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1序列分析

采用VectorNTI11.0進(jìn)行多序列比對(duì)。基于擬南芥、水稻、毛果楊、小立碗蘚、番茄衣藻(的SPL蛋白中SBP-domain區(qū)氨基酸序列(76aa)，采用MEGA4.0軟件(鄰接法)進(jìn)行多序列比較，對(duì)光皮樺BlSPL1進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(Tamuraetal．，2007)，所用序列來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)。具體的基因名和序列號(hào)參考Salinas等(2011)的報(bào)道。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，其擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95℃5min;95℃5s，60℃20s，72℃20s，40個(gè)循環(huán)。定量引物為51QF和51QR，內(nèi)參基因Actin的引物為，采用相對(duì)定量分析基因表達(dá)。SNP分析鑒于BlSPL1基因組序列較長(zhǎng)，為便于克隆和測(cè)序，將其分成A和B2段進(jìn)行克隆、SNP搜尋與分析，其中段包含5''''-UTR部分序列和第1、2個(gè)外顯子及第1個(gè)內(nèi)含子、第2個(gè)內(nèi)含子部分序列共1665bp，B片段包括第2個(gè)內(nèi)含子部分序列、第3個(gè)外顯子(含miR156靶位點(diǎn))以及3''''-UTR共846bp。引物51F433和51R2098用于段的克隆，51F2608和51R用于B片段的克隆。以57個(gè)不同種源的無(wú)性系植株基因組DNA為模板，采用高保真Pfu酶(北京全式金)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后采用pEASY-BluntcloningKit進(jìn)行克隆，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，每個(gè)樣本至少挑3個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。利用DnaSP5.0軟件(Libradoetal．，2009)對(duì)序列進(jìn)行分析，搜尋SNP位點(diǎn)、計(jì)算SNP頻率及多樣性指數(shù);分析同義突變、錯(cuò)義突變和無(wú)義突變情況;分析LD在光皮樺不同群體BlSPL1基因中的延伸模式。

2結(jié)果與分析

2.1光皮樺BlSPL1基因的克隆及其序列分析

基于光皮樺轉(zhuǎn)錄組序列，利用RACE技術(shù)，克隆獲得了BlSPL1基因。序列分析結(jié)果表明，該基因cDNA序列全長(zhǎng)1825bp，分別包含486bp的5''''-UTR，169bp的3''''-UTR，以及長(zhǎng)為1170bp開放閱讀框，其編碼389個(gè)氨基酸。用ProtParamtool估算推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的分子量約為42.37kDa，其等電點(diǎn)為8.43。同源分析表明，與桃、蘋果(Malus×domestica)MdSPL1(ADL36824.1)的序列同源性最高，分別達(dá)到67%和60%。同時(shí)，為進(jìn)行后續(xù)的SNP分析，根據(jù)cDNA序列克隆了其對(duì)應(yīng)的基因組DNA序列。結(jié)果表明BlSPL1的基因組序列全長(zhǎng)3457bp，包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，第1個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)1005bp，第2個(gè)內(nèi)含子為624bp，3個(gè)外顯子分別長(zhǎng)416bp，134bp，620bp，在第3個(gè)外顯子處含有miR156靶位點(diǎn)。進(jìn)一步的蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，BlSPL1在蛋白質(zhì)的第92—170氨基酸殘基位置上含有該基因家族所特有SBP結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域包含2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，其中N端鋅指結(jié)構(gòu)(Zn-1)為Cys3His，C端鋅指結(jié)構(gòu)，另外在該結(jié)構(gòu)域的C端第150—167位置上含有核定位信號(hào)，這與相關(guān)報(bào)道相符。為分析BlSPL1基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，參照Salinas等(2011)構(gòu)建了SBP-box基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹?？梢?jiàn)，陸地植物SPL蛋白分化為8個(gè)分支，即groupⅠ－Ⅷ，而BlSPL1屬于groupⅦ這一分支，與來(lái)自水稻、擬南芥和楊樹的相關(guān)SPL蛋白同屬一個(gè)分支，且與楊樹的PtSBP20親緣關(guān)系最近。BlSPL1基因的表達(dá)分析SPL基因在植物成花過(guò)程中被認(rèn)為是比較上游的調(diào)控因。因此，本研究采用定量PCR對(duì)BlSPL1基因在光皮樺芽、雌花、雄花以及幼苗早期不同發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。可見(jiàn)，BlSPL1基因在光皮樺的芽、雌花、雄花、幼苗中均有表達(dá)，但在雄花和幼苗中的表達(dá)水平較低，而在芽發(fā)育成雌花的過(guò)程中其表達(dá)逐漸升高B1－B3)，在雌花明顯可見(jiàn)時(shí)(F1)表達(dá)量達(dá)到最高，其后表達(dá)量又逐漸降低。從這些結(jié)果可以初步推測(cè)BlSPL1可能在芽發(fā)育為雌花的過(guò)程中起調(diào)控作用。

2.2BlSPL1基因SNP多樣性分析

插入和缺失長(zhǎng)度在1～3bp之間，其中編碼區(qū)有一長(zhǎng)度為3bp的插入，未導(dǎo)致編碼區(qū)的移碼突變，其余均發(fā)生在非編碼區(qū)。BlSPL1基因內(nèi)SNP發(fā)生的平均頻率為1/26bp，在5''''-UTR、外顯子、內(nèi)含子、3''''-UTR分別檢測(cè)到了2、28、61、7個(gè)SNPs，其出現(xiàn)頻率為內(nèi)含子＞3''''-UTR＞5''''-UTR＞外顯子。由SNP在BlSPL1基因內(nèi)部出現(xiàn)的頻率可知，該基因不同區(qū)域的保守性不同，而在編碼區(qū)核苷酸變異程度最低，顯示了該基因在進(jìn)化過(guò)程中編碼區(qū)受到了較強(qiáng)的選擇壓。進(jìn)一步對(duì)檢測(cè)到的97個(gè)SNPs進(jìn)行了變異類型統(tǒng)計(jì)(表3)。結(jié)果顯示，在這些SNPs中，有57個(gè)屬于轉(zhuǎn)換類型，分別包含29個(gè)AG和28個(gè)TC。對(duì)于顛換類型，共檢測(cè)到40個(gè)，分別是14個(gè)AC、7個(gè)TG、11個(gè)AT和8個(gè)GC，轉(zhuǎn)換/顛換=1.43。為檢測(cè)BlSPL1編碼區(qū)SNPs是否引起其編碼氨基酸的改變，對(duì)編碼區(qū)內(nèi)的28個(gè)SNPs進(jìn)行了同義突變、錯(cuò)義突變、無(wú)義突變分析。在BlSPL1編碼區(qū)內(nèi)的28個(gè)SNPs中，11個(gè)屬于同義突變，17個(gè)為錯(cuò)義突變。其在SBPdomain區(qū)域內(nèi)發(fā)生了2次同義突變和0次錯(cuò)義突變，而在SBPdomain外的編碼區(qū)發(fā)生了9次同義突變和17次錯(cuò)義突變，如位于編碼區(qū)的第172和第1974位置上分別發(fā)生了第1位和第2位密碼子的改變，由AGA突變?yōu)镚GA，GCA突變?yōu)镚AA，從而分別導(dǎo)致其編碼的氨基酸由精氨酸(Arg)變成甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)變成谷氨酸(Glu)?？芍猄BPdomain編碼區(qū)內(nèi)無(wú)錯(cuò)義突變，而SBPdomain以外編碼區(qū)錯(cuò)義突變頻率為1/18aa;又基因的第3個(gè)外顯子內(nèi)錯(cuò)義突變達(dá)15個(gè)，而其區(qū)域內(nèi)的miR156靶位點(diǎn)沒(méi)有核苷酸突變位點(diǎn)出現(xiàn)。由以上可知SBPdomain和miR156靶位點(diǎn)有很強(qiáng)的保守性。BlSPL1基因在光皮樺不同群體內(nèi)的遺傳分化及變異為了檢測(cè)BlSPL1基因在光皮樺不同群體內(nèi)核苷酸變異及群體分化程度，利用DnaSP5.0軟件對(duì)5個(gè)群體分別進(jìn)行了多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、單核苷酸多樣性、的中性檢驗(yàn)。對(duì)于檢測(cè)到的SNP多樣性指數(shù)πtot、πsil、πs、πn均有差異，但差異不顯著，說(shuō)明BlSPL1在群體間的分化程度并未達(dá)到顯著水平。Tajima’sD*和FuandLi’sD*中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，D*均為負(fù)值，這顯示了在光皮樺群體內(nèi)，BlSPL1基因在進(jìn)化過(guò)程中存在過(guò)剩的稀有SNPs，特別是廣西群體內(nèi)存在較多的低頻率SNPs。而5個(gè)群體，均為πn＜πs，即非同義突變與同義突變的比率＜1，顯示出在光皮樺物種演化過(guò)程中，純化選擇是BlSPL1基因內(nèi)同義SNP位點(diǎn)的主要篩選壓。

2.3BlSPL1基因內(nèi)SNPs的連鎖不平衡分析

SNPs的LD程度迅速削弱，但不同群體內(nèi)LD衰退程度明顯不同;當(dāng)R2＜0.1，在黃山東部、武夷山東部、廣西、四川、貴州群體中LD衰退序列長(zhǎng)度分別達(dá)到，其中來(lái)自四川的群體LD在該基因組延伸長(zhǎng)度最短。這一結(jié)果表明，在光皮樺不同天然群體內(nèi)，BlSPL1基因內(nèi)SNPs存在不同程度的連鎖不平衡，但其連鎖不平衡在候選基因內(nèi)就已衰退。

3討論

序列分析表明在其第3個(gè)外顯子處含有miR156靶位點(diǎn)，同時(shí)其編碼的氨基酸具有典型的SBP-domain，包含2個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明BlSPL1屬于陸地植物SPL蛋白groupⅦ這一分支，且與楊樹的PtSBP20、擬南芥AtSPL13等具有較近的親緣關(guān)系，基因組序列分析結(jié)果也顯示BlSPL1的基因結(jié)構(gòu)與這一分支的同源基因相似，因此這些基因在功能上可能有一定的相似性，但目前這一分支的基因并沒(méi)有深入的功能研究。同時(shí)，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示在每個(gè)SPL蛋白分支中都包含至少一個(gè)單子葉和雙子葉植物的SPL基因(groupⅣ除外)，這表明BlSPL1與其他高等植物的SPL基因可能具有共同的祖先，而在groupⅦ分支中，BlSPL1與同為林木的楊樹SPL基因親緣關(guān)系最近，反映了光皮樺與楊樹間的親緣關(guān)系，同時(shí)也表明隨著雙子葉植物的分化，其相應(yīng)的SPL基因可能也在進(jìn)一步的特化。雖然SPL基因在植物中參與不同的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，但目前對(duì)功能的研究主要集中于其對(duì)開花過(guò)程的調(diào)控。在模式植物擬南芥中的研究說(shuō)明，miR156-SPL3是調(diào)控植物成花的重要途徑。但在林木中，SPL基因的功能和調(diào)控機(jī)制仍然不明確。由于缺乏可用轉(zhuǎn)基因平臺(tái)或突變體，目前對(duì)木本植物SPL基因功能的研究大多是通過(guò)表達(dá)分析來(lái)進(jìn)行研究。如對(duì)枳的SPL9和SPL13進(jìn)行了表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)兩者在葉、莖、根、花、果等各個(gè)器官均有表達(dá)，分別在莖和幼果中表達(dá)量最高，推測(cè)它們可能分別與莖和果實(shí)的發(fā)育相關(guān)(宋長(zhǎng)年等，2010)。BlSPL1基因的表達(dá)也具有組成性，在幼苗、芽、雄花和雌花均有表達(dá)，在雄花和幼苗中表達(dá)水平較低，但在芽發(fā)育成雌花的過(guò)程中有一個(gè)明顯的表達(dá)水平上調(diào)，這些結(jié)果暗示BlSPL1與光皮樺的開花相關(guān)，且可能在雌花發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用。

作者：李玉嶺周厚君林二培黃華宏徐莉莉童再康單位：浙江農(nóng)林大學(xué)