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本文作者：向妮1,2段燦星1肖炎農(nóng)2王曉鳴1朱振東1作者單位：1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院

0引言

【研究意義】豌豆是僅次于普通菜豆的第二大食用豆類作物，作為糧食、蔬菜或飼料來源廣泛種植于世界各地[1-2]。在豌豆生產(chǎn)中病蟲害的發(fā)生是影響豌豆產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。目前已報(bào)道有數(shù)十種病原菌可以侵染豌豆，其中由茄鐮孢豌豆專化型引起的鐮孢根腐病是最重要的病害之一[3]。茄鐮孢豌豆專化型是一種頑固性的土傳病原菌，豌豆種子萌發(fā)后就開始侵染子葉附著區(qū)、上胚軸、下胚軸和較上部位的主根。隨后，侵染向上擴(kuò)展到地面，向下擴(kuò)展到根系，產(chǎn)生紅褐色到黑色條紋病斑，隨著時(shí)間的推移病斑合并，根部維管束變紅褐色，導(dǎo)致植株矮化、發(fā)黃和基部葉片壞死[3]。鐮孢菌根腐病一般導(dǎo)致30%—57%的豌豆產(chǎn)量損失，嚴(yán)重發(fā)生的地塊減產(chǎn)可達(dá)60%以上[4-6]。豌豆在中國有2000多年的種植歷史，全國范圍均有種植，其中西北和西南地區(qū)是干籽粒豌豆主要產(chǎn)區(qū)，豌豆是這些地區(qū)的主要栽培作物之一[7-8]。

在中國，由鐮孢菌引起的豌豆根腐病最早記載于20世紀(jì)50年代[9]，目前該病已在全國范圍內(nèi)普遍發(fā)生，特別是在甘肅、寧夏豌豆主產(chǎn)區(qū)危害嚴(yán)重，導(dǎo)致豌豆栽培面積大幅度減少[10-14]。

【前人研究進(jìn)展】防治豌豆根腐病的有效途徑是利用抗病或耐病品種[10,15-17]?？共』蚰筒∑贩N的成功選育有賴于對病原菌群體結(jié)構(gòu)的了解。國外的大量研究表明，在農(nóng)田系統(tǒng)中豌豆鐮孢根腐病菌茄鐮孢豌豆?；痛嬖跇O大的自然變異，并形成了復(fù)雜的致病基因型[18]。茄鐮孢豌豆?；蛯ν愣沟膶；虏⌒杂赏愣怪虏』颍≒EP）所控制。在茄鐮孢豌豆專化型的一個超數(shù)染色體上存在一個豌豆致病基因簇，迄今在這個基因簇上鑒定了6個豌豆致病基因（PDA、PEP1、PEP2、PEP3、PEP4和PEP5）[19-21]。在這6個豌豆致病基因中，PDA基因家族編碼細(xì)胞色素P-450單加氧酶[19]，該酶能夠降解豌豆產(chǎn)生的植物保衛(wèi)素豌豆素（pisatin），降低其活性，因此又稱作豌豆素去甲基化酶（PDA）[22-26]。所有自然發(fā)生的不含PDA的NectriahaematococcaVI（F.solani）分離物一般對豌豆都不具有致病性。因此，PDA是茄鐮孢豌豆?；蛯ν愣怪虏⌒缘臎Q定基因[22,27]。幾個PEP的功能目前還不清楚，但是它們在基因簇上的存在可以提高病原菌分離物對豌豆的毒力水平[21,28]。最近，Etebu等[18]基于PEP基因簇基因的序列建立了檢測PDA、PEP1、PEP3和PEP5的特異性PCR標(biāo)記，用于快速檢測土壤中茄鐮孢豌豆?；图捌渲虏』虻亩鄻有运?，并建立了土壤中茄鐮孢豌豆?；头肿佣繖z測和病害流行預(yù)測的方法[4,29]。【本研究切入點(diǎn)】迄今，中國對豌豆根腐病研究很少，主要局限在病害的描述和病原菌分離鑒定，雖然在抗病品種的選育上取得一定進(jìn)展，但是抗病育種工作完全是在自然發(fā)病的壓力下進(jìn)行抗性選擇[10]。為了有效地開展抗病品種的選育，有必要對中國不同地區(qū)茄鐮孢豌豆?；头N群進(jìn)行深入了解。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究對中國10多個?。ㄊ校┩愣圭犳吒【M(jìn)行分離鑒定、致病力測定和致病基因檢測，以便了解病原菌毒力及致病基因的多樣性水平，為有效開展豌豆抗病育種提供理論支持。

1材料與方法

試驗(yàn)于2009年6月至2011年4月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所完成。

1.1試驗(yàn)材料

豌豆鐮孢根腐病植株及土壤樣品為2009—2010年分別從甘肅、河北、寧夏、云省、福建、內(nèi)蒙古、吉林、四川、安徽、青海和北京11個?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）豌豆生產(chǎn)田采集。豌豆品種“草原27”由青海大學(xué)提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌分離

植株病樣用常規(guī)組織分離法分離病原菌。取約5mm2的病組織，用2%的NaClO表面消毒2min，無菌水漂洗3次后，轉(zhuǎn)入酸化的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取菌落前緣菌絲至PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)。根據(jù)菌落特征和分生孢子的形態(tài)，參考Nelson等[30]方法初步進(jìn)行鐮孢菌分離物的鑒定。對疑似鐮孢菌分離物進(jìn)行單孢分離，獲得單孢分離物。

土壤樣品過篩后，取適量裝入直徑為10cm的塑料缽中，播種豌豆品種“草原27”，每缽5粒，蓋上適量土樣后，置于溫室培養(yǎng)，必要時(shí)輔以光照和澆水。植株發(fā)病后，采用上述組織分離方法分離病原菌，對疑似鐮孢菌分離物進(jìn)行單孢分離。

1.2.2豌豆鐮孢根腐病菌分子及形態(tài)學(xué)鑒定

將疑似鐮孢菌分離物在鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基平板上25℃培養(yǎng)5—7d，收集菌絲后用CTAB法提取基因組DNA[31]。用茄鐮孢種特異性引物（ITS1-F(F)/AFP346(R)：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′/5′-GGTATGTTCACAGGGTTGATG-3′）對分離物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[32]。反應(yīng)體系為20μL，包括2μL10×PCRbuffer（200mmol•L-1Tris-HCl，200mmol•L-1KCl，15mmol•L-1MgCl2），1μL10mmol•L-1dNTP，上、下游引物（2μmol•L-1）各2μL，Taq酶1.25U，模板DNA20ng，水補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，引物60℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，Gelred染色后成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增結(jié)果。將分子鑒定為茄鐮孢的分離物分別接種到PDA和CLA培養(yǎng)基上[33]，在25℃培養(yǎng)3—7d后觀察其小型分生孢子、大型分生孢子以及分生孢子梗的形態(tài)[34-36]。

1.2.3豌豆鐮孢根腐病菌致病力測定致病力測定

參照Temporini等[21]的方法進(jìn)行，并略作修改。將豌豆品種“草原27”播種于裝有適量滅菌砂的直徑為10cm塑料缽中，每缽5粒種子，溫度控制在25℃左右，必要時(shí)輔以光照和澆水。播種后12d幼苗用于接種。將鑒定為茄鐮孢豌豆?；偷姆蛛x物接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d后，用直徑為5mm的打孔器從菌落邊緣打取菌絲塊；用無菌注射器針頭在植株幼苗莖基部扎一傷口，將菌絲塊菌面朝下貼在傷口上。每個分離物接種5個植株，以接種PDA培養(yǎng)基的植株作為對照。接種后植株在25℃下保濕48h，然后轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)，接種6d后調(diào)查結(jié)果并記載病斑長度。致病力評價(jià)采用Temporini等[21]的標(biāo)準(zhǔn)，病斑長度＜6cm為弱致病力，6cm≤病斑長度≤8cm為中等致病力，病斑長度＞8cm為強(qiáng)致病力。

1.2.4豌豆鐮孢根腐病菌致病基因檢測

茄鐮孢豌豆?；偷姆蛛x物基因組DNA提取方法同上。利用PDA、PEP1、PEP3、PEP5等4個致病基因特異性檢測引物對分離物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息詳見表1[18]。PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2μL10×PCRbuffer（200mmol•L-1Tris-HCl，200mmol•L-1KCl，15mmol•L-1MgCl2），1μL10mmol•L-1dNTP，上、下游引物（2μmol•L-1）各2μL，Taq酶1.25U（TianGen－12.5U•μL-1），模板DNA20ng，水補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序如下：PDA和PEP3為95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PEP1和PEP5為95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃1min，72℃30s，5個循環(huán)之后，94℃變性30s，55℃退火45s，72℃30s，30個循環(huán)后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，Gelred染色后成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

2結(jié)果

2.1病原菌分離和鑒定

共分離得到203個疑似鐮孢菌分離物。根據(jù)大型分生孢子及菌落特征初步確定150個分離物疑似茄鐮孢。利用茄鐮孢特異性引物對這150個分離物進(jìn)行PCR鑒定，有120個分離物擴(kuò)增出約100bp的茄鐮孢特異性單一條帶，確定這些分離物為茄鐮孢。對120個茄鐮孢分離物進(jìn)一步進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。結(jié)果表明，有96個分離物與Jung等[36]描述的茄鐮孢豌豆?；头蛛x物的基本形態(tài)一致。在PDA培養(yǎng)基上這些分離物產(chǎn)生藍(lán)綠色到淺黃色分生孢子座；小型分生孢子稀少，單胞，卵圓形或橢圓形。在CLA培養(yǎng)基上會形成多分枝的分生孢子梗，大型分生孢子成簇聚集，大型分生孢子腳細(xì)胞圓鈍而厚，多為3個隔，寬度小于5μm，屬于B型[34]。在PDA培養(yǎng)基上有厚垣孢子產(chǎn)生，產(chǎn)生于菌絲的末端或側(cè)枝。

2.2致病力測定

96個茄鐮孢分離物接種豌豆幼苗莖稈進(jìn)行致病性測定。所有分離物對豌豆品種“草原27”都致病，在接種部位產(chǎn)生褐色病斑，并不同程度的向莖稈上下擴(kuò)增。結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子特征及致病性的結(jié)果，96個茄鐮孢分離物被鑒定為茄鐮孢豌豆專化型。根據(jù)病斑大小將96個分離物分為強(qiáng)、中等和弱致病力3種類型[21]。結(jié)果表明，有78個分離物為強(qiáng)致病力類型，占分離物總數(shù)的81.3%，10個分離物致病力中等，占10.4%，僅有8個分離物具弱致病力，占8.3%（表2）。河北、寧夏、甘肅、云南、四川、安徽、北京和內(nèi)蒙古等地分離物的主要為強(qiáng)致病力類型（50%—100%），福建和青海分離物以中等致病力和弱致病力為主（表3）。

2.3致病基因PCR檢測

用PDA、PEP1、PEP3和PEP5等4個致病基因的特異性引物分別對96個茄鐮孢豌豆專化型分離物基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增（表2，圖）。在96個分離物中，含PDA有89個，占分離物總數(shù)的92.7%，有92個分離物含有PEP1，占95.8%，含PEP3分離物有91個，占94.8%，只有44個分離物含有PEP5，占45.8%。96個分離物共產(chǎn)生10個基因型，分別為PDA+PEP1+PEP3+PEP5（A型）、PDA+PEP1+PEP3（B型）、PDA+PEP3+PEP5（C型）、PDA+PEP1（D型）、PDA+PEP3（E型）、PEP1+PEP3（F型）、PEP1+PEP5（G型）、PEP1（H型）、PEP3（I型）和PEP5（J型）?；蛐虯、B、C、D、E、F、G、H、I和J所含分離物數(shù)分別為41、45、1、1、2、1、1、2、1和1個，各占分離物總數(shù)的43.0%、47.0%、1.0%、1.0%、2.0%、1.0%、1.0%、2.0%、1.0%、1.0%；其中含有4個（A型）和3個（B、C型）致病基因的分離物數(shù)量約占總數(shù)的91%，這些分離物主要來源于安徽、北京、河北、內(nèi)蒙、寧夏、甘肅、青海、四川等。含不同致病基因的分離物其致病力也不同，含有4個或3個致病基因分離物的致病力普遍強(qiáng)，而含有2個或1個致病基因分離物的致病力普遍較弱。此外，含有PDA的分離物（A、B、C、D和E型等）致病力普遍較強(qiáng)；不含PDA（F、G、H、I和J型）的分離物致病力較弱（表2）。

3討論

豌豆根腐病長期以來一直是阻礙中國豌豆生產(chǎn)的主要因素之一。然而，豌豆在中國是一種小作物，病害問題很少被重視。20世紀(jì)80年代末以來，一些研究者對青海、甘肅和福建省等一些地區(qū)的豌豆根腐病病原菌進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)引起豌豆根腐病的病原菌有茄鐮孢、豌豆絲囊霉、鏈孢粘帚霉、尖孢鐮、根串珠霉、立枯絲核菌、終極腐霉和殼二孢菌、絲葚霉等，其中多數(shù)報(bào)道認(rèn)為茄鐮孢是引起豌豆根腐病的主要病原菌[6,11-14]。本研究對不同地區(qū)來源的豌豆根腐病菌進(jìn)行了分離鑒定，發(fā)現(xiàn)約60%的分離物為茄鐮孢（未發(fā)表數(shù)據(jù)），通過系統(tǒng)地對分離物進(jìn)行形態(tài)學(xué)、致病性及分子特征鑒定，首次在國內(nèi)明確引起豌豆根腐病菌的茄鐮孢為豌豆專化性。通過致病力測定發(fā)現(xiàn)，茄鐮孢豌豆?；头蛛x物間致病力存在差異，但絕大多數(shù)分離物為強(qiáng)致病力類型，這些分離物分布在寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古、云南、四川等地，這一結(jié)果與這些地區(qū)豌豆根腐病嚴(yán)重發(fā)生相一致。西北及西南地區(qū)是中國干籽粒豌豆的主要生產(chǎn)區(qū)，但是豌豆主要種植在干旱的坡地，土壤肥力較差，且連年種植，這些條件有利于鐮孢菌根腐病的嚴(yán)重發(fā)生[3]。

在農(nóng)田系統(tǒng)中，自然發(fā)生的茄鐮孢豌豆?；痛嬖谪S富的毒力變異。茄鐮孢豌豆?；蛯ν愣沟膶；灾虏⌒约爸虏×λ揭蕾囉谥虏』虻拇嬖诤蛿?shù)量[18,37]。利用Etebu等[18]開發(fā)的特異性引物，筆者檢測了中國不同地理來源的96個茄鐮孢豌豆專化型分離物致病基因，發(fā)現(xiàn)有92.7%、95.8%、94.8%和45.8%分離物分別含有PDA、PEP1、PEP3和PEP5。根據(jù)這4個基因在每一個分離物中的存在與否，96個分離物共產(chǎn)生10個基因組合，即基因型（或單倍型），其中含PDA+PEP1+PEP3+PEP5基因組合（A型）和PDA+PEP1+PEP3基因組合（B型）的分離物分別占總數(shù)的43.0%和47.0%，這些分離物分布在安徽、北京、河北、內(nèi)蒙、寧夏、甘肅、青海、四川，表明中國茄鐮孢豌豆專化型存在致病基因多樣性的同時(shí)，致病基因型趨于單一。

在茄鐮孢豌豆?；椭校煌虏』虼嬖谂c否和（或）不同致病基因組合決定每一個分離物對豌豆的致病力水平。Etebu等[18]利用開發(fā)的特異性PCR引物對15個茄鐮孢豌豆?；投玖Σ煌姆蛛x物所含PDA、PEP1、PEP3和PEP5致病基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)缺乏PDA的分離物對豌豆不致病或致病力弱，4個基因組合分離物具有強(qiáng)的致病力，其結(jié)果支持PDA是茄鐮孢豌豆?；蛯ν愣怪虏⌒缘年P(guān)鍵基因，PEP1、PEP3和PEP5能夠加強(qiáng)茄鐮孢豌豆?；偷闹虏×?。

本研究結(jié)果與Etebu等[18]的基本一致，但也出現(xiàn)了少數(shù)例外，如含有PDA、PEP1和PEP3致病基因組合的BJ-4、NM-7和AH-17為3個致病力最強(qiáng)的分離物，分別含有PDA、PEP1、PEP3和PEP5或PDA、PEP1和PEP3致病基因組合AH-15、DX-1和AH-1為弱致病力分離物。

含有PDA、PEP1和PEP3致病基因組合的分離物具有最強(qiáng)致病力的可能原因是這些分離物可能還含有PEP2和PEP4，或存在其它的致病機(jī)制。PEP2與PDA、PEP1、PEP5一樣能夠獨(dú)立地使缺乏超數(shù)染色體的N.haematococca的非致病菌株產(chǎn)生對豌豆的致病性，是N.haematococca豌豆致病力的決定因子[20,38-39]。Etebu等[37]最新研究表明含有PDA、PEP1和PEP4基因組合的分離物也具有強(qiáng)的致病力。此外，N.haematococcaMPVI還存在一種對豌豆素的忍耐機(jī)制，稱作對豌豆素非降解性忍耐，即產(chǎn)生一個專化性ATP結(jié)合性組件轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NhABC1提高其對豌豆素的忍耐[40]。

含有PDA的茄鐮孢豌豆?；头蛛x物對豌豆只具有弱或中等致病力已有報(bào)道[21]。迄今，通過遺傳研究已經(jīng)鑒定了9個PDA基因PDA-1、PDA-2、PDA2、PDA3、PDA4、PDA5、PDA6-1、PDA6-2、PDA7，但是只有能夠快速誘導(dǎo)Pda活性的基因PDA-1、PDA-2、PDA4、PDA5與對豌豆的致病力有關(guān)[26,41]。因此，根據(jù)含有PDA基因PDA-、PDAL和PDAH的不同，可以將茄鐮孢豌豆?；丸b定為3種表現(xiàn)型，第1類缺乏解毒豌豆素的能力（PDA-），第2類長時(shí)間豌豆素誘導(dǎo)后產(chǎn)生低水平的豌豆素脫甲基化酶（PDAL），第3類豌豆素快速誘導(dǎo)中到高水平的脫甲基化酶產(chǎn)生（PDAH）[22,24,42-43]。PDA具有高度的序列同源性[25,44-45]，應(yīng)用PDA特異性分子標(biāo)記，可以有效的檢測出PDA的存在，但是不能有效的區(qū)分這些基因類型[18]。因此，筆者推測本研究中分別含有PDA、PEP1、PEP3和PEP5或PDA、PEP1和PEP3致病基因組合的弱致病力分離物AH-15、DX-1和AH-1所含有的PDA為PDAL類型，然而，確切結(jié)果必須對PCR產(chǎn)物測序和進(jìn)行同源性比較才能夠獲得。

4結(jié)論

通過形態(tài)學(xué)、致病性和分子特征研究確定引起中國豌豆鐮孢根腐病的病原菌為茄鐮孢豌豆?；?。強(qiáng)致病力分離物為豌豆主要生產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢種群。致病基因檢測發(fā)現(xiàn)中國茄鐮孢豌豆?；头蛛x物存在10種不同致病基因型，其中含有4個基因組合和3個基因組合的分離物約占91%，這些分離物絕大多數(shù)具有強(qiáng)致病力（87.4%）或中等致病力（9.2%），不含PDA的分離物基本上都是弱致病力類型，表明致病基因的種類與數(shù)量決定茄鐮孢豌豆?；头蛛x物的致病力水平。