SELEX技術醫(yī)學論文
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1．1篩選過程SELEX技術依據(jù)分子生物學的原理，首先人工構建一個隨機寡核苷酸文庫，隨機核苷酸序列的長度為20～40bp左右，庫容量為1014～1015個寡核苷酸，所包含的不同種立體構象，幾乎可以涵蓋自然界存在的所有種類的靶分子。將靶標物質(zhì)與隨機文庫在一定條件下進行混合，形成文庫-靶標復合物，把未結合的核酸洗脫掉，富集與靶物質(zhì)結合的核酸分子，以后者為模板進行PCR擴增，得到的產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，作為進行下一輪篩選的模板。如此反復，通過多輪(8～15輪)篩選，與靶標不結合或親和性弱的核酸分子被充分去除，而與靶分子親和性強的核酸分子被分離出來，同時其純度隨著篩選輪數(shù)的增加而增加。最后篩選到的文庫要經(jīng)過克隆測序和特異性修飾，經(jīng)過這些步驟后，所獲得的特異識別靶分子的核酸才是適配體。
1．2優(yōu)勢和特點1)親和力高、特異性強。適配體與靶標之間，憑借彼此互補的三維結構，相互作用后形成牢固穩(wěn)定的復合物，其解離常數(shù)通常能達到pmol/L～nmol/L的水平，并且能分辨出靶標結構上細微的差別。2)庫容量大，識別范圍廣泛。SELEX技術的靶標遠遠多于經(jīng)典的抗原抗體結合反應，除了有蛋白質(zhì)、核苷酸分子外，還可以是糖類、氨基酸、維生素、抗生素、金屬離子、有機染料，甚至可以是細菌、病毒、寄生蟲等完整的細胞或組織，幾乎囊括了自然界中的全部物質(zhì)。3)合成容易，獲得方便，易于修飾。適配體的體積比傳統(tǒng)抗體小，篩選過程簡便、周期短，對實驗室的要求不高，并具備自動化控制的巨大潛力。經(jīng)過化學合成和修飾以后可保持原生物活性不變，還可以增強其穩(wěn)定性并增加其他新的化學性質(zhì)，參加多類反應。標記了熒光、生物素和納米金顆粒之后，發(fā)展出了諸如分子成像技術等疾病診斷新方法。4)重復性好，純度高。整個篩選和制備的過程在人為控制之下，所得到的適配體幾乎沒有生產(chǎn)批次之間的差異，便于日后的大規(guī)模生產(chǎn)和應用。5)分子量小、穩(wěn)定性高。相對于抗體或酶，適配體的化學性質(zhì)更穩(wěn)定，不易降解，對溫度不敏感，保存時間長，即使變形也能在很短的時間內(nèi)復性，利于室溫下運輸。6)應用便捷。SELEX技術所獲得的適配體又被稱作是核酸型抗體，其優(yōu)于傳統(tǒng)抗體的性質(zhì)是沒有免疫原性，因此便能獲得一些低免疫原性甚至無免疫原性靶分子的適配體。并且還省去了傳統(tǒng)抗體制備過程中的動物實驗，而直接從體外文庫中獲取。而且適配體更容易通過細胞膜，并且沒有毒性，利于檢測細胞內(nèi)的靶分子和實現(xiàn)多層次的調(diào)控，并能較快地被機體清除代謝掉，經(jīng)過特定的化學修飾后，還可使半衰期延長，穩(wěn)定性提高，便于科學研究和疾病診治。
2SELEX技術的發(fā)展
目前SELEX技術出現(xiàn)了一些新的篩選方法，越來越多的與各種標靶相對應的適配體被篩選出來。如毛細管電泳法、硝酸纖維素膜過濾法、磁珠分離法、親和色譜法、Non-SELEX技術、無引物PCR-SELEX技術、微流體SELEX技術、生物芯片SELEX技術、原子力顯微鏡等各種新的模式也被應用到適配體的篩選中。同時還出現(xiàn)了SELEX技術與定量PCR，SEL-EX技術與流式細胞儀、SELEX技術與ELISA的聯(lián)合應用，更是極大的提升了篩選的效率和準確性。
2．1消減SELEX技術消減SELEX技術是一種經(jīng)過改良的SELEX技術。以完整細胞為靶標的消減SELEX技術，是在篩選過程中以完整的細胞作為靶標，并消減掉能與已知或未知的共有靶標結合的配體，經(jīng)過消減后的次級隨機文庫再投入到特異靶標的篩選中。它的意義在于可以實現(xiàn)從兩組高度同源的完整細胞中，篩選出針對其中一種細胞的特異性適配體。這項技術可應用于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤細胞識別結構，還可進一步作為“生物導彈”，獨立完成靶向治療或攜帶藥物，未來將會在腫瘤的治療中發(fā)揮巨大的功效。
2．2自動化SELEX技術傳統(tǒng)的SELEX技術過程需要完成一套重復繁瑣的操作，使得篩選相對耗時耗力。自動化SELEX技術的建立可以簡化篩選過程，節(jié)約時間和物品的消耗，實現(xiàn)高通量和限定范圍，達到同時篩選多個靶分子的效果。自動化SELEX技術離不開現(xiàn)代分離儀器的配合，后者的發(fā)展推動了前者的進步。2001年Cox等使用Biomek2000自動化工作站成功篩選到了溶菌酶的特異性適配體，通過這種自動化篩選平臺，不到2d就完成了12輪的篩選。
2．3導向SELEX技術適配體的特異性是整個SELEX技術的核心所在，為了提高適配體的特異性和穩(wěn)定性，可將已知的能與靶標非特異結合的分子摻入到文庫中或預先與靶標進行混合后再篩選，這樣可獲得只與靶標特異結合的適配體。2002年Hamm等將此技術與抗個體基因型的方法聯(lián)合運用，成功獲得了特定激酶抑制劑的特異性RNA適配體。Martell運用特殊的導向SELEX技術，從隨機表達盒雜交文庫中篩選到了能與E2F蛋白具有高親和性的RNA適配體。
3SELEX技術在醫(yī)學中的應用
3．1SELEX技術在基礎醫(yī)學研究中的應用依據(jù)核酸適配體具有與靶物質(zhì)高特異性結合的能力，可以幫助我們尋找到疾病的發(fā)病機制。Roulet等提出把SELEX技術同基因表達串行分析手段聯(lián)合應用，并通過自動化的序列提取工藝，建立轉(zhuǎn)錄因子結合位點的定位模型。通過對轉(zhuǎn)錄因子適配體文庫中的某一序列進行測序，可了解該蛋白結合位點的特異性，探尋一些以前在基因組中從未研究過的結合位點，掌握在不同的核苷酸位點上非獨立堿基出現(xiàn)的先后順序，為闡明其結合機制提供一些線索。Bian-chi等采取SELEX技術發(fā)現(xiàn)，TRF1二聚體在端粒上有兩個相同的識別半位點，它們的距離可以變化，且兩個半位點的順序方向沒有區(qū)別。這為探索端粒長度的調(diào)節(jié)機制提供了新依據(jù)。
3．2SELEX技術在疾病診斷中的應用腫瘤細胞及其標志物的早期檢測對于腫瘤的診斷及預后極為重要，目前已經(jīng)篩選出多種腫瘤的特異性適配體，例如急性髓系白血病的適配體KH1C12、急性淋巴細胞白血病的適配體sgc8/sgc3/sgd3、惡性膠質(zhì)瘤的適配體GBI-10、Burrkitt淋巴瘤的適配體TD05、非小細胞肺癌的適配體S1/S11e/S15、小細胞肺癌的適配體HCA12/HCC03/HCH07/HCH01、乳腺癌的適配體KMF2-1a、結腸癌的適配體KDED2/KD-ED7/KDED9/KC2D3、小鼠肝癌的適配體TLS9a/TLS11a、卵巢癌的適配體DOV3/DOV4/DOV6。它們可以特異地識別腫瘤細胞，僅需少量腫瘤細胞即可實現(xiàn)準確的鑒別和分型。將適配體與納米顆粒結合后通過比色檢測，觀察顏色的變化即可判斷有無靶標細胞。這個實驗非常敏感，樣本中的靶細胞數(shù)超過百個即可檢測出來，還不需要昂貴的檢測設備和待檢靶標的標記與修飾。因此，有可能成為常規(guī)篩查活體標本中新生腫瘤細胞的一種新方案。與此同時腫瘤細胞的分子成像技術也已經(jīng)問世，它能夠從細胞水平對生物過程進行可視化描述及測量，不僅能定位病灶，觀察某些影響腫瘤細胞行為的生物過程，還能觀察腫瘤細胞對藥物的反應。Kim等研究將前列腺特異性膜抗原(PSMA)的特異性適配體與金納米材料結合后，帶有PSMA的前列腺癌細胞便能夠被特異性地標記出來，將其作為造影劑應用在前列腺腫瘤的影像學診斷中，比傳統(tǒng)的造影劑顯像時間更持久，毒副作用更小，應用價值更顯著。SELEX技術還在血液的生化檢查方面，顯示出一定的應用前景。用其檢測血液中的某些靶分子，將比傳統(tǒng)方法更特異和高效。腦尿鈉肽(BNP)常被臨床上用來評價急性心力衰竭或急性呼吸窘迫癥患者的病情和預后。Lin等采用SELEX技術的原理，篩選到了能與BNP特異結合的適配體。在微流體試驗模式下，被熒光標記的適配體可以快速測出血液中BNP的濃度，比放射免疫分析法或是免疫分析技術更精確、更經(jīng)濟。C反應蛋白(CRP)是機體在應激狀態(tài)下生成的一種非特異性的急性時相反應蛋白，CRP與冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病具相關性。Bini等開發(fā)出了一種帶有光化學性質(zhì)的CRP特異性適配體，當血液中的CRP濃度超0．005mg/L時就能被檢測出來，敏感度非常高。這一成果為新型CRP診斷試劑的研制奠定了基礎。SELEX技術還被應用在病原微生物的檢測，其能克服傳統(tǒng)檢測方法在特異性和敏感性上的缺陷，為新型檢測試劑盒的開發(fā)提供有力支持。例如結合分支桿菌的特異性適配體CSRI2．11檢測過程比傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法更省時更敏感;丙型肝炎病毒的適配體ZE2可結合酶聯(lián)免疫吸附試驗實現(xiàn)丙型肝炎的早期篩查，不受抗體檢測時窗口期的制約;瘧原蟲乳酸脫氫酶的適配體PL1在臨床實踐中，可以很好的區(qū)分患者是否感染了出間日瘧原蟲或惡性瘧原蟲。
3．3SELEX技術在疾病治療中的應用SELEX技術在疾病治療中的功效越來越來受到人們的重視。適配體在體內(nèi)與靶分子結合，理論上可以對靶分子的生理功能和代謝過程產(chǎn)生影響，靶分子也會因此發(fā)生信號傳導的改變甚至喪失原本的功能，直接或間接阻斷疾病發(fā)生進程。以此開發(fā)的靶蛋白功能阻斷劑，日益顯示出其巨大的潛力。全球首個適配體藥物是2004年由美國食品和藥物管理局批準上市的哌加他尼鈉，可用來治療老年性黃斑變性。SELEX技術在凝血系統(tǒng)疾病的治療上具有一定的意義，已找到了可用作抗凝血和抗血栓藥物的適配體REG-1，其結合的位點是凝血酶的肝素結合位點以及纖維蛋白原結合位點。在治療免疫系統(tǒng)疾病方面，也已獲得了具有藥物開發(fā)潛力的特異性適配體，如可用來拮抗自身抗體已達到治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的適配體，還有能刺激T細胞釋放的4-1BB的適配體。對于腫瘤的治療，基于SELEX技術研制的適配體藥物更是走在前列，進入到了臨床試驗階段。如對實體瘤和復發(fā)性急性髓樣白血病有良好療效的AS1411，更出現(xiàn)了連接金納米棒的適配體，用作腫瘤靶向光熱治療。適配體藥物作為抗病毒藥，也展現(xiàn)出良好的前景，比如用來抑制狂犬病病毒的復制和干擾艾滋病病毒的體內(nèi)合成。除此以外，核酸適配體還可作為運輸工具，特異性地把藥物運送至靶標細胞或組織達到定點清除的治療效果，研究比較成熟的有裝載著阿霉素，用來殺傷前列腺癌細胞的復合適配體藥物。
4展望
目前，越來越多可用于疾病診斷和治療的適配體被逐步篩選出來，并被廣泛地應用在生物醫(yī)學的各個領域。然而其在臨床中的大規(guī)模應用仍為時尚早。還有許多問題亟須解決，例如具備高特異性、高親和力的適配體數(shù)目還相對較少;實驗室環(huán)境中篩選出的適配體，在體內(nèi)復雜環(huán)境下發(fā)揮作用的實際效果尚不完全掌握;篩選過程還需進一步簡化，產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性還應進一步提高，以及對適配體的修飾和優(yōu)化方案還需進一步明確。相信隨著現(xiàn)代技術的進步，上述各種問題終將攻克，SELEX技術在生命科學和生物醫(yī)藥領域中的應用前景將會更加廣闊。
作者：樸喜航任姝穎夏薇單位：北華大學醫(yī)學檢驗學院
