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致病性測定依據(jù)Koch法則，將菌株Sr－1的菌核在PDA平板上28℃培養(yǎng)10d，待產(chǎn)菌核。分別用菌餅（直徑5mm）和菌核刺傷、自然無傷接種健康芝麻植株根部［3］，即取菌餅和菌核分別貼于根部人工十字劃傷處和自然無傷處，以接種PDA培養(yǎng)基為空白對照，并外加浸有無菌水的棉球保濕，置于自然環(huán)境下培養(yǎng)（25～30℃）。每處理3次重復，共接種15株。3d后觀察發(fā)病情況，并描述癥狀。將發(fā)病的植株帶回實驗室，剪取前沿病部組織，保濕培養(yǎng)，誘導菌核產(chǎn)生。然后將菌核用75％酒精處理10s，0．1％升汞消毒3min，無菌水沖洗3次后置于PDA平板上28℃培養(yǎng)，獲得再分離菌株，觀察再分離菌株的菌落與菌核形態(tài)，并與原接種菌株Sr－1在相同培養(yǎng)條件下進行比較。

病原菌鑒定

形態(tài)學鑒定將菌株Sr－1的菌核接種在PDA平板上，28℃培養(yǎng)3d，觀察菌落形態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)10d后，用數(shù)顯游標卡尺隨機測量100粒成熟菌核的直徑，并記錄菌核形成過程的形狀、大小、色澤等，光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

分子鑒定DNA的提取按以下方法進行：將菌株Sr－1的菌核接種在PDA平板上，28℃下培養(yǎng)3d，用5mm的打孔器在菌落邊緣切取菌餅，移接至100mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）中，28℃靜止培養(yǎng)5d。將菌絲體用滅菌漏斗（內(nèi)墊3層滅菌擦鏡紙）過濾，去除液體培養(yǎng)基，并用滅菌水沖洗菌絲體2～3次。用SDS法提取菌株Sr－1的基因組DNA：挑取適量菌絲體于滅菌的研缽中，加入適量SDS裂解液［配方：200mmol／LTris－HCl（pH7．5）、25mmol／LEDTA（pH8．0）、250mmol／LNaCl、0．5％SDS］充分研磨（研磨過程盡量不起泡），轉移適量菌絲體研磨液于EP管中，65℃水浴50min，每隔10min上下顛倒數(shù)次；加入5mol／L的醋酸鉀，4℃、12000r／min離心10min，取上清；加入1／2上清體積的Tris飽和酚（北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)）振蕩后靜置30～60s，再加入1／2體積的氯仿振蕩，4℃、12000r／min離心10min，取上清，用等體積氯仿重復抽提2次；加入0．6倍體積異丙醇和0．1倍體積的醋酸鈉充分振蕩，放置冰箱－20℃沉淀30min之后，4℃、10000r／min離心10min，棄上清。用75％乙醇清洗沉淀2次，無水乙醇清洗1次，開口放置3～4h。晾干后加入50μL的雙蒸水溶解沉淀，置于－20℃冰箱備用。用真菌核糖體基因內(nèi)轉錄間隔區(qū)（rDNA－ITS）通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）（由大連寶生物有限公司合成）對菌株Sr－1的基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應體系（總體積50μL）：ddH2O19μL、ITS1與ITS4各2μL，DNA模板（菌株Sr－1基因組DNA）2μL，2×PCRMasterMix［天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)］25μL。擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性40s；54℃退火40s；72℃延伸45s，32個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取5μLPCR擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，以200bpDNALadder（天津博美科生物技術有限公司生產(chǎn)）作為DNA分子量標準，5V／cm電泳后，用溴化乙錠染色20min，于凝膠成像系統(tǒng)（型號：GelDocXR，美國Bio－Rad公司生產(chǎn)）中觀察、記錄電泳結果。委托上海英駿生物技術有限公司對擴增的菌株Sr－1的rDNA－ITS片段進行純化和測序后，通過NCBI網(wǎng)站（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／）上的BLAST程序與相關真菌的rDNA－ITS序列進行同源性比較，并用軟件MEGA5．1Beta2構建基于rDNA－ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，對菌株Sr－1進行分子鑒定。

生物學特性測定

溫度對病原菌生長及菌核形成的影響將菌株Sr－1的菌核接在PDA平板上28℃培養(yǎng)3d后，用內(nèi)徑5mm的打孔器從菌落邊緣切取菌餅，接于PDA培養(yǎng)基平板中央，將PDA平板分別放置于4℃、7℃、10℃、13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃的系列溫度梯度下培養(yǎng)，每處理設3個重復。3d后用十字交叉法測量菌落直徑，并計算3個重復的平均值，平均值減去5mm作為病原菌實際生長的菌落直徑。10d后記錄產(chǎn)生的菌核數(shù)量，并用數(shù)顯游標卡尺（GB／T14899－94，桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司生產(chǎn)）測量菌核直徑。

方法將菌株Sr－1接于pH為4．0、4．5、5．0、5．5、6．0、6．5、7．0、7．5、8．0、8．5、9．0的100mLPDB液體培養(yǎng)基中［4］，28℃下靜止培養(yǎng)5d，真空抽濾去掉培養(yǎng)液，40℃烘干12h后稱菌絲體干重。每處理3次重復。

碳、氮源對病原菌生長及菌核形成的影響基礎培養(yǎng)基配方：磷酸二氫鉀1g、氯化鉀0．5g、硫酸鎂0．5g、硫酸鐵0．01g、瓊脂粉17g、水1000mL。測試不同碳源時，在1000mL基礎培養(yǎng)基中加入2g硝酸鉀作為氮源，再分別加30g不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、D－海藻糖、甘露醇、木糖醇、鼠李糖、L－阿拉伯糖、D－果糖、D－山梨糖、D－半乳糖、可溶性淀粉、菊糖）；測試不同氮源時，在1000mL基礎培養(yǎng)基中加入20g葡萄糖作為碳源，再分別加入2g不同氮源（甘氨酸、L－組氨酸、脲、L－胱氨酸、DL－丙氨酸、氯化銨、硝酸鈉、磷酸二氫銨）。按1．4．1方法將菌株Sr－1轉接至含有不同碳、氮源的培養(yǎng)基平板中央，28℃下培養(yǎng)3d，用十字交叉法測量菌落直徑，并計算3個重復的平均值，平均值減去5mm作為病原菌實際生長的菌落直徑。10d后統(tǒng)計菌核數(shù)量并測量其直徑，每處理3次重復。天然培養(yǎng)基對病原菌生長及菌核形成的影響供試4種天然培養(yǎng)基分別為PDA、肉汁胨培養(yǎng)基（牛肉膏3g、蛋白胨8g、蔗糖10g、瓊脂16g、自來水1000mL）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（玉米粉300g、瓊脂16g、自來水1000mL）、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（燕麥片30g、瓊脂16g、自來水1000mL）。供試菌株與測試方法同1．4．3。

結果與分析

病害發(fā)生與癥狀芝麻白絹病主要發(fā)生在芝麻主莖基部及根部。發(fā)病初期植株葉片自下而上漸萎蔫（圖1a），濕度大時在近地表莖基部及根部生白色絹絲狀物，后期由白色菌絲體發(fā)育產(chǎn)生菌核（圖1b），幼苗期顯癥病株一般數(shù)日內(nèi)死亡?？v剖病株主莖基部，可見韌皮部凹陷，木質(zhì)部發(fā)生褐變（圖1c），將病根泥土清洗并在室溫下保濕5～7d后產(chǎn)生菜籽大小、先白色后黃色、最后為褐色的菌核。在病組織上產(chǎn)生的菌核多為球形或不規(guī)則形，直徑0．5～1．0mm，內(nèi)部白色。該病在芝麻苗期至開花結果期均可發(fā)生。

病原菌致病性將菌株Sr－1接種芝麻植株后第16d，12株接菌核或菌餅的芝麻植株均發(fā)病，并產(chǎn)生與田間自然發(fā)病植株相似的癥狀，而對照植株均無發(fā)病癥狀。發(fā)病植株根部有放射狀白色菌絲體，后期菌絲集結形成褐色菌核。重新分離得到的菌核與原接種菌株Sr－1的菌核在PDA平板上28℃下培養(yǎng)3d，兩者菌落的形態(tài)和菌核大小基本一致。表明菌株Sr－1對芝麻植株有致病性。

病原菌形態(tài)菌株Sr－1在PDA平板上菌落圓形，菌絲白色絹絲狀，并呈輻射狀向四周擴展，28℃培養(yǎng)3d即可長滿直徑70mm的PDA平板，7d左右菌落表面開始形成白色菌絲團，菌核開始形成，10d后菌核大量形成。菌核先為白色，后漸變黃色，最后變成褐色，內(nèi)部灰白色，球形或不規(guī)則形，表面光滑且有光澤，直徑為0．5～1．2mm。

分子鑒定用通用引物ITS1和ITS4對菌株Sr－1的rDNA－ITS序列進行擴增，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，顯示約650bp的單一條帶（圖2）。產(chǎn)物經(jīng)純化、測序后，獲得642bp的rDNA－ITS片段（GenBank登記號：JQ982485）。

溫度對病原菌生長及菌核形成的影響表1結果表明，該菌的生長溫度范圍為13～37℃，在31℃下菌落的直徑最大，在22～34℃生長較快，且能產(chǎn)褐色成熟菌核。因此，可將22～34℃視為該菌的適宜生長溫度，31℃為最適生長溫度。低于13℃或高于37℃菌絲停止生長，且低于22℃或高于34℃都不產(chǎn)生成熟菌核。將菌株Sr－1的rDNA－ITS序列與GenBank中已有的相關DNA序列進行比較發(fā)現(xiàn)，芝麻白絹病病菌與羅氏阿太菌Atheliarolfsii（無性態(tài)：齊整小核菌Sclerotiumrolfsii）有89％～98％的最大相似性。在構建的基于rDNA－ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）中，菌株Sr－1與羅氏阿太菌相聚于同一群。結合病原菌的形態(tài)特征、rDNA－ITS同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結果，將菌株Sr－1鑒定為羅氏阿太菌Athelrolfsii（Curzi）C．C．Tu＆Kimbr。

不同酸堿度對病原菌生長的影響菌株Sr－1在pH4．0～9．0范圍內(nèi)均可生長，其中在pH6．5～7．0中生長最好，表明弱酸性至中性有利于芝麻白絹病菌生長。由圖4中可以看出，在pH6．5以下的酸性區(qū)域中，菌絲體的生長量隨pH的增大而平緩上升，而在pH7．0以上的堿性區(qū)域中，菌絲體的生長量隨pH增高而下降的幅度相對較大。該結果表明，與酸性環(huán)境比較，堿性環(huán)境不利于該菌生長。

碳、氮源對病原菌生長與菌核形成的影響菌株Sr－1在13種供試碳源培養(yǎng)基上均能生長，但不同碳源對該菌生長及菌核形成的影響程度有明顯差異。在以D－海藻糖和D－山梨糖各自作為唯一碳源并配與硝酸鹽為氮源的生長條件下，培養(yǎng)3d不僅菌落最大（菌落直徑均大于83mm），且培養(yǎng)至第10d形成的菌核數(shù)量最多（表2）；其次具有較大菌落生長量且形成菌核的碳源是木糖醇、甘露醇、鼠李糖和D－半乳糖；在以可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、L－阿拉伯糖、D－果糖和菊糖作為唯一碳源并配與硝酸鹽為氮源的培養(yǎng)基上菌株Sr－1可不同程度地進行營養(yǎng)生長（菌落直徑46．5～75．5mm），但培養(yǎng)至第10d觀察不到菌核的產(chǎn)生。在不同碳源合成培養(yǎng)基上形成的菌核的平均直徑為0．6～0．8mm。8種供試氮源對菌株Sr－1的營養(yǎng)生長和菌核形成的影響也有明顯差異（表3）。該菌在以L－組氨酸、硝酸鈉、DL－丙氨酸作為唯一氮源并配以葡萄糖為碳源的合成培養(yǎng)基上生長速度最快，培養(yǎng)3d菌落直徑大于51mm，但培養(yǎng)至第10d仍不產(chǎn)生菌核；而在以磷酸二氫銨或氯化銨為氮源的培養(yǎng)基上，雖然培養(yǎng)3d菌落直徑小于50mm，但培養(yǎng)至第10d時可產(chǎn)生菌核。在不同氮源合成培養(yǎng)基上形成的菌核的平均直徑為0．6～0．7mm。

不同天然培養(yǎng)基對病原菌生長及菌核形成的影響菌株Sr－1在4種不同的天然培養(yǎng)基（燕麥、肉汁胨、玉米、PDA）上均可生長且形成菌核，其中在PDA和燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d菌落直徑最大（大于71mm），在PDA上培養(yǎng)至第10d產(chǎn)生的菌核數(shù)量最多（平均284粒／皿），平均菌核直徑最大（1．2mm），而在燕麥培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌核數(shù)量最少（平均15粒／皿）。在玉米培養(yǎng)基上的菌落生長量及形成的菌核數(shù)僅次于PDA，在肉汁胨培養(yǎng)基上形成的菌核數(shù)介于玉米培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基之間。這4種天然培養(yǎng)基上形成的菌核的平均直徑為0．9～1．7mm（表4），均大于各種碳、氮源合成培養(yǎng)基上形成的菌核平均直徑（0．6～0．8mm）。

結論與討論

關于芝麻白絹病菌的分子鑒定及生物學特性研究，很少見有文獻報道。但對齊整小核菌（Sclerotiumrolfsii）引起的其他作物白絹病的報道較多。該菌可侵染62科200多種植物［5］，如草莓［6］、山楂［3］、花生［7］、辣椒［8］、韭菜［9］、油茶［10］、白術［11］、苜蓿［12］、茉莉［13］、煙草［14］等，在不同地區(qū)引起不同作物的白絹病。根據(jù)柯赫氏法則對芝麻白絹病菌的致病性進行測定，根據(jù)病原菌的形態(tài)特性及rDNA－ITS序列，將供試菌株Sr－1鑒定為羅氏阿太菌Atheliarolfsii（無性態(tài)：Sclerotiumrolfsii，異名：Corticiumcentrifugum）。關于芝麻白絹病，國內(nèi)文獻記載臺灣、廣西及湖北有分布［2］。該病在河南及其以北省份未見發(fā)生報道。本次調(diào)查，首次確認河南省有芝麻白絹病的分布，并在國內(nèi)首次用分子技術對該病的病原菌進行鑒定。Atheliarolfsii屬土傳性病原菌，腐生性強。Nalim等［15］從花生田分離獲得25個菌絲親和組（MCG），組內(nèi)的分離株菌絲間有親和性，同一株花生可以分離到1～5個MCG，但一個MCG只能侵染一株植株。該菌適宜生長溫度為22～34℃，并易形成菌核，抵抗不良環(huán)境，隨著溫度的降低其生長的強度也降低，這與田間高溫時白絹病害發(fā)病嚴重的情況相符合。芝麻白絹病菌與韭菜白絹病菌［9］同屬于一個種，因此，生物學具有一些相同之處，如兩者生長的最適溫度均為31℃，其次芝麻白絹病菌在pH4．0～9．0范圍內(nèi)均可生長，韭菜白絹病菌菌絲生長pH范圍為2．0～9．0，這均與前人報道的病菌在pH4．05～8．97范圍可生長基本相符［6］。但由于病原菌寄主的差異，芝麻白絹病菌的最適生長pH值為6．5，這與韭菜白絹病菌生長的最適pH3～4不同。

研究表明芝麻白絹病菌能廣泛利用碳氮源，但對不同碳氮源的利用有較大差異。在13種測試碳源中，最大菌落與最小菌落平均直徑的差異高達41．5mm；8種測試氮源中，最大菌落與最小菌落平均直徑相差11．0mm，說明不同碳源對該菌生長的影響明顯大于氮源。姚圣海等［16］報道了堿性肥料（尿素、碳酸氫銨、碳酸鉀）和中性肥料（硝酸鈣、硝酸鉀）能抑制菌核的萌發(fā)。Gubitz等［17］和Sachslehner等［18～20］的研究發(fā)現(xiàn)，花生白絹病菌能夠分泌一些分子量大（40～60kDa）、在酸性條件下性質(zhì)穩(wěn)定的酶類，如甘露糖甘酶、甘露聚糖酶等，從而使得白絹病菌能夠很好地利用碳源，促進其生長。因此，不同酸堿度的肥料的施用對芝麻白絹病發(fā)生的影響值得進一步探討。本次共測試了13種碳源及8種氮源對芝麻白絹病菌生長及菌核形成的影響。在13種碳源中，有7種（可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、L－阿拉伯糖和菊糖）在與硝酸鹽作為氮源的組配條件下，芝麻白絹病菌雖然能生長，但不形成菌核；然而，在氮源測試中，病原菌在銨鹽與葡萄糖的組合條件下仍可以產(chǎn)生菌核。該結果表明：芝麻白絹病菌的營養(yǎng)生長（vegetativegrowth）階段與菌核形成（sclerotialformation）階段對碳氮源組合有著不同要求；在不同氮源中，銨鹽屬速效氮源，比硝酸鹽及其他有機氮更易被該菌用于菌核形成所需的蛋白質(zhì)。在碳氮源測試中所用的培養(yǎng)基均為成分明確的合成培養(yǎng)基。芝麻白絹病菌在合成培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌核平均數(shù)量均低于40粒／皿，且菌核的平均直徑均小于0．9mm。而在4種天然培養(yǎng)基中除了燕麥培養(yǎng)基的菌核數(shù)量較少之外，其它3種（肉汁胨、玉米、PDA）的菌核數(shù)均遠多于合成培養(yǎng)基，且天然培養(yǎng)上形成的菌核的平均直徑均大于0．9mm。該結果表明，營養(yǎng)全面、充足的天然培養(yǎng)基有利于芝麻白絹病菌形成更多、更大的菌核。

作者：王雅黃思良何朋朋牛小瑞黎起秦單位：．廣西大學農(nóng)學院南陽師范學院生命科學與技術學院