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【摘要】目的分析小連翹(HyperioumssampsoniiHance)內(nèi)生真菌的分布特征和抗菌活性。方法采用內(nèi)生菌分離法分離菌株，雙培養(yǎng)法對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)定其抗菌性。結(jié)果從小連翹的根、莖、葉等不同的器官中分離得到81株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)鑒定分屬于4個(gè)目，5個(gè)科，26個(gè)屬，其中頭孢霉屬（Cephalosporiumsp.）和絲核菌屬（Rhizoctoniasp.）為優(yōu)勢(shì)菌群。不同部位內(nèi)生真菌的類(lèi)型、數(shù)量和分布存在差異，根部有31株，分屬于12屬；莖部有12株，分屬于10屬；葉部有38株，分屬于13屬。通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從小連翹所分離的內(nèi)生真菌中54.32%對(duì)某些植物病原真菌有拮抗活性。結(jié)論小連翹內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物中具有潛在活性物質(zhì)，值得深入研究。

【關(guān)鍵詞】?jī)?nèi)生真菌；小連翹；拮抗活性

StudiesoncommunitiesofendophyticfungifromHyperioumssampsoniiHanceandtheirantipathogenicactivitiesinvitro

Abstract:Theendophyticfungiwereisolatedandidentifiedmorphologicallyfromtheroots,stemsandleavesofHyperioumsSampsoniiHance.Eightyonestrainsofendophyticfungiwereisolatedandbelongedto26genera,5familiesand4orders.Cephalosporiumsp.andRhizoctoniasp.werethedominantgenera.Among81strains,31strainsof12generawereisolatedinroots,12strainsof10generainstems,and38strainsof13generainleaves.Theresultsshowedthatthequantity,population,anddistributionoftheendophyticfungivariedindifferentpositionsofHyperioumsSampsoniiHance.Inthedualculturetests,53.48%ofalltheisolatedEndophyticfungishowedantagonistictosomeplantpathogens.Theseendophyticfungiinsidetheplantshaveintimatecorrelationwiththeirhosts.Theseendophyticfungiandtheirmetabolitesmightplayanimportantroleintheplantsagainstthepathogens.

Keywords:endophyticfungi;HyperioumsSampsoniiHance;antipathogenicactivities

小連翹(HyperioumssampsoniiHance)，別名小翹、七層蘭、瑞香草、元寶草等，為多年生雙子葉植物藥藤黃科植物，味苦、性辛、平［1］。全草含鞣質(zhì)，有光致敏作用，動(dòng)物食后可產(chǎn)生皮炎；含小連翹堿(hypecorine)和小連翹次堿(hypecorinine)；花含金絲桃素(hepericin)［2］，有活血、止痛、調(diào)經(jīng)、止血、消腫之效；小連翹或其提取物作為有效藥物成分用于制備治療睡眠障礙、老年癡呆、記憶力減退等病癥的藥物［3］；同屬植物貫葉連翹，在西方國(guó)家稱(chēng)圣約翰草，用于治療憂(yōu)郁癥等疾病已有幾百年的歷史［4］。近年來(lái)的研究表明小連翹也具有抗憂(yōu)郁作用［5］。文獻(xiàn)報(bào)道，小連翹中含有聚（異）戊二烯二苯甲酮類(lèi)衍生物、萘駢雙蒽酮類(lèi)和黃酮類(lèi)等多種化學(xué)成分，這些成分是小連翹藥理作用的主要有效成分，但是要提取和分離這些藥物成分還有很多困難［6］。近來(lái)研究表明,某些藥用植物中個(gè)別內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或者相似藥理活性的成分［7］，由此對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌的研究引起人們的廣泛關(guān)注。如果在小連翹內(nèi)生真菌中能夠發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的活性物質(zhì)，無(wú)疑找到了一種可替代小連翹植物的新型生物資源。但是至今未見(jiàn)從小連翹中分離及其內(nèi)生真菌的種群多樣性的研究報(bào)道。本文對(duì)小連翹內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離和分類(lèi)鑒定，并對(duì)其種群多樣性及內(nèi)生真菌拮抗病原菌的活性的研究報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料分離所用材料為小連翹的根、莖、葉，采自中國(guó)科學(xué)院華南植物園（廣州）。采集其健康的組織，無(wú)其它病蟲(chóng)害，根、莖與葉分開(kāi)采集，放于密封袋中，于4℃存放，盡快進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。碘伏：威的牌消毒液，主要成份是聚乙烯吡咯烷酮碘（即碘伏），液體劑型，有效碘含量為0.5%，是一種新型的PVP-I消毒劑，深圳市新華鵬消毒劑有限公司生產(chǎn)。NS液：0.9%NaCl；ST液：0.9%NaCl，0.5%吐溫80；中和劑：0.9%NaCl，0.5%吐溫80，0.5%硫代硫酸鈉。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.0。在進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離時(shí)，向培養(yǎng)基中分別加入青霉素、鏈霉素至50μg/mL。

1.2供試菌株紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)、惡苗病菌(Fusariummoniliforme)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)由中山大學(xué)生命科學(xué)院微生物和生化教研室提供。

1.2方法

1.2.1植物材料的處理樣品采于2005年10月。樣品用自來(lái)水沖洗干凈后，取不同部位的莖或葉若干，剪成小塊，分別放于三角瓶中；加入碘伏消毒液（使用時(shí)有效碘濃度為2500mg·L-1），不斷搖動(dòng)，消毒5min。吸去消毒液，加入無(wú)菌ST液，蕩洗1min，吸去液體。重復(fù)一次。經(jīng)表面消毒后的樣品可用于接種。

1.2.2內(nèi)生真菌的分離、純化莖內(nèi)內(nèi)生真菌的接種：用無(wú)菌刀片削去莖的皮及已裸露的切面，然后切取約2～5mm的切片若干，先置于無(wú)菌平皿中。再將樣品置于無(wú)菌研缽中，加入石英砂和1mLST液，將樣品研成漿。取適量的漿液涂布于PDA平板。為了保證樣品有足夠的代表性，每個(gè)樣品要用若干段莖，一段莖僅涂一個(gè)平板，共需涂5～10個(gè)平板。根葉樣品的處理基本同莖。將涂布好的平板置于28℃培養(yǎng)，每隔12h觀(guān)察真菌菌落形成情況。培養(yǎng)基中一出現(xiàn)菌落，立即將此處的小塊瓊脂挖出，將平板再放回28℃培養(yǎng)10d，計(jì)數(shù)各平板上的菌落總數(shù)。挖出的含真菌的小塊PDA立即置于含PDA的小試管中培養(yǎng)，待真菌長(zhǎng)出后，再在PDA平板上采用菌絲頂端純化法逐步純化。待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長(zhǎng)出時(shí)間的不同，分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新的平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)。在培養(yǎng)數(shù)日后，觀(guān)察菌落的形態(tài)及其菌落邊緣的整齊情況，并做相應(yīng)的記錄，包括影象記錄，對(duì)菌株編號(hào)后，轉(zhuǎn)至PDA斜面培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7d，然后放入4℃冰箱保存。

1.2.3表面消毒效果檢測(cè)表面消毒后的樣品于5mL無(wú)菌水中振蕩1min，取0.3mL懸液涂布于PDA平板上，在28℃培養(yǎng)，記錄是否有真菌生長(zhǎng)。另外，采用存活試驗(yàn)觀(guān)察表面消毒效果，即將分離的內(nèi)生真菌菌苔經(jīng)過(guò)各自表面消毒程序處理后，再接種到PDA平板28℃培養(yǎng)后，觀(guān)察是否生長(zhǎng)。

1.2.4菌種鑒定從純化培養(yǎng)數(shù)日的菌落上挑取菌絲并連同分生孢子制成玻片，置于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察菌絲形態(tài)、孢子梗形態(tài)、孢子形態(tài)以及孢子與營(yíng)養(yǎng)體之間的著生關(guān)系，對(duì)照有關(guān)資料確定真菌的分類(lèi)學(xué)地位［8］。

1.2.5對(duì)峙試驗(yàn)將4種植物病原菌(紋枯病菌、稻瘟病菌、白葉枯病菌、惡苗病菌)接種于平板中央，內(nèi)生真菌接種于平板邊緣，28℃培養(yǎng)，觀(guān)察病原菌菌落周?chē)淖兓?/p>

2結(jié)果

2.1表面消毒效果表面消毒后的樣品振蕩液0.3mL分別涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2周后無(wú)菌落長(zhǎng)出，同時(shí)10株分離的代表性真菌菌苔分別經(jīng)過(guò)消毒過(guò)程處理后接種到PDA平板上，28℃培養(yǎng)2周后，沒(méi)有觀(guān)察到菌落生長(zhǎng)。表明經(jīng)過(guò)樣品消毒處理過(guò)程，樣品表面附生菌的影響已消除，分離的菌株來(lái)自于樣品內(nèi)部，與植物組織結(jié)合緊密。

2.2小連翹內(nèi)生真菌種群組成從植物小連翹分離獲得內(nèi)生真菌共81株。經(jīng)顯微形態(tài)觀(guān)察鑒定為4個(gè)目，5個(gè)科，26個(gè)屬（見(jiàn)表1）。從表1可以看出，植物小連翹內(nèi)生真菌中，從目的分類(lèi)水平上以叢梗孢目(Moniliales)和無(wú)孢菌群(Myceliasterilia)為優(yōu)勢(shì)菌群，分別為50株和23株占總菌株數(shù)的61.7%和28.4%；在屬的分類(lèi)水平上以頭孢霉屬（Cephalosporiumsp.）和絲核菌屬（Rhizoctoniasp.）為優(yōu)勢(shì)菌群，分別為20株和16株，占總菌數(shù)的24.7%和19.7%。

2.3植物小連翹不同部位內(nèi)生真菌的分布對(duì)小連翹根莖葉內(nèi)生真菌的種類(lèi)，數(shù)目和分布部位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1小連翹植物內(nèi)生真菌種群組成（略）

Tab.1ThecomposingofendophyticfungiinHyperioumssampsoniiHance

從表2中看出，從小連翹植株內(nèi)分離的81株內(nèi)生真菌的分布各有特點(diǎn)，根部分布有31株內(nèi)生真菌(占總數(shù)的38.2%)，隸屬于12個(gè)屬(占26個(gè)屬的46.2%)；莖部分布有12株內(nèi)生真菌(占總數(shù)的14.9%)，分屬于10個(gè)屬(占26個(gè)屬的38.5%)；從葉部分離出的38株內(nèi)生真菌(占總數(shù)的469%)，分屬于13個(gè)屬(占26個(gè)屬的50%)。由此可知，小連翹的內(nèi)生真菌主要存在于植株的葉和根中，莖部組織中分離到的內(nèi)生真菌相對(duì)較少。從根莖葉中分離到的內(nèi)生真菌的種屬分布來(lái)看，頭孢霉屬（Cephalosporiumsp.）在葉部、根部和莖部都有分布，說(shuō)明頭孢霉屬（Cephalosporiumsp.）不僅是葉部的優(yōu)勢(shì)種群，而且也是整株小連翹植物內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種群。絲核菌屬（Rhizoctoniasp.）僅在根部分布，是根部的優(yōu)勢(shì)種群，占根部所有分離到的內(nèi)生真菌的51%。另外，短梗霉屬（Aureobasidiumsp.）、鞘孢霉屬（Chalarasp.）、束絲菌屬（Ozoniumsp.）也只在根部分布；而串珠孢霉屬（Moniliasp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）、粘帚霉屬（Gliocladiumsp.）、痕格霉屬（Sirosporiumsp.）、彎孢霉屬（Curvulariasp.）、毛殼菌屬（Chaetoniumsp.）和直毛殼菌屬（Ascotrichasp.）的內(nèi)生真菌只在葉部分布，而葉組織內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種也和根部不同，頭孢霉屬和痕格霉屬內(nèi)生真菌是葉部的優(yōu)勢(shì)菌群；從莖部分離的內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌群不明顯，其中分離到的木霉屬（Trichodermasp.）、黑孢霉屬（Nigrosporasp.）、芽枝霉屬（Cladosporiumsp.）內(nèi)生真菌只在莖部分布。結(jié)果表明，小連翹根莖葉組織的不同部位所分離到的內(nèi)生真菌的數(shù)量不同，所分離到內(nèi)生真菌的分布和優(yōu)勢(shì)種群也存有差異。

表2小連翹植物內(nèi)生真菌數(shù)量與分布（略）

Tab.2ThenumberanddistributionofendophyticfungispeciesinHyperioumssampsoniiHance

2.4內(nèi)生真菌對(duì)植物病原菌的拮抗作用通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)分別對(duì)從小連翹中所分離的81株菌對(duì)植物病原菌紋枯病菌（立枯絲核菌）(Rhizoctoniasolani)、白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)、惡苗病菌(Fusariummoniliforme)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn),從小連翹中分離的81株內(nèi)生真菌中共有53株對(duì)一種或多種病原菌有拮抗作用(占總分離株數(shù)的52.48%)。其中對(duì)惡苗病菌有抑菌作用的有23株，對(duì)白葉枯病菌有抑菌作用的18株,對(duì)紋枯病菌有抑菌作用的有12株，對(duì)棉花枯萎病菌有抑菌作用的有4株。這表明多數(shù)小連翹內(nèi)生真菌具有抗植物病原菌的功能，在小連翹中存在著廣泛的抗菌生物活性資源。

A.內(nèi)生真菌J-53拮抗紋枯病菌;B.內(nèi)生真菌f-55和f-166拮抗惡苗病

Dualculturebetweenendophytesandpathogens

3討論

從近年來(lái)的研究看，植物體中存在內(nèi)生真菌是普遍的。內(nèi)生菌系統(tǒng)地分布于植物體根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等器官、組織的細(xì)胞或細(xì)胞間隙。有報(bào)道說(shuō)，內(nèi)生真菌菌絲在宿主植物的葉鞘和種子中含量最多，而葉片和根中含量極少［9］。但是也有報(bào)道，根和葉內(nèi)生真菌含量較多［10］。不同的植物可能具有的內(nèi)生真菌的種類(lèi)和數(shù)目相差很大。我們從中藥植物小連翹的根、莖、葉共分離出81株內(nèi)生真菌，分屬于4個(gè)目，5個(gè)科，26個(gè)屬。頭孢霉屬（Cephalosporiumsp.）在小連翹根、莖、葉內(nèi)生真菌的分離過(guò)程中都得到，它既是葉內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群也是整個(gè)植物的優(yōu)勢(shì)菌群；絲核菌屬（Rhizoctoniasp.）分離獲得的數(shù)量比較多，但是它僅僅是根內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群。植物內(nèi)生真菌生活在活體植物組織中，其生長(zhǎng)代謝受多方面因素制約，不僅受到宿主植物的影響，外界環(huán)境因子也是其重要影響因素。外界環(huán)境變化直接影響植物生長(zhǎng)代謝，間接影響到植物內(nèi)生菌生物多樣性與生長(zhǎng)代謝。從小連翹的根、莖、葉不同部位分離的內(nèi)生真菌在數(shù)量、種類(lèi)有很大的差異。小連翹的大部分內(nèi)生真菌主要存在于葉和根部，而莖中相對(duì)很少，這表明不同的內(nèi)生菌在植物不同器官和組織中占據(jù)不同的生態(tài)位。其原因可能是由于不同部位的微環(huán)境如通氣狀況、生物酶和其他化學(xué)成分的不同，從而適合不同種屬的內(nèi)生真菌類(lèi)群的侵入和生長(zhǎng)。迄今的研究表明，植物內(nèi)生菌與宿主發(fā)生聯(lián)系時(shí)，對(duì)宿主有以下影響：可增強(qiáng)宿主的抗病性、提高植物的生產(chǎn)力［11］、抗逆抗蟲(chóng)［12］、具有除草劑活性［13］等。內(nèi)生真菌對(duì)宿主的作用機(jī)制可能是由于內(nèi)生菌在植物體內(nèi)繁殖和生長(zhǎng)，并產(chǎn)生豐富多樣具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，從而在一定程度上調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和代謝。通過(guò)對(duì)峙試驗(yàn)研究小連翹內(nèi)生真菌對(duì)紋枯病菌、白葉枯病菌、惡苗病菌和棉花枯萎病菌等植物病原菌的拮抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小連翹內(nèi)生真菌中多數(shù)種類(lèi)（約52.48%）能夠抑制一種或者多種病原菌的生長(zhǎng)，這表明小連翹內(nèi)生真菌中存在著廣泛的抗菌生物活性資源，這些內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物在植物對(duì)抗病原菌的過(guò)程中占有一定的地位。由此可見(jiàn)，藥用植物內(nèi)存在著廣泛的內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生真菌可能成為生物防治中有潛力的生物因子，在生態(tài)農(nóng)業(yè)和生物農(nóng)藥研制方面具有重要的用途。研究?jī)?nèi)生真菌的各種次生代謝產(chǎn)物及其作用機(jī)制，在農(nóng)業(yè)和（或）醫(yī)藥業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力。研究和開(kāi)發(fā)植物內(nèi)生真菌，從而為尋找植物病害的抗菌藥用資源提供了一條新的途徑。

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