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【摘要】目的：觀察新輔助化療對乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移因子的影響。方法：以48例具備新輔助化療條件的乳腺癌患者為研究對象，采用RTPCR技術(shù)，聯(lián)合檢測外周血中CK19mRNA、VEGFmRNA和hMAMmRNA的表達(dá)，觀察新輔助化療前后血微轉(zhuǎn)移因子變化。結(jié)果：本組乳腺癌微轉(zhuǎn)移因子陽性率在病理分級中差異無顯著性意義(P>0.05);在分期中，分期越高陽性率越高(P<0.05);化療方案可影響微轉(zhuǎn)移因子陽性率的變化(P<0.01)。結(jié)論：通過檢測乳腺癌患者外周血中微轉(zhuǎn)移因子，有可能成為判斷乳腺癌預(yù)后和指導(dǎo)治療的指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌新輔助化療微轉(zhuǎn)移因子逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

NeoadjuvantChemotherapyforPeripheralBloodMicrometastasisFactorsinPatientsofBreastCancerHEGang,etal.NingboNo.2Hospital,Ningbo(315010),China

AbstractObjective:Toexploretheinfluenceofneoadjuvantchemotherapyonperipheralmicrometastasisfactorsinbreastcancer.Methods:CK19mRNA,VEGFmRNAandhMAMmRNAinperipheralbloodof48breastcancerpatientsweredetectedusingRTPCRbeforeandafterneoadjuvantchemotherapy.Results:Nosignificantdifferenceinthebreastmicrometastasisfactorswasnotedindifferentpathologicalstages(P>0.05);thepositiverateofmicrometastasisfactorswashigherinupperclinicalstages(P<0.05).Chemotherapyhadpositiveeffectonmicrometastasisfactors(P<0.01).Conclusion:Thefactorsofperipheralmicrometastasiscouldbetestedforbreastcancerpatients,guidingprognosisandtreatment.

Keywordsbreastcancerneoadjuvantchemotherapymicrometastasisfactorreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)

腫瘤對化療藥物的敏感性一直是近年研究的熱點(diǎn)。NSABPB18試驗(yàn)隨訪5年的資料證實(shí)[1]，檢測外周血微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞，并選擇有效藥物進(jìn)行治療，是新輔助化療亟待解決的問題。筆者選擇細(xì)胞角蛋白19(CK19)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和人乳腺球蛋白(hMAM)作為乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行聯(lián)合檢測研究，探討新輔助化療對微小轉(zhuǎn)移灶檢測的方法和臨床意義。

1臨床資料

選擇2006年4月～2009年3月具備新輔助化療條件的乳腺癌患者48例，年齡35～78歲，平均47.6歲。病理分期：I～I(xiàn)I期17例，III期31例;病理分級：浸潤性低分化腺癌27例，浸潤性中、高分化腺癌21例。

2方法

2.1新輔助化療方法48例采用CAF方案行新輔助化療23例，予環(huán)磷酰胺600mg,第1天，氟尿嘧啶500mg,第1天，多柔比星60mg,第1天，兩周方案;第1天采用AT方案行新輔助化療25例，予紫杉醇160mg，第1天，表柔比星60mg，第1天，兩周方案。分別于新輔助化療前第1天和化療結(jié)束后第7天檢測外周血中相關(guān)基因標(biāo)志物微轉(zhuǎn)移因子的表達(dá)水平。48例患者之前均未行任何治療。

2.2檢測方法化療前和化療后分別取外周靜脈血10ml，棄去采血針抽取的前2ml血，以減少標(biāo)本被皮膚細(xì)胞污染可能，隨后取8ml分別加入四支含EDTA的抗凝管中，充分搖勻，以PBS稀釋后，采用淋巴細(xì)胞分離液離心，收集淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞層，洗滌后移至EP管，70℃凍存?zhèn)涮崛NA用。

2.2.1儀器、試劑與引物PersonalCycler型PCR儀(德國Biometra公司);GelDoc型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Biorad公司);RNA提取試劑盒和RTPCR試劑盒(Takara公司);引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。VEGFC上游引物：5’GCATGAACACCAGCACGAG3’;下游引物：5’ATGAAGGGACACAACGACAC3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為717bp片段。CKl9上游引物：5’GCGACTACAGCCACTACTACAC3’;下游引物：5’GAACCAGGCTTCAGCATCC3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為440bp片段。11MAM上游引物：5’CCGACAGCAGCAGCCTCAC3’;下游引物：5’TCCGTAGTTGGTTTCTCAC3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為338bp片段。內(nèi)參照βactin上游引物：5’AGAAGGATTCCTATGTGGGCG3’;下游引物：5’AAGCATTTGCGGTGGACG3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為979bp片段。

2.2.2RNA提取及鑒定取出保存的單核細(xì)胞標(biāo)本，按RNA提取試劑盒中的操作說明書提取總RNA，并根據(jù)(A260A320)×稀釋倍數(shù)×0.04μg/μl值計(jì)算RNA的濃度，以A260/A280判定其純度。

2.2.3RTPCR反應(yīng)按照RTPCR試劑盒操作，βactin分別與VEGF、CK19和hMAM進(jìn)行同管擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳后，進(jìn)行凝膠成像分析，并根據(jù)VEGF/βactin、CKl9/βactin和hMAM/βactin分別計(jì)算各自的相對表達(dá)量。

2.2.4產(chǎn)物鑒定凝膠成像系統(tǒng)觀察，本組VEGF、CK19和hMAM均在內(nèi)參照擴(kuò)增產(chǎn)物片段處出現(xiàn)清晰條帶，證實(shí)RNA無降解和反應(yīng)體系適當(dāng)。各自對應(yīng)的預(yù)期產(chǎn)物片段出現(xiàn)清晰陽性條帶為待測標(biāo)本陽性，否則為陰性。本組擴(kuò)增產(chǎn)物在相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物片段處顯示清晰陽性條帶。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSSl5.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)及回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1化療前微轉(zhuǎn)移因子測定低分化腺癌微轉(zhuǎn)移因子檢測總陽性率85%(23/27)，其中hMAM陽性率51.8%，與VEGF和CK19陽性率比較差異有顯著性意義(P<0.01);中、高分化腺癌檢測總陽性率76%(16/21)。微轉(zhuǎn)移因子陽性率在病理分級中差異無顯著性意義(P>0.05)。病理分期Ⅲ期者微轉(zhuǎn)移因子檢測總陽性率87.1%(27/31)，明顯高于I～I(xiàn)I期的52.9%(9/17)，表明微轉(zhuǎn)移因子與乳腺癌分期有關(guān)，即分期越高陽性率越高，兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)，見表1。表1化療前外周血微轉(zhuǎn)移因子表達(dá)檢測結(jié)果例

3.2新輔助化療對微轉(zhuǎn)移因子的影響見表2。表2化療前后外周血微轉(zhuǎn)移因子變化

4討論

臨床研究證實(shí)，乳腺癌是全身性疾病，血行播散是乳腺癌轉(zhuǎn)移的途徑之一，檢測血循環(huán)中微轉(zhuǎn)移因子并給予有效治療是決定預(yù)后的重要因素。RTPCR是一種較為敏感的檢測技術(shù)，能快速擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性的mRNA表達(dá)，并可在107個(gè)單核細(xì)胞檢出1個(gè)克隆和10個(gè)乳腺癌細(xì)胞，其靈敏度可達(dá)(2～5)×107，并預(yù)示腫瘤的微小轉(zhuǎn)移[2]。抽取外周血比抽取骨髓方便,且易被患者接受。筆者采用RTPCR技術(shù)以腫瘤特異性CK19、VEGF和hMAM為靶RNA，檢測乳腺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移因子并結(jié)合新輔助化療探討其臨床意義。

用于乳腺癌微轉(zhuǎn)移指標(biāo)的RNA主要有組織特異性mRNA，如細(xì)胞角蛋白19、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、多形上皮黏蛋白的核心蛋白、人乳球蛋白(hMAM)和癌胚抗原等[3]。聯(lián)合其中的2～3項(xiàng)進(jìn)行檢測，可提高檢出率，減少假陰性。因此，篩選乳腺組織特異性標(biāo)志基因是提高微轉(zhuǎn)移檢測可靠性的關(guān)鍵。

本組結(jié)果顯示，48例化療前乳腺癌外周血中CK19、VEGF和hMAM表達(dá)總陽性率分別為為39.5%、47.9%和68.7%，其中低分化癌組中的hMAM陽性率為51.8%。文獻(xiàn)報(bào)道[4],hMAM表達(dá)總陽性率為53.3%，VEGF在III期中的表達(dá)為35.5%。本組檢出陽性率低于DeLuca等[5]報(bào)道的表皮生長因子受體mRNA在轉(zhuǎn)移性腫瘤中的檢出率59%。血液中陽性高度提示腫瘤組織中的表達(dá)，因此其有可能作為預(yù)后評價(jià)和輔助治療選擇(尤其針對表皮生長因子受體蛋白的單抗)及治療監(jiān)測的指標(biāo)。Stathopoulou等[6]用RTPCR檢測I、II期乳腺癌患者輔助治療前外周血的CK19mRNA陽性率為30%(本組為29.4%)，認(rèn)為CK19mRNA檢出與無瘤生存率和總生存率相關(guān)，是判斷預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。張新麗等[7]對血液中檢出微轉(zhuǎn)移陽性率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，0～I(xiàn)、II、III期之間有顯著差異(P<0.05)，顯示血液微轉(zhuǎn)移與腫瘤分期密切相關(guān)。本組結(jié)果顯示，微轉(zhuǎn)移因子陽性率在病理分級中無顯著性差異(P>0.05)，而分期越高陽性幾率越大，兩者比較有顯著性意義(P<0.05)。

筆者在對血液微轉(zhuǎn)移因子檢測的同時(shí)，選擇了具有代表性的化療方案和治療周期。1994年美國FDA批準(zhǔn)紫杉醇用于治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌，2000年批準(zhǔn)用于早期乳腺癌術(shù)后的輔助治療。研究結(jié)果顯示[8]，含紫杉醇組的5年無病生存率(DFS)和總生存率(0S)均有顯著改善，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低17%(P=0.0023)，死亡風(fēng)險(xiǎn)下降18%(P=0.0064)，從而確定了紫衫醇在早期乳腺癌治療中的地位。筆者選擇經(jīng)典的CAF和AT方案，實(shí)行2周給藥，觀察新輔助化療后血液中微轉(zhuǎn)移因子的變化。結(jié)果顯示，化療前微轉(zhuǎn)移因子陽性率在化療后均有不同程度降低。

化療前后的分子生物學(xué)檢測是反映腫瘤生物學(xué)特性的指標(biāo)，化療后這些指標(biāo)可能發(fā)生變化。若在治療前能獲得這些生物學(xué)信息，對判定預(yù)后和擬訂治療方案至關(guān)重要[9]。隨著檢測藥物療效的生物學(xué)指標(biāo)研究的深入，以及不斷探索、開發(fā)有效化療方案和藥物，合理應(yīng)用新輔助化療這一手段，可為患者選擇高效的個(gè)體化治療方案提供可靠依據(jù)。

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