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【關(guān)鍵詞】吳茱萸

【摘要】目的觀察單味中藥對子宮肌瘤之影響。方法應(yīng)用terazolium(MTT)反應(yīng)法,針對傳統(tǒng)中藥以50%乙醇之萃取物進行子宮肌瘤細胞生長抑制試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20種單味中藥(吳茱萸,王不留行,水蛭等)對子宮肌瘤細胞抑制率較正常子宮細胞明顯增高。結(jié)論子宮肌瘤細胞半致死量濃度(IC50)之測定,較正常子宮細胞為低,顯示這些中藥對子宮肌瘤細胞較為敏感,應(yīng)可經(jīng)由細胞凋亡的途徑,而抑制子宮肌瘤細胞生長。

【關(guān)鍵詞】王不留行；吳茱萸；水蛭；生黃芪；子宮肌瘤細胞；細胞凋亡

EffectsofChineseherbonmyoma

【Abstract】ByobserveinourthaditionalChineseHerbscureMyomaoftheuterusrepressgrowingtest.MethodsUseoftetrazolium(MTT)inourtraditionalChinese50%alcoholnaturalproductsrepreessgrowingtestthoseherbsaremoreeffectiveinrepressMyomacell.ResultsWefound20kindsofChineseHerbs(EvodiaeFeuctur,VaccariaeSemen,Hirudo，etc),thoseherbsaremoreeffectiveinrepressMyomacellthannormalMyomacell.ConclusionWeconcludethatDi-DargTangandVaccariaseediswelltolerated,safe,andeffective;ThetestshowsthatthoseherbsaremoresensitiveonMyomacell,Bcl-2proteincanrepressMyomacellbyapoptosis.

【Keywords】vaccariaesemen;evodiaefeuctus;hirudo;astragaliradix;myomacell;apoptosis

子宮肌瘤是婦科最常見的良性腫瘤,由平滑肌纖維和結(jié)締組織組成,所以臨床上又稱子宮纖維瘤。子宮肌瘤好發(fā)于20～50歲的婦女,其中年齡＞40歲的婦女約有50%患有子宮肌瘤,但Cramer和Patel經(jīng)尸體解剖(autopsy)的統(tǒng)計后認為子宮肌瘤的發(fā)生率高達75%［1］。

對于一個不需再生育的婦女而言,全子宮切除(totalhystectomy)是治療子宮肌瘤的方法之一,然而臺灣地區(qū)子宮切除術(shù)是否有過于泛濫的情形常受質(zhì)疑。有研究指出臺灣地區(qū)子宮切除率以臺北、臺中、高雄為高。變異大多可由醫(yī)療資源分布解釋,而子宮切除年齡最高分布在40～44歲占29.9%。除癌細胞病變外,以生殖器脫垂的病變?yōu)樽罡?這可以由醫(yī)療不適當性解釋［2］。因而子宮切除的適當性除須由專家審視外,如果能有更多其他替代療法,也是對婦女的一種保障。

子宮肌瘤真正形成的原因,至今尚不清楚,但有不少研究認為雌激素(estrogen)與黃體素(progesterone)與子宮肌瘤的生長有密切關(guān)系,這些激素又必須透過生長因子(growthfactor)才能運作［3］，而人絨毛膜促性腺激素(human，HCG)也能調(diào)節(jié)生長。黃體素可刺激子宮肌瘤上皮生長因子(epidermalgrowhfactor)產(chǎn)生，造成子宮肌瘤的增生和分化。子宮肌瘤雖然是由單一的細胞突變開始,而雌激素可增加雌激素接受體(estrogenreceptor,ER)與黃體素受體(progsteronereceptor,PR)也可促進子宮肌瘤的增生。黃體素則對突變的正常子宮細胞有加速分裂和增生的作用［4］。

性腺激素釋放激素強化物(GnRHa)是經(jīng)由降低GnRH接受體而使性腺分泌減少,進而使卵巢分泌雌激素和黃體素減少,而抑制子宮肌瘤生長［5］。根據(jù)國內(nèi)研究,GnRHa在連續(xù)注射到12周時,達到最大的療效,大部分的子宮肌瘤會縮小為原來的一半?？s小的百分比和未結(jié)合PR濃度成反比,而和未結(jié)合ER關(guān)系不大。因此GnRHa可縮小子宮肌瘤,部分取決于子宮肌瘤上未結(jié)合性激素接受體濃度所影響［6］。

子宮肌瘤屬于中醫(yī)醫(yī)學(xué)“積聚”“瘕”范圍,瘕是泛指腹腔內(nèi)的有形腫塊而言,所謂者,是指腹腔內(nèi)有形的腫塊,有一定的部位,屬血病。所謂瘕者,是指腹腔內(nèi)無形的氣塊,無一定的部位,屬氣病?！秲?nèi)經(jīng)・靈樞・水脹篇》謂;“石瘕生于胞中,寒氣客于子門,子門閉塞,氣不得通,惡血當瀉不瀉,以留止,日益以大,狀如懷子,月事不以時下,皆生于女子,可導(dǎo)而下”?！缎ＷD人良方》謂“婦人腹中瘀者,由月經(jīng)閉積,或產(chǎn)后血未盡,或風寒滯瘀,久而不消,則為積聚瘕矣”。因此中醫(yī)認為,六淫之邪,七情內(nèi)傷,引起臟腑功能失調(diào),氣血不合,以致氣滯血瘀,新血與舊血凝聚成塊,結(jié)于胞室,日益長大而成子宮肌瘤。

子宮肌瘤臨床表現(xiàn)為月經(jīng)過多,經(jīng)期延長,周期縮短,或不規(guī)則子宮出血,常會伴有不同程度的貧血。中醫(yī)認為,臟腑不合,氣滯血瘀,沖任失調(diào)是本病的主要原因,臨床上可以辨證分型治療。本病是以子宮出血為主要臨床癥狀,病久失血,而導(dǎo)致氣血兩虛,在治療時,除出血期以化瘀止血、平時破瘀消外,還必須結(jié)合補益氣血。對于瘕的治法,《內(nèi)經(jīng)》提出“堅者削之,結(jié)者散之,留者攻之,滯者導(dǎo)之”的原則;《女科經(jīng)綸》：“善治瘕者,調(diào)其氣而破其血,消其食而豁其痰,衰其大半而止”。

漢方醫(yī)學(xué)已有數(shù)千年之歷史,而且是累積經(jīng)驗的循證療法之一,由于化學(xué)藥物引起的藥害,以及食品添加物或清潔劑引起的公害等,引起人們對利用自然藥物的興趣,紛紛把目光轉(zhuǎn)向天然中藥。依據(jù)漢方的思想,絕大多數(shù)的婦女疾病是屬于體內(nèi)“血”的異常,中醫(yī)所謂的“血”,不單是指血液,也包括淋巴液或激素作用。中醫(yī)對女性的生理及病理獨具慧眼,其用藥經(jīng)驗可以說是數(shù)千年來累積而成。

中藥的運用是幾千年來前人智慧結(jié)晶所在,其內(nèi)容相當豐富且千變?nèi)f化。從《內(nèi)經(jīng)》、《傷寒論》始,前人從藥物的升降浮沉,四氣五味,虛實補瀉,臟腑歸經(jīng),針對人體陰陽表里,寒熱虛實,把數(shù)百種藥物歸納,依據(jù)理論用于臨床。

本研究已建立細胞模式,以期能從天然產(chǎn)物中找出明確具有治療子宮肌瘤之中藥,為醫(yī)師臨床用藥提供參考,造福更多的婦女。1實驗材料

1.1中藥材來源本項研究所測試的中藥材來自臺北南京泰生堂參藥有限公司,實驗中藥材見表1。

表1單味藥材50%酒精之萃取率略

1.2儀器(1)回轉(zhuǎn)式真空減壓濃縮機(SwitzerlandBUCHIRE111);(2)離心機Centrifuge5415C(Eppendorf);(3)冷凍干燥機(Eyela;CoolAce.CA-105);(4)微量電子天秤(Shimazu,LibrorACF-200)；(5)顯微鏡(Olympus,Tokyo)；(6)二氧化碳培養(yǎng)箱(EspecBNA-211)；(7)血細胞計數(shù)器(Hemocytometer;Bright-line)；(8)組織培養(yǎng)角瓶(Corning)；(9)組織培養(yǎng)皿(Falcon)；(10)96-Well組織培養(yǎng)盤(Corning)；(11)微量吸管(Biohit)；(12)高溫滅菌器(Tomin1MedicalEquipmeneCo,LTD;TM-325)；(13)過濾膜(Coming)；(14)-80℃冰箱(EnviromentalEquip.Co;So-Low)。

1.3子宮肌瘤細胞由榮民醫(yī)院婦產(chǎn)科提供病理檢體。當患者在婦產(chǎn)科門診,以內(nèi)診與超聲波掃描確診為子宮肌瘤,依臨床路徑安排入院手術(shù)治病者,以做本研究之素材。即由此類患者在手術(shù)切除后,立即切取肌瘤組織,放入轉(zhuǎn)輸液(DMEM)中,送實驗室做組織培養(yǎng)。

1.4試藥與試劑

1.4.1培養(yǎng)液（1）DMEM(Dulbecco’sMinimumEssentialMedium)；（2）FetalBovineSerum(Hyclone:CatNo.1115-L)；（3）Penicillin-Strepetomycin(Seromed:CatNo.03-033-1B)；（4）L-Glutamine(Seromed:CatNo.0020-1B)；（5）NAA(Mem-EagleNon-essentialAminoAcidsSolution)；（6）L-Glutamine200mM(Gibco:CatNo.25930-081)。

1.4.2染色劑（1）Trypanblue(Sigma)；（2）MTT:{3(4,5-dimethylthiazoled1-2-y1)-2,5-dipheyltetrasoliumbromide}(BoehringerMannheimGmbKCatNo.1465007)。

1.4.3一般化學(xué)藥品（1）DMSO(Merck,Germany,K23951931,Max0.05%H2O)；（2）SodiumHydrogenCarbonate(Merck,Germany,NaHCO3;Proanalysis)；（3）Isopropanol(Merck,Germany)。

1.4.4測試藥品與酵素（1）B-Estradiol(SigmaUSA)E-2758Lot79H0941；（2）Progesteronl(SigmaUSA)P-8783Lot80K0885；（3）Trypsin,2.5%(SigmaUSA)Lot1077108；（4）Trypsin-EDTA(SigmaUSA)Lot1089908；（5）LSAB(Dako,Denmark,CodeNo.K0675)；（6）MonoclonalAnti-HumanProgesteronereceptors(Dako,Denmark,clonepgR636,1:50)。

2實驗方法

2.1單味藥之制備將單味藥經(jīng)粉碎后,加十倍重量之50%酒精,60℃水浴回流抽取2h,趁熱過濾。同法兩次后合并濾液經(jīng)減壓濃縮制約1/10體積量。經(jīng)冷凍干燥得粉末狀濃縮物,其產(chǎn)率見表1所示,將冷凍粉末置于20℃冰柜中以備下列實驗使用。

2.2一般溶液之配制

2.2.1PBS(phosphatebuffersolution)之配制將KCl0.2g，NaCl3.0g，NaH2PO4・7H2O2.16及KH2PO40.2g溶于次蒸餾500ml中,高壓減菌后使用。

2.2.2MTT配制方法稱取MTT5mg溶于10ml成濃度500μm,制完全溶解后以0.22μm之過濾膜過濾。

2.3檢測藥物之制備實驗前將冷凍干燥之各種藥品精稱10mg,以1mlDMSO溶解,再用研缽細磨后,以0.22μmmicrofilterunit過濾,分別調(diào)制成濃度為10mg/ml之stocksolution。每次檢測時,加入2μlstocksolution于每孔含198μl培養(yǎng)液中,使最后單位藥之濃度100μg/ml。

2.4試驗細胞之制備

2.4.1子宮肌瘤和正常子宮組織從榮民醫(yī)院手術(shù)室取出后,置于含DMEM的試管中,以冰塊冷凍帶回實驗室,于1h內(nèi)切碎進行組織培養(yǎng)。

2.4.2子宮肌瘤和正常子宮組織將其分別切成1mm之小塊,加入1.5mg/mlcollagenasetypeⅡ和0.25%trypsin各3ml,于37℃。4h后呈黏稠狀,用膠吸管打散細胞(pipetting),經(jīng)離心(1200r,4℃,5min)去上清液。加入DMEM,再離心后去上清液。加入5mlDMEM均勻分布于培養(yǎng)皿,2天換一次培養(yǎng)液,于5%CO237℃培養(yǎng)7～14天。待細胞生長形成單層細胞(monolayer)細胞數(shù)約1×106cells/ml既可使用。

2.5試驗細胞之染色將初代培養(yǎng)的子宮肌瘤細胞和正常細胞,培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中,利用免疫組織化學(xué)方法,經(jīng)染色、照相后,作為試驗細胞鑒別區(qū)分之用。組織培養(yǎng)之新鮮標本于培養(yǎng)基中,以PBS溶液清洗,再以0.03%過氧化氫溶液浸泡30min,經(jīng)PBS溶液清洗10min,接著進行免疫化學(xué)染色,所使用的單株抗體為抗人類黃體素接受抗體(monoclonalanti-humanprogesteronereceptorsantibody)。以適當濃度之單株抗體與培養(yǎng)細胞作用約1h,經(jīng)PBS溶液洗10min后,以經(jīng)生物素標示之二次抗體(biotinylatedsecondaryantibodies)作用30min,在經(jīng)PBS溶液清洗10min后,以經(jīng)具有過氧化酶之卵蛋白作用30min,經(jīng)PBS溶液清洗10min后,以呈色劑(DAB,3,3-diaminobenzidine)呈色5min,以PBS溶液清洗,以蘇木精做對比染色,之后置于鏡下觀察照相［7～9］

2.6Bcl-2蛋白之制備利用0.25%trypsin將細胞處理成懸浮液后,將細胞稀釋成2×106cells/ml。各取出1ml植入6孔培養(yǎng)盤中,使每孔約含2×106個細胞,放入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。次日,細胞生長形成單層細胞(monolayer)后,倒掉培養(yǎng)液,更換新鮮培養(yǎng)液后備用。同時各孔加入estradiol或progesterone(stocksolution濃度各為10μg/ml、100μg/ml)(13)1μl后24h,再加入中藥(stocksolution濃度為10mg/ml)10μl使?jié)舛瘸蔀?00μg/ml。24h后沖下細胞,離心(12000r）20min去上清液后加RIPA30μl備用。第一組Estradiol(10ng/ml)；第二組Estradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三組Estradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四組Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五組Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六組對照組。

2.7Westernblot分析法［10，11］利用BioquantProtein(200μl)將細胞萃取物定量,按比例取出加入proteindye3μl。將Totalproteinloading至10%SDS-PSGE后,以80V電泳3h,利用電轉(zhuǎn)印槽(Electrotransfertank)以270mA1h,將蛋白質(zhì)面SDS-PAGE轉(zhuǎn)至PVGEmembrane后,加入Blockingsolution(1%BovineserumBSA)1h,分別加入Bcl-2rabbitpolyclonalIgG,α-tubulinmousemonoclonalIgM(1∶1000)4℃置1夜,再以PBST清洗,分別加入anti-rabbitIgG和anti-mouseIgG(1∶5000)1h后,再以PBST清洗后加呈色劑至呈色為止,再以清水洗去呈色劑后曬干。

2.8半致死量濃度(Theconcentrationof50%inhibition,IC50）之測定實驗前將冷凍干燥之各種藥品分別經(jīng)稱2、4、6、8、10、12、14、16mg以DMSO1ml溶解,再用研缽細磨后,以0.22μlmicrofilterunit過濾,分別調(diào)至成不同濃度之stocksolution。每well加入stocksolution2μl于含198μl培養(yǎng)基中,使最后中藥濃度為40、80、120、160、200、240、280、320mg/ml。第二天觀察細胞生長情形,進行Tetrazolium反應(yīng)法(MTTassay,計算其IC50）。

2.9細胞毒殺百分率之計算公式CI%=1-(實驗組之OD值/對照組之OD值）×100%。

2.10統(tǒng)計學(xué)方法各藥物之抑制率分別以平均標準偏差(Mean±SD)表示之,統(tǒng)計皆用student’st-test方法計算。

3實驗結(jié)果

單味藥對子宮肌瘤細胞和正常細胞毒性百分比(CytotxicityIndex)之比較;在20種單味藥中，王不留行、吳茱萸、生雞內(nèi)金、水蛭(100μg/ml)對子宮肌瘤的細胞毒性百分比(CytotoxityIndex)較正常細胞高很多,見表2～4、圖1。

圖1中藥對子宮肌瘤細胞毒性百分比

表2單味藥對正常細胞和子宮肌瘤細胞的細胞毒性百分比（略）

表3王不留行對不同濃度子宮肌瘤細胞毒性百分比（略）

表4王不留行對子宮肌瘤細胞之IC50略

半致死量濃度在不同細胞之測定結(jié)果,王不留行汲水置在子宮肌瘤細胞的濃度,都小于正常細胞的濃度,顯示子宮肌瘤細胞對于這些中藥較為敏感,也較正常細胞有效。

Bcl-2蛋白質(zhì)Westernblot分析法結(jié)果：正常子宮細胞和子宮肌瘤細胞在Estradiol(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2的變化。Myometriumcell和Myomacell的第二組比第三組顏色較淡,第五組比第四組顏色較淡,顯示Bcl-2較少。子宮肌瘤中Bcl-2protein受Progesterone(100ng/ml)刺激而增加,受Estradiol(10ng/ml)刺激而減少,因此第四組顏色要比第三組深,Bcl-2顯示溶媒對實驗結(jié)果影響不大,正常子宮細胞和子宮肌瘤細胞各有六組;第一組Etradiol(10ng/ml)；第二組Etradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三組Etradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四組Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五組Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六組對照組。

子宮肌瘤細胞加入王不留行的Bcl-2測定：正常子宮細胞和子宮肌瘤細胞在Estradio(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2蛋白質(zhì)的變化Myometrium和Myomacell的Westenblot第二組。第五組色較淡,顯示Bcl-2較少。

4討論

在本實驗中單味藥三菱、莪術(shù)、生雞內(nèi)金、水蛭對子宮肌瘤的細胞毒性百分比反而比正常細胞較低。三菱、莪術(shù)辛苦,性平和,入肝、脾二經(jīng)能入血分以破血瘀,又能走氣分以氣消積,可抑制血小板聚集及血栓形成,也可擴張血管改善微循環(huán)。生雞內(nèi)金、水蛭主術(shù)惡血、瘀血、月閉,破血瘕積聚。生雞內(nèi)金不僅能加強消積化瘀之功效,亦顧護脾胃,亦可以散血去瘀、消腫定痛,水蛭會產(chǎn)生類似前列腺環(huán)素(prostacyclin,PGI2)可抑制血小板凝集、降低血壓并釋放出胞漿素原(plaminogen)［12］。

王不留行有催乳通經(jīng)、消腫止痛的功能,臨床上用于乳痛、睪丸炎、流行性腮腺炎。其禁忌走而不守,血證慎用,孕婦忌用。其所含王不留行皂苷(Vacsegoside),經(jīng)酸水解可生成王不留行次皂苷(Vaccaroside)及黃酮類(Saponaretin)、棉子糖(Raffinose)、香豆素、蛋白質(zhì)等。在藥理作用上具有抗早孕作用,可增加血漿和子宮組織cAMP,有抗感染作用可抑制前列腺增生,具有類似雌激素功用,對切除卵巢之白鼠可產(chǎn)生作用［13～15］。

細胞凋亡(apoptosis)在除去功能不良的細胞上扮演重要角色,而Bcl-2protein可經(jīng)由一些growthfactor改變合成速率,進而抑制細胞凋亡［16～18］。Bcl-2protein是一種抑制細胞凋亡基因產(chǎn)物,在子宮肌瘤中正常細胞為多。子宮肌瘤中Bcl-2protein受Progesterone(100ng/ml)刺激而增加,受estradiol(10ng/ml)刺激而減少,但在本實驗中,其增加或減少的程度并不如王不留行減少的程度來的明顯。經(jīng)由細胞凋亡而殺死肌瘤細胞,比傳統(tǒng)藥物所引發(fā)的細胞壞死(necrosis),較不易引發(fā)大范圍的周邊組織發(fā)炎或感染反應(yīng),避免對于患者產(chǎn)生更大地傷害［18］。

5結(jié)論

藥理實驗和臨床效果可能會有些差異,可能是由于藥物在體內(nèi)吸收、代謝加上相加、相克效應(yīng)而有不同的反應(yīng),因此要發(fā)展改進實驗?zāi)Ｊ?使其更加接近中醫(yī)辨證的實際狀。

經(jīng)由細胞毒性抑制率實驗結(jié)果得知,單味藥中以吳茱萸、王不留行、生雞內(nèi)金和水蛭效果最好。由半致死量濃度IC50在不同細胞之測定結(jié)果,更可得知這些中藥對于子宮肌瘤細胞較為有效。

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