，由于與魚粉相比在蛋白質含量、能量含量、氨基酸組成、消化吸收率、抗營養(yǎng)因子等方面均處于劣勢［15］，引起生長不良是在預期之內的。豆粕是優(yōu)質的植物蛋白源，然而其中含有植酸、皂苷和血細胞凝集素等抗營養(yǎng)因子［11，16］。Krogdahl等［17］指出多數(shù)植物凝集素可以和小腸壁上皮細胞表面特異受體(多糖)結合，使絨毛產生病變和異常，干擾消化吸收過程。Iwashita等［18］報道大豆皂苷能與植物凝集素結合而引起虹鱒后腸非正常的組織學反應。大西洋鮭魚在豆粕添加量10%以上就產生嚴重的腸炎反應［19］，但另一方面Ostaszewska等［20］發(fā)現(xiàn)在細鱗鯧日糧中添加44%的豆粕，其前腸組織形態(tài)與對照組相似，Catacutan等［21］也報道銀紋笛鯛在豆粕添加量達到48%時腸道結構沒有表現(xiàn)任何不正常。從本試驗結果看，黃顙魚對豆粕的耐受性比大西洋鮭魚高。Uran等［22］觀察到豆粕誘導的腸炎在鯉魚飼養(yǎng)4～5周時開始修復，本試驗中腸道樣品采集于飼養(yǎng)8周，結果仍觀察到病變癥狀，提示黃顙魚腸道對豆粕的適應能力低于鯉魚。目前對于日糧中添加花生粕而影響動物健康的原因一般認為是花生粕容易感染黃曲霉，黃曲霉產生的黃曲霉毒素(Aflatoxin)會抑制水產動物生長并對其生理機能造成一定的影響［23］。魚類中毒癥狀表現(xiàn)為生長緩慢、肝臟和其它器官受損、死亡率增加［24］。從本試驗結果看，黃顙魚花生粕適宜添加量在25%以下。本試驗中菜粕添加量為25%時即引起中腸嚴重的病理反應，添加量達到50%時對于腸道生長更加不利。菜籽中含有硫葡萄糖苷，其水解產物有異硫氰酸酯、硫氰酸酯等。異硫氰酸酯有辛辣味，長期或大量飼喂會引起腸炎［25-26］。因此菜粕的添加量不宜超過25%。棉粕中游離棉酚的毒性限制了其在水產飼料中的應用，游離棉酚的活性醛基和羥基與蛋白質結合，會抑制魚的生長［27-28］、降低血紅蛋白數(shù)［29］。而異育銀鯽中棉粕的添加量在20%，40%，56%時對生理和腸道健康均未造成顯著性影響［30］。對虹鱒三年的養(yǎng)殖試驗也發(fā)現(xiàn)日糧可以完全以棉粕替代而對其生長不會造成損害［31］。本試驗發(fā)現(xiàn)25%棉粕組腸道黏膜下層有淋巴細胞浸潤，50%棉粕組淋巴細胞浸潤沒有增強，且棉粕組蛋白質效率與對照組沒有顯著差異，說明黃顙魚對棉粕有一定的適應性及耐受力?？傮w來看，飼料中添加高劑量的植物蛋白黃顙魚腸道形態(tài)都表現(xiàn)出了一定的變化。魚類腸道形態(tài)因飼料組分不同而改變這種現(xiàn)象在大西洋鮭［19］、鯉魚［22］、歐洲真鱸［32］都有報道，本實驗中黃顙魚腸道形態(tài)的變化特征與上述報道基本一致。但魚類對植物蛋白中致敏因子的炎癥反應因魚而異。Refstie等［33］研究大西洋鱈魚時，不添加豆粕和添加25%的試驗組在腸道區(qū)域形態(tài)學上沒有發(fā)現(xiàn)明顯不同。斑點叉尾鮰［34］和埃及鰨［35］也沒有因為攝食含豆粕的飼料而出現(xiàn)腸道形態(tài)學變化。顯然，黃顙魚屬于對這些植物蛋白中的致敏因子比較敏感的種類。因此，在飼料原料選用時應謹慎。本試驗觀察到腸道肌層厚度組間差異顯著。這在文獻資料中很少報道。我們推測，植物蛋白中所含的大量不消化成分，例如非淀粉多糖等，導致腸道充盈度提高，腸腔擴張，從而可見肌層變薄。由此我們認為今后進行相關研究時不僅應在攝食后相同時刻采樣，且不需將腸道剖開，這樣就能判斷肌層厚度和絨毛高度與腸道充盈度是否相關。根據(jù)本試驗研究，在黃顙魚飼料植物蛋白選用時，豆粕和棉粕要優(yōu)于花生粕和菜粕，花生粕、棉粕、菜粕適宜添加量在25%以下，豆粕在50%以下，但具體安全添加水平還有待研究。