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牛血清白蛋白范文第1篇

目的研究龍葵對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腎炎的藥理作用。方法采用靜脈注射小牛血清白蛋白造成大鼠腎炎模型，按體重給予龍葵提取物35 d，觀察龍葵給藥后大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化。結(jié)果龍葵提取物可使給藥組動(dòng)物24 h尿蛋白排出明顯減少，血清尿素氮及血清肌酐含量顯著降低，大鼠腎小管內(nèi)的蛋白管型大小和數(shù)量明顯減少，灶性出血明顯少于模型組。結(jié)論龍葵提取物對(duì)小牛血清白蛋白所致大鼠實(shí)驗(yàn)性腎炎有明顯的防治作用。

【關(guān)鍵詞】 龍葵提取物 大鼠 實(shí)驗(yàn)性腎炎

慢性腎炎在臨床上是一種多發(fā)病、常見(jiàn)病，較難治愈，臨床上以蛋白尿?yàn)槌Ｓ迷\斷指標(biāo)，而目前仍以激素及免疫抑制劑為主要治療手段。近年來(lái)，以中醫(yī)藥治療慢性腎炎已成為研究的熱點(diǎn)。龍葵為茄科茄屬植物龍葵Solanum nigrum L.的全草，含有多種化學(xué)成分及藥理作用，藥源廣泛，易于采集，具有相當(dāng)重要的生產(chǎn)及研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用小牛血清白蛋白所致的大鼠實(shí)驗(yàn)性腎炎模型來(lái)觀察龍葵提取物的藥理作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物SD大鼠，各半，清潔級(jí)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。

1.2 試藥龍葵提取物(0.2 g/丸)：含生藥2.278 g/g，批號(hào)20071115，江蘇省中醫(yī)藥研究院制劑室提供；濟(jì)生腎氣丸：6 g/丸，國(guó)藥準(zhǔn)字Z12020082，批號(hào)20070106，天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠。加蒸餾水研勻，配成適宜濃度的混懸液備用；小牛血清白蛋白：1g/瓶，批號(hào)20070601，上海生物化學(xué)公司進(jìn)口分裝；尿蛋白試劑盒（批號(hào)20070625）、肌酐試劑盒（批號(hào)20070606）、尿素氮試劑盒（批號(hào)20070606）由南京建成生物工程公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 貝克曼DU-640紫外分光光度計(jì)，美國(guó)產(chǎn)；HH-60型快速恒溫?cái)?shù)顯水浴箱，常州國(guó)華電器有限公司生產(chǎn)；大鼠代謝籠：蘇州實(shí)驗(yàn)動(dòng)物籠具廠生產(chǎn)；Axioskop 2 plus 高級(jí)生物顯微鏡及Axiovision 圖象分析處理系統(tǒng)：德國(guó)ZEISS公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果［1～3］

大鼠60只，各半，體重180～220 g，隨機(jī)分為6組，即：正常組、模型組、濟(jì)生腎氣丸組(2.5 g生藥/kg)、龍葵提取物高(2.5 g生藥/kg)、中(1.25 g生藥/kg)、低劑量組(0.75 g生藥/kg)。大鼠按組開(kāi)始給藥，正常組及模型組均灌胃給予同體積的蒸餾水，共給藥35 d。于第14天，除正常組外，其余大鼠均一次性尾靜脈注射小牛血清白蛋白1 g/kg。給藥35 d后，將大鼠置于代謝籠，收集24 h尿，并測(cè)定尿蛋白含量，同時(shí)采血分離血清，測(cè)定血清中肌酐、尿素氮濃度。最后將大鼠處死，兩側(cè)腎臟固定于10%甲醛中，作病理組織學(xué)檢查，病變程度由-、+、++、+++分別計(jì)為1，2，3，4分，并由Axiovision 圖象分析系統(tǒng)記錄和分析病理組織學(xué)圖片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1～2。

由表1～2可見(jiàn)，模型組大鼠24 h尿蛋白排出量明顯高于正常組，血清肌酐及血清尿素氮含量均比正常組有顯著增高，而24 h尿量未見(jiàn)明顯變化。本品給藥組大鼠24 h尿蛋白排出量比模型組明顯減少，血清肌酐及血清尿素氮水平均顯著降低。病理鏡檢可見(jiàn)，模型組大鼠腎小球數(shù)目約17～20個(gè)/10×10視野，皮質(zhì)及髓質(zhì)內(nèi)部分腎小管內(nèi)見(jiàn)片狀紅染透明的蛋白管型，腎間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)灶性出血，偶見(jiàn)皮質(zhì)內(nèi)小管周?chē)≡钚粤馨蜐{細(xì)胞浸潤(rùn)。而給藥組大鼠腎小管內(nèi)的蛋白管型大小和數(shù)量明顯減少，灶性出血明顯少于模型組。

表1 龍葵提取物對(duì)小牛血清白蛋白腎炎模型大鼠尿蛋白及血清生化指標(biāo)的影響（略）

與模型組比較，*P

表2 龍葵提取物對(duì)小牛血清白蛋白腎炎模型大鼠病理指標(biāo)的影響（略）

與模型組比較，*P

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用小牛血清白蛋白所致的大鼠實(shí)驗(yàn)性腎炎模型來(lái)觀察龍葵提取物的藥理作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，龍葵提取物能顯著減少小牛血清白蛋白腎炎模型大鼠的尿蛋白排出，降低血清肌酐和血清尿素氮水平。病理結(jié)果顯示，模型組與正常對(duì)照組比較，其腎小球數(shù)無(wú)明顯變化，但蛋白管型及出血灶明顯高于正常對(duì)照組，而龍葵提取物各給藥組蛋白管型明顯減少，出血灶明顯減少。上述結(jié)果表明，龍葵提取物對(duì)小牛血清白蛋白引起的大鼠實(shí)驗(yàn)性腎炎有較顯著的改善作用。這也從實(shí)驗(yàn)方面為龍葵應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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牛血清白蛋白范文第2篇

關(guān)鍵詞：有機(jī)牦牛；背最長(zhǎng)肌；冷藏肉；生鮮肉；蛋白質(zhì)組學(xué)

肉類(lèi)產(chǎn)品食用品質(zhì)的大幅下降引發(fā)了人們對(duì)現(xiàn)代肉品品質(zhì)及其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的深入思考，尋找一種科學(xué)的肉品品質(zhì)評(píng)價(jià)方法并對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行控制已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。肉品品質(zhì)的形成機(jī)理與肉質(zhì)性狀高度相關(guān)，而幾乎所有的肉質(zhì)性狀都受到復(fù)雜的基因和蛋白質(zhì)調(diào)控。已有的研究主要集中在對(duì)豬肉等肉質(zhì)進(jìn)行感官、理化特性和組織學(xué)特性的評(píng)價(jià)，尚未見(jiàn)到應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)青藏高原有機(jī)牦牛宰后生鮮肉及冷藏肉品質(zhì)的形成機(jī)理、評(píng)價(jià)和控制進(jìn)行研究的報(bào)道。

本研究以同一飼養(yǎng)環(huán)境和屠宰條件，宰后以不同貯藏溫度（4、18 ℃）、不同貯藏時(shí)間（0、24 h）的生鮮和冷藏有機(jī)牦牛肉作為研究對(duì)象，以差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為研究平臺(tái)，篩選與分析生鮮和冷藏的有機(jī)牦牛背最長(zhǎng)肌肌肉的差異蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步探討有機(jī)牦牛肌肉加工過(guò)程蛋白質(zhì)的降解規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青藏高原有機(jī)牦牛背最長(zhǎng)肌肌肉組織取自青海省河南縣有機(jī)牦牛背最長(zhǎng)?。ǖ谄吒刈档阶詈笠桓刈担?，保存?zhèn)溆谩?/p>

2D裂解液、蛋白質(zhì)定量試劑盒、IPG緩沖液 美國(guó)Bio-Rad公司；尿素、硫脲、3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-1-丙磺酸（3-（3-cholamidopropyl）dimethylammoniopropanesulfonic acid，CHAPS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、Tris-HCl、甘油、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、甘氨酸 美國(guó)Sigma公司；

其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

雙向凝膠電泳系統(tǒng)、固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）干膠條、Image Master 2D Platinum凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；PD Quest軟件 美國(guó)

Bio-Rad公司；5800基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight to time of fight，MALDI-TOF-TOF） 美國(guó)AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

生鮮（宰后18 ℃、0 h）和冷藏（宰后4 ℃、24 h）有機(jī)牦牛背最長(zhǎng)肌肌肉樣品每份取約0.5 g，加入1 mL 2D裂解液，勻漿（4 m/s、勻漿15 s、停頓2 min），勻漿間隙放于冰上冷卻，重復(fù)操作3 次[1]。再對(duì)勻漿液進(jìn)行冰浴超聲破碎（100 W、超聲10 s、間歇15 s），重復(fù)操作10 次，13 400 r/min條件下離心15 min，取上清液。

1.3.2 蛋白質(zhì)定量

采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 雙向電泳

取總蛋白提取物100 μg，上樣量為450 μL，pH 3～10非線(xiàn)性IPG膠條17 cm進(jìn)行等電聚焦電泳，條件為：30 V、12h，500 V、1 h，1 000 V、1 h，8 000 V、8 h，500 V、4 h。等電聚焦結(jié)束后采用12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）膠進(jìn)行垂直電泳，條件為：15 mA/膠、30 min，30 mA/膠至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5 cm。垂直電泳結(jié)束采用銀染法進(jìn)行凝膠染色。

1.3.4 圖像采集

采用Image Master 2D Platinum凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行灰度掃描。所獲得掃描圖像通過(guò)PD Quest分析軟件進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析。

1.3.5 質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

采用5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對(duì)差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。生物質(zhì)譜的操作過(guò)程：切膠膠內(nèi)酶解

ZipTip脫鹽抽提酶解肽段MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜測(cè)試數(shù)據(jù)分析蛋白質(zhì)鑒定。利用Mascot軟件搜索Uniport、Swiss-Port數(shù)據(jù)庫(kù)尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bradford定量

采用Bradford方法利用Nano Photometer P360超微量分光光度計(jì)對(duì)生鮮和冷藏有機(jī)牦牛背最長(zhǎng)肌肌肉全蛋白質(zhì)提取量進(jìn)行測(cè)定。以1 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以蛋白質(zhì)含量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得出y=0.003x-0.020（R2=0.988）。由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好，可以用于實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

2.2 雙向電泳

經(jīng)雙向電泳及銀染后獲得生鮮和冷藏有機(jī)牦牛背最長(zhǎng)肌肌肉全蛋白雙向電泳圖譜（圖1）及差異蛋白在2-DE圖譜中的位置（圖2）。匹配后利用PD Quest軟件分析篩選差異點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雙向電泳圖譜具有較高的重復(fù)性，匹配率為75%。

通過(guò)PD Quest軟件對(duì)蛋白圖譜進(jìn)行分析，生鮮和冷藏有機(jī)牦牛背最長(zhǎng)肌肌肉組織的雙向電泳凝膠的平均蛋白點(diǎn)數(shù)分別為1 840±181和2 034±86，其中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

2.3 質(zhì)譜分析

選取PD Quest軟件檢測(cè)相對(duì)含量差異3 倍或3 倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)，手動(dòng)取出凝膠上差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)（共計(jì)36 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)），裝入1.5 mL離心管中超純水沖洗干凈后進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果得到7 個(gè)匹配有意義的差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果（表1）。其中，生鮮有機(jī)牦牛背最長(zhǎng)肌肌肉比冷藏的磷酸丙糖異構(gòu)酶和熱休克蛋白β-6含量上調(diào)，其余含量下調(diào)。

3 討 論

運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)動(dòng)物肌肉貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)組分變化的研究是目前研究的熱點(diǎn)之一。幾乎所有動(dòng)物肌肉組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜都有研究，針對(duì)青藏高原特有物種――有機(jī)牦牛，僅有少量關(guān)于感官、系水力、嫩度等理化性質(zhì)方面的研究資料[2-3]，而對(duì)宰后生鮮肉及冷鮮肉品質(zhì)的形成機(jī)理、評(píng)價(jià)和控制方面的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。有機(jī)牦牛肉品質(zhì)是影響其商品價(jià)值的重要因素之一，因其具有復(fù)雜而多元的特性，所以研究屠宰后生鮮和冷鮮牦牛肉蛋白質(zhì)變化的生理生化機(jī)制及其對(duì)嫩度等肉質(zhì)性狀的作用，對(duì)于探討有機(jī)牦牛肉肌肉生長(zhǎng)與肉品品質(zhì)間的相關(guān)性以及貨架期的生化反應(yīng)特點(diǎn)具有重要的意義。

據(jù)報(bào)道，動(dòng)物屠宰后肌肉細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)開(kāi)始死亡，并根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型發(fā)生一系列獨(dú)特、復(fù)雜的分子變化。動(dòng)物血液循環(huán)終止后供氧停止，且不能去除新陳代謝產(chǎn)物，肌內(nèi)糖原酵解導(dǎo)致乳酸積累，pH值降低，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉持水能力降低及鈣離子釋放，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白間形成交聯(lián)橋[4]。本研究發(fā)現(xiàn)了7 種在生鮮牦牛肉和冷藏牦牛肉背最長(zhǎng)肌中含量有顯著差異的蛋白質(zhì)，其中TPI及KRT4蛋白、肌球蛋白-6、AKI4蛋白質(zhì)是糖酵解和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。在有機(jī)牦牛肉中TPI和HSP β-6含量上調(diào)，肌球蛋白-6和AKI4含量下調(diào)，其原因可能是宰后肌肉為滿(mǎn)足ATP供應(yīng)而提高了厭氧能量代謝，這些差異蛋白質(zhì)與肉品性狀顯著相關(guān)。Jia等[5]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究牛過(guò)度生長(zhǎng)的現(xiàn)象，結(jié)果表明肌肉生長(zhǎng)抑制素基因上有11 對(duì)堿基缺失導(dǎo)致了13 種肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生了改變，包括收縮蛋白和代謝蛋白，這些蛋白質(zhì)大部分是來(lái)自有收縮性的器官組織，并能夠加快肌纖維的收縮功能，這與本研究結(jié)果相似。另外Lomiwes等[6]利用蛋白質(zhì)組分析屠宰后豬肌肉的變化情況，采集了剛屠宰至屠宰后48 h肌肉的蛋白質(zhì)組樣品，這些肌肉蛋白質(zhì)為5～200 kD不等，pH值為4～9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組模式發(fā)生了15 種顯著變化。Kim[7]、毛衍偉[8]等指出羊的雙肌臀突變導(dǎo)致臀部肌肉異常發(fā)達(dá)主要是由于18號(hào)染色體的突變，導(dǎo)致鈣激活中性蛋白酶抑制蛋白的活性增強(qiáng)了2～3 倍。

近幾年通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，揭示了結(jié)構(gòu)蛋白、糖酵解酶和熱休克蛋白/伴生蛋白在肌肉嫩化中的作用[9-11]。

研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)嫩度將牛背最長(zhǎng)肌分組，使用熒光差異雙向電泳技術(shù)分析其蛋白質(zhì)組后發(fā)現(xiàn)，表達(dá)存在差異的蛋白包括糖酵解酶和結(jié)構(gòu)蛋白，高嫩度牛肉樣品的肌漿蛋白質(zhì)組分中肌球蛋白輕鏈的量相對(duì)較高，可以作為預(yù)測(cè)牛肉蛋白水解和最終嫩度的標(biāo)記蛋白質(zhì)[12-14]。

Dutaud等[15]研究表明，安格斯牛肉宰后成熟過(guò)程中3 種蛋白表達(dá)量降低可能由于發(fā)生了等電點(diǎn)沉淀，推測(cè)有機(jī)牦牛肉成熟過(guò)程中表達(dá)量降低可能由于pH值的降低，發(fā)生等電點(diǎn)沉淀所造成。

綜上所述，通過(guò)雙向凝膠電泳結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定生鮮和冷藏有機(jī)牦牛背最長(zhǎng)肌肌肉差異蛋白質(zhì)，初步篩選出生鮮肉與冷藏肉的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，涉及糖酵解蛋白、熱應(yīng)激蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白等，說(shuō)明這些蛋白在有機(jī)牦牛肉貯藏過(guò)程中對(duì)肉品質(zhì)的影響發(fā)揮了重要的作用。

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牛血清白蛋白范文第3篇

【關(guān)鍵詞】 腎小球腎炎；動(dòng)物模型；造模機(jī)制；造模方法

腎小球腎炎是由多種病理類(lèi)型的原發(fā)性腎小球疾病發(fā)展而來(lái)的，以血尿、蛋白尿、高血壓和水腫為主要臨床表現(xiàn)的慢性疾病。目前認(rèn)為腎小球腎炎是一種自身免疫反應(yīng)性疾病，通過(guò)免疫作用而造成腎臟損害。

1 Heymann腎炎模型

本模型是通過(guò)針對(duì)自身抗原的免疫復(fù)合物（IC）誘發(fā)而成，故稱(chēng)其為自身免疫復(fù)合物性腎炎（autologous immunecomplex，AIC）。Heymann腎炎模型根據(jù)是否由同種動(dòng)物提供抗體分為主動(dòng)型和被動(dòng)型兩種模型。主動(dòng)型Heymann腎炎模型機(jī)制:動(dòng)物由自體抗腎抗體或自體抗原抗體復(fù)合物刺激引起腎小球基膜產(chǎn)生免疫反應(yīng)形成腎炎。被動(dòng)型Heymann腎炎模型機(jī)制：用甲種動(dòng)物的腎皮質(zhì)勻漿免疫乙種動(dòng)物，使后者產(chǎn)生抗甲種動(dòng)物的抗腎血清（抗腎抗體），然后將這種抗腎血清注射給健康的甲種動(dòng)物，而使其產(chǎn)生腎炎。主動(dòng)型Heymann腎炎，孫永寧［1］用大鼠腎皮質(zhì)勻漿加弗氏完全佐劑制備乳化液，同種大鼠腹腔注射次乳化液，2 ml/只，每周注射1次，共注射7次?，F(xiàn)研究常用模型為被動(dòng)型Heymann腎炎模型。其具體造模方法［2］為大鼠后足墊注射含6.5 mg免疫γ球蛋白的完全弗氏佐劑0.25 ml后，由大鼠尾靜脈注射1.0 ml兔抗FXIA抗血清，qd，共2天，造模完成。這一實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c人類(lèi)原發(fā)性膜性腎病非常相似，其特征為彌漫性基膜增厚伴釘突形成。

2 原位免疫復(fù)合物性

腎炎模型該模型的特點(diǎn)是在腎小球基膜上直接形成免疫復(fù)合物。由細(xì)菌感染合并異種免疫蛋白聯(lián)合作用造成模型。楊宏等［3］制作家兔原位免疫復(fù)合物腎小球腎炎模型:將大腸桿菌毒素和陽(yáng)離子化牛血清白蛋白（BSA）溶于0.15 mol/L、pH值為7.2的磷酸緩沖液（PBS）溶液中，最終濃度為每1 ml溶液中含1 μg大腸桿菌毒素和1 mg牛血清白蛋白，每只兔經(jīng)耳緣靜脈注射2 ml預(yù)免疫，7天后開(kāi)始正式免疫造模:每只免疫兔每天經(jīng)耳緣靜脈給予陽(yáng)離子化牛血清白蛋白20 mg（預(yù)先溶于PBS溶液中），共7周。腎臟組織學(xué)檢查顯膜性腎小球腎炎的典型病變，故一般認(rèn)為，膜性腎炎病理模型是原位免疫復(fù)合物性腎炎模型的典型病理代表。

3 馬杉腎炎

此模型［4］又稱(chēng)Masugi腎炎、腎毒血清性腎炎、大鼠抗腎小球基膜（GBM）腎炎。其基本原理［5］是以A種動(dòng)物的腎小球基膜作為抗原，與完全佐劑一起注射到B種動(dòng)物身上，使之產(chǎn)生抗A種動(dòng)物的腎小球基膜抗體，將含有此種抗體的B種動(dòng)物血清給A種動(dòng)物靜脈注射，A種動(dòng)物經(jīng)過(guò)一定的潛伏期之后尿中出現(xiàn)明顯蛋白，伴腎小球增生，終至新月體形成與完全纖維化改變，是利用異體抗GBM抗體直接誘導(dǎo)后產(chǎn)生的具有典型的人類(lèi)新月體性腎炎病理變化的動(dòng)物模型［6］。畢柳等［7］報(bào)道，英國(guó)Kazuhiro等用牛腎小球基膜免疫Wistar大鼠造成實(shí)驗(yàn)性自身免疫抗腎小球基膜腎小球腎炎。伍小波等［8］用鼠腎皮質(zhì)勻漿每周3次，每次10 ml免疫大耳白兔，在最后加強(qiáng)免疫后第11天，從兔耳緣靜脈采血測(cè)效價(jià)，利用雙向瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定兔抗大鼠GBM-Ab的效價(jià)為1∶16，收獲血清-30 ℃保存?zhèn)溆?。正常兔IgG加等量完全弗氏佐劑皮下注射SD大鼠進(jìn)行預(yù)免疫，預(yù)免疫后第7天和第8天后從大鼠尾靜脈注射稀釋一倍兔血清，劑量1 ml/只，連續(xù)兩天為致病免疫。本模型的優(yōu)點(diǎn)［9］是造模簡(jiǎn)單、陽(yáng)性率高、重復(fù)性好，常被用于多發(fā)性腎炎的研究。缺點(diǎn)是病情反應(yīng)較重，易導(dǎo)致部分動(dòng)物中途死亡，同時(shí)在人的腎炎中，與這種模型相似的發(fā)病機(jī)制的病例很少，僅限肺出血-腎炎綜合征（Goodpasture綜合征）。

4 系膜增殖性

腎炎（MsPGN）模型機(jī)制有以下兩種，由細(xì)菌感染合并異種免疫蛋白聯(lián)合作用造成模型及單純異種免疫蛋白造成模型。朱聲永等［10］復(fù)制家兔膜增殖型腎炎模型（按北京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎炎研究室介紹的方法復(fù)制），預(yù)免疫:每只家兔背部皮下注射牛血清白蛋白1 mg，每周1次，連續(xù)3次。第4周時(shí)每只家兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素1 μg，共1次。正式免疫:第3周開(kāi)始每只家兔耳緣靜脈注射牛血清白蛋白25 mg，每日1次，每周6次，共6周，并于最后1周中血清白蛋白劑量加倍注射。按照吳衡生法［11］制備兔模型，每只兔第1天從耳靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg。第4周分別從兔耳靜脈抽血做各項(xiàng)檢查。第8周后處死動(dòng)物，做腎臟病理檢查，此病理改變與人類(lèi)MsPGN極相似。由于兔模型費(fèi)用昂貴，石志超等［12］制備大鼠血清白蛋白模型，即每只大鼠尾靜脈注射1 g/kg結(jié)晶性小牛血清白蛋白，7天造模成功。目前，國(guó)際上普遍采用抗Thy-1抗體誘導(dǎo)的腎炎模型研究人類(lèi)系膜增殖性腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)制。“抗Thy-1抗體腎炎模型”可用抗Thy-1多克隆抗體或抗Thy-1單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）經(jīng)靜脈注射大鼠而建立。如蔣文功等［13］對(duì)單克隆抗體OX-7誘導(dǎo)的系膜增殖性腎小球腎炎大鼠模型的研究，經(jīng)大鼠尾靜脈單獨(dú)注射單克隆抗體OX-7（1 mg/kg），第7天模型制作成功?？筎hy-1單抗引起的腎病可能于1周后緩解，故馮媛等［14］用單側(cè)腎切除后3天按5 mg/kg體重靜脈注射磷酸鹽緩沖溶液溶解的Thy-1單抗1-22-3法造模。單純性MsPGN模型制作方法簡(jiǎn)便易行，且病變穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，因此越來(lái)越受到人們的重視。

5 血清病腎炎

模型它是一種經(jīng)典的免疫復(fù)合物腎病模型，包括急性血清病腎炎和慢性血清病腎炎兩類(lèi)：急性模型由一次性大劑量注入牛血清白蛋白抗原，使動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗BSA抗體，并和循環(huán)中剩余的抗原結(jié)合，形成循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）滯留于腎臟。丁秋蘭等［15］按Dixon方法首先將牛血清白蛋白用生理鹽水溶解。按250 mg/ml劑量1次家兔耳靜脈注射，即成功制作急性兔腎毒血清性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。慢性模型由多次注入牛血清白蛋白（每?次），使動(dòng)物體內(nèi)抗原持續(xù)對(duì)免疫系統(tǒng)形成刺激，隨著血清中抗BSA抗體的增多，可溶性CIC在循環(huán)中出現(xiàn)，分別沉積在腎小球毛細(xì)血管壁或系膜區(qū)，形成腎小球腎炎。楊解人等［16］選用新西蘭大耳白兔，耳緣靜脈注射C-BSA 10 mg，1次/d，共5周，第6周劑量加倍的方法成功制作家兔C-BSA腎炎模型。由于慢性血清病腎炎復(fù)制周期長(zhǎng)、陽(yáng)性率低，而急性血清病腎炎較慢性血清病腎炎模型方便省時(shí)且抗原消耗少，因而得到更為廣泛的應(yīng)用。

6 氨基核苷腎病模型

此模型又名嘌呤霉素腎病，屬于腎毒性藥物導(dǎo)致腎損傷造成的腎炎模型?，F(xiàn)常用［17，18］注射鹽酸阿霉素（ADR）、氯化汞、灌服碳酸鋰等制造模型。彭蘊(yùn)茹等［19］用鹽酸阿霉素復(fù)制模型，大鼠一次性尾靜脈注射鹽酸阿霉素7.5 mg/kg，于第10天獲得滿(mǎn)意造模效果。

7 其他腎炎模型

如IgA腎病模型、局灶性節(jié)段性腎小球硬化模型、狼瘡性腎炎模型等。20世紀(jì)70年代末Rifai等用牛血清白蛋白（BSA）作為載體交聯(lián)二硝基苯酚（DNP）［6］；20世紀(jì)80年代初Isaacs等用帶不同電荷的右旋糖酐經(jīng)腹腔靜脈注射，結(jié)果均誘發(fā)小鼠IgA腎病。劉志紅等［20］每周一次，連續(xù)3周給大鼠靜脈注射葡萄球菌腸毒素B（SEB）0.4 mg/kg成功地復(fù)制出IgA腎病模型。局灶性節(jié)段性腎小球硬化模型（嘌呤霉素＋一側(cè)腎切除＋嘌呤霉素法，或5/6腎切除等）。狼瘡性腎炎模型包括自發(fā)性腎炎小鼠模型及慢性移植物抗宿主病模型。這些腎炎模型由于臨床病理類(lèi)型的發(fā)病較少見(jiàn)或模型制作的繁瑣復(fù)雜性而應(yīng)用較少。綜上所述，腎小球腎炎動(dòng)物模型的研究已經(jīng)越來(lái)越細(xì)致和深入。其中馬杉腎小球腎炎模型因與人的發(fā)病機(jī)制相近，研究相對(duì)成熟和完善；而嘌呤霉素腎病腎小球腎炎模型的研究相對(duì)復(fù)雜和不易操作；陽(yáng)離子牛血清白蛋白引起的腎炎模型的研究以其簡(jiǎn)便、高效與病理相似性而被廣泛應(yīng)用。另外，腎炎模型近十余年無(wú)新的研究進(jìn)展，只是對(duì)原有模型的復(fù)制，如何找出既省時(shí)又經(jīng)濟(jì)的模型更有利于腎炎機(jī)制的闡述，也成為實(shí)驗(yàn)研究的迫切問(wèn)題。

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牛血清白蛋白范文第4篇

關(guān)鍵詞：大豆莖葉；蛋白質(zhì)含量；考馬斯亮藍(lán)染色法

中圖分類(lèi)號(hào)：TS63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）20-4610-03

蛋白質(zhì)是一項(xiàng)質(zhì)量和資源評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[1]，用一種快速、準(zhǔn)確、方便的方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)含量是必不可少的。近年來(lái)，許多學(xué)者用考馬斯亮藍(lán)染色法和其他方法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定[2-9]。蛋白質(zhì)中的酰胺基團(tuán)與考馬斯亮藍(lán)染料中的陰離子結(jié)合使溶液顯藍(lán)色，測(cè)定效果可通過(guò)測(cè)定顯色穩(wěn)定性等多個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行全面客觀地評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)采用盆栽大豆，對(duì)大豆的莖葉蛋白質(zhì)含量與大豆產(chǎn)量進(jìn)行考察，通過(guò)分析它們之間的影響與關(guān)系，為今后大豆育種工作提供試驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品為大豆莖葉（實(shí)驗(yàn)室自制）。

牛血清白蛋白（進(jìn)口分裝），購(gòu)于上海億欣生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（進(jìn)口分裝），購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器

SHB-IIIS循環(huán)水式多用真空泵和抽濾裝置（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、EL303型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Cary50紫外分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取牛血清白蛋白100.0 mg，用去離子水定容至100 mL，即為

1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，4 ℃保存待用。

1.3.2 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的制備 稱(chēng)取考馬斯亮藍(lán)G-250 100.0 mg于研缽中，取體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇（下同）50 mL，從中取約10 mL加入研缽，將考馬斯亮藍(lán)G-250研成粉并溶解；輕輕將上層液體轉(zhuǎn)入500 mL燒杯中，再取10 mL乙醇溶液于研缽中研磨，同法收集，重復(fù)洗滌3次。最后用20 mL乙醇分次洗滌研缽，合并液體于燒杯中。取體積分?jǐn)?shù)為85%濃磷酸100 mL分次加入燒杯再轉(zhuǎn)入

1 L容量瓶，定容，抽濾，得考馬斯亮藍(lán)G-250溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別吸取0.2～1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10 mL試管中，各管補(bǔ)加0.15 mol/L NaCl溶液至1 mL，各取0.1 mL于新試管中并加入5 mL考馬斯亮藍(lán) G-250溶液，搖勻，放置 2 min，于595 nm 處測(cè)定其吸光度[7]。

1.3.4 樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 取樣品溶液0.1 mL，按上述方法測(cè)定其吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)含量[8]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程的建立

用紫外分光光度計(jì)，以0.15 mol/L的NaCl溶液作空白對(duì)照，在595 nm處測(cè)定對(duì)照品溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

通過(guò)測(cè)定不同濃度牛血清白蛋白的吸光度得其線(xiàn)性回歸方程式：Y=0.478 3X+0.070 3，R2=0.999 3。

2.2 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

按蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，大豆莖的吸光度為0.434 2、0.440 2和0.437 5 a.u.，大豆葉的吸光度為0.611 4、0.611 0和0.612 1 a.u.。計(jì)算大豆莖的蛋白質(zhì)含量為7.608%、7.734%和7.677%，平均含量為7.673%；大豆葉的蛋白質(zhì)含量為11.313%、11.305%和11.328%，平均含量為11.315%。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

量取同一樣品溶液 1 mL，每隔 10 min 測(cè)定1次，觀測(cè)其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表1，表明在顯色1 h 內(nèi)吸光度穩(wěn)定，RSD分別為0.04%和0.39%。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按上述方法，分別測(cè)定大豆莖和葉蛋白提取液的吸光度，檢驗(yàn)該方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見(jiàn)表2，RSD分別為0.83%和1.27%，小于5%，表明重現(xiàn)性較好。

2.5 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取牛血清白蛋白溶液（1 mg/mL）0.5 mL進(jìn)行精密度試驗(yàn)，連續(xù)測(cè)定其吸光度6次，其RSD為0.25%，小于5%，表明精密度較好，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 回收率測(cè)定

取已配制好的1 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL，加入1 mL大豆莖（或葉）樣品溶液，然后再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染色液，搖勻，靜置2 min左右，于595 nm處測(cè)定其吸光度，以不加牛血清白蛋白溶液作為空白對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)算出相應(yīng)濃度，然后計(jì)算加入樣品蛋白的量，并計(jì)算回收率[9]，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度較高，可滿(mǎn)足大豆莖葉中蛋白含量的快速定量分析。

3 討論

蛋白質(zhì)分子均具有酰胺基團(tuán)，棕紅色的考馬斯亮藍(lán)G-250染料上的陰離子與蛋白質(zhì)的酰胺基團(tuán)結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，由于溶液在595 nm處吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，因此595 nm處測(cè)定吸光度，可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量[6]。上述結(jié)果表明，考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)中的酰胺基團(tuán)結(jié)合生成的藍(lán)色非常穩(wěn)定，在1 h之內(nèi)吸光度值變化很小，重復(fù)性較好，精密度較高，同時(shí)該方法測(cè)定蛋白含量的回收率符合大豆莖葉蛋白質(zhì)含量的測(cè)定要求。大豆莖蛋白質(zhì)提取液中蛋白質(zhì)含量在0.7～1.0 mg/mL范圍內(nèi)；大豆葉蛋白質(zhì)提取液中蛋白質(zhì)含量在1.1～2.0 mg/mL范圍內(nèi)，用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定大豆莖葉蛋白質(zhì)的含量?jī)?yōu)于其他傳統(tǒng)方法[10，11]。但另一方面，該法線(xiàn)性范圍窄，低濃度樣品易受影響，因此，在測(cè)定時(shí)所用試管須經(jīng)酸浸泡，洗凈后應(yīng)經(jīng)高溫烘干。當(dāng)樣品濃度大于一定濃度時(shí)，須稀釋測(cè)定，另外，可用乙醇和去離子水清洗比色皿上粘染的色素[12]。綜上所述，該法準(zhǔn)確率較高且簡(jiǎn)便靈敏，對(duì)設(shè)備要求低，受干擾小，適宜于測(cè)定大豆莖葉的蛋白質(zhì)含量。

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牛血清白蛋白范文第5篇

[關(guān)鍵詞] 丹參酮ⅡA；白蛋白納米粒；處方優(yōu)化；抗腫瘤

[Abstract] In this study， the tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles were prepared by high pressure homogenization method. The formulation was optimized by central composite design-response surface method （CCD-RSM ）， with the particle size， encapsulation efficiency， and drug loading as indexes to investigate their in vitro anti-tumor effect. The results showed that the prepared nanoparticles had uniformly spherical morphology and uniform particle size distribution. The average particle size， encapsulation efficiency and drug loading of nanoparticles were about （175.7 ± 3.07） nm， 90.8%±1.47% and 5.52%±0.09%， respectively. Tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles showed a more powerful antitumor effect than free tanshinone ⅡA for human promyelocytic leukemia NB4 cells. The preparation method of the drug-loaded albumin nanoparticles was simple and easy， and can significantly improve the solubility of tanshinone ⅡA， so it was helpful to extend its application in therapies against hematological malignancies.

[Key words] tanshinone ⅡA； albumin nanoparticles； formulation optimization； anti-tumor effect

丹參酮ⅡA是從中藥丹參中提取的一種脂溶性成分，其在心腦血管疾病、抗菌消炎、抗氧化等方面具有確切藥理作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其對(duì)人早幼粒白血病細(xì)胞具有明顯增殖抑制作用[2]。然而丹參酮ⅡA水溶性差（溶解度僅為2 mg?L-1），口服生物利用度低（

1 材料

丹參酮ⅡA（純度>95%，南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)D20150622A）；丹參酮ⅡA對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-15021504）；牛血清白蛋白（美國(guó)Amresco，純度>98%）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；膽固醇（上海惠世生化試劑有限公司，批號(hào)151024）；精制蛋黃卵磷脂（德國(guó)Lipoid，批號(hào)510300-2153731/948）；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

高效液相色譜儀 Agilent 1100（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；ALC-110.4型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；UV-2450紫外分光光度計(jì)（SHIMADZU 日本島津公司）；Zetasizer Nano-ZS90粒度分析儀（英國(guó)Malvern）；拓普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）；EF-C5 高壓均質(zhì)機(jī)（加拿大Avestin公司）；HENC高速剪切儀（德?tīng)柼鼗旌显O(shè)備有限公司）；冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labconco公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的制備

稱(chēng)取200 mg牛血清白蛋白（BSA）溶于20 mL超純水中，超聲溶解，作為水相；另稱(chēng)取20 mg丹參酮ⅡA 、40 mg膽固醇、40 mg蛋黃卵磷脂溶于0.9 mL的氯仿中，超聲溶解，作為油相。在高速剪切儀的作用下，將油相緩慢地注入水相中，高速剪切8 min，制備得到粗乳，迅速將粗乳轉(zhuǎn)移至高壓均質(zhì)機(jī)中，均質(zhì)10次，在35 ℃下，減壓真空除去氯仿，最終得到白蛋白納米粒膠體溶液[6]。

2.2 丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的藥劑學(xué)特性表征

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 取適量丹參酮ⅡA白蛋白納米粒溶液，加水稀釋后，滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，用20 g?L-1磷鎢酸負(fù)染樣品后，自然晾干后于透射電鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，納米粒形態(tài)較為圓整，粒徑較均勻。

2.2.2 粒徑分布與Zeta電位 采用激光粒度分析儀對(duì)所制備的白蛋白納米粒的粒徑、分散系數(shù)（PDI）及Zeta電位進(jìn)行測(cè)定，其平均粒徑為（175.7±3.07） nm，PDI為（0.187±0.04），Zeta電位為（-22.2±0.62） mV（n=3）。

2.3 包封率和載藥量的測(cè)定

2.3.1 色譜條件[7] 色譜柱Cosmonsil C18 烷基硅膠鍵合相（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-水（75∶25）；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；流速1.0 mL?min-1；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。方法的專(zhuān)屬性良好；回歸方程為Y=118.82X+69.15，r=0.999 9。丹參酮ⅡA在16～80 mg ?L-1與對(duì)應(yīng)的色譜峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好；精密度和重復(fù)性RSD分別為0.78%，0.67%；平均加樣回收率為99.7%，RSD為1.2%。

2.3.2 白蛋白納米粒樣品的處理 精密量取按2.1項(xiàng)下制得的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒1.0 mL于5 mL量瓶中，加入0.5 mL 0.01 mol?L-1鹽酸，用無(wú)水乙醇定容，搖勻，超聲5 min，0.22 μm微孔濾膜精濾，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算。

2.3.3 包封率和載藥量的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[8]方法，取200 μL的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒注入G25葡聚糖凝膠柱，用超純水洗脫，待棕紅色納米粒洗脫至凝膠柱底端時(shí)，用離心管接收白蛋白納米粒洗脫液，直至其完全被洗脫（約5 mL）。將上述納米粒洗脫液按2.3.2項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣HPLC檢測(cè)，即可測(cè)得被包封的藥物量We，另取同等體積未過(guò)柱分離的白蛋白納米粒，稀釋至與總洗脫液相同的體積，再取稀釋后的納米粒按2.3.2項(xiàng)下方法處理，同法操作，即可得白蛋白納米粒中藥物總量Wt。將納米粒在制備時(shí)的投藥量記為Wa，血清白蛋白及藥用輔料的總量為Wd。包封率（EE）公式為EE=（We/Wt）×100%；載藥量（DLE）公式為DLE=（Wa×EE）/（Wa+Wd）×100%。

2.4 溶解度的測(cè)定

在2.1項(xiàng)下制備的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒中加入3%的甘露醇，溶解后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱冷凍24 h，然后迅速轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中凍干36 h，得到納米粒凍干粉。將過(guò)量的丹參酮ⅡA和丹參酮ⅡA白蛋白納米粒凍干粉加入到5 mL水中，平行操作3次，超聲后，于（37± 0.5） ℃恒溫振搖24 h，平衡后，4 000 r?min-1離心10 min[9]。取上清液0.5 mL，按2.3.2項(xiàng)下方法，提取丹參酮ⅡA，進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出丹參酮ⅡA及其白蛋白納米粒制劑在水中的溶解度分別為（2.31±0.03），（708±1.15） mg?L-1（n=3）。

2.5 制劑處方優(yōu)化

2.5.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方[10] 參考預(yù)實(shí)驗(yàn)中的單因素試驗(yàn)結(jié)果，將剪切時(shí)間設(shè)為8 min，均質(zhì)次數(shù)設(shè)為10次，有機(jī)相體積設(shè)為0.9 mL，附加劑（膽固醇和蛋黃卵磷脂）的比例設(shè)為1∶1，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法考察牛血清白蛋白質(zhì)量（A）、附加劑質(zhì)量（B）和丹參酮ⅡA質(zhì)量（C）對(duì)載藥白蛋白納米粒粒徑（Y1）、包封率（Y2）及載藥量（Y3）的影。使用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對(duì)3因素分別設(shè)定5水平，各因素水平見(jiàn)表1。以Y1，Y2和Y3共同作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為“0～1”之間的“歸一值（desirability，di）”。公式為OD=（d1d2……dk）1/k ，k為指標(biāo)數(shù)。其中，對(duì)于取值越大越好的指標(biāo)（如包封率、載藥量）和取值越來(lái)越小的指標(biāo)（如粒徑）分別按公式dimax=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）和dimin=（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin）計(jì)算各指標(biāo)的di[11]。實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5.2 模型擬合與方差分析 使用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對(duì)上表數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，擬合方程為Y1=467.063 91-0.622 64A-2.743 66B-11.550 99C-0.003 012 5AB+0.015 35AC-方差分析結(jié)果顯示，該二項(xiàng)式擬合模型F為4.37，PC>A，交互項(xiàng)AB，AC和BC對(duì)指標(biāo)的影響均不顯著，二次項(xiàng)A2影響不顯著，而二項(xiàng)式B2和C2影響顯著，由此可說(shuō)明各因素間的交互作用較小。該二次項(xiàng)擬合模型擬合效果良好，且具有顯著性，可作為丹參酮ⅡA白蛋白納米粒處方優(yōu)化預(yù)測(cè)模型。

2.5.3 等高線(xiàn)圖及效應(yīng)面圖綜合分析 固定牛血清白蛋白質(zhì)量、附加劑質(zhì)量、藥物質(zhì)量3個(gè)因素中任意一個(gè)，考查其他2因素交互作用對(duì)OD值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，在3個(gè)因素中，對(duì)于OD影響最大的是附加劑的質(zhì)量，其次是藥物質(zhì)量，而白蛋白質(zhì)量的影響相對(duì)很小。在一定范圍內(nèi)，隨著附加劑質(zhì)量的增加，OD呈非線(xiàn)性減小趨勢(shì)，表現(xiàn)為曲面較陡；而隨著白蛋白質(zhì)量的增加，OD呈線(xiàn)性增加趨勢(shì)，表現(xiàn)為曲面較平滑。

根據(jù)Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出在擬定工藝條件下的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的最佳處方：牛血清白蛋白200 mg、附加劑的質(zhì)量80 mg、丹參酮ⅡA質(zhì)量20 mg。預(yù)測(cè)在此處方條件下制備的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒的粒徑為173.3 nm，包封率為90.1%，載藥量為5.48%，OD為0.869。

2.5.4 方驗(yàn)證[12] 按照以上優(yōu)化處方平行制備3批樣品，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，實(shí)際所得白蛋白納米粒的粒徑與預(yù)測(cè)值相差（二者之差除以預(yù)測(cè)值）1.37%，包封率與預(yù)測(cè)值相差0.75%，載藥量與預(yù)測(cè)值相差0.73%。結(jié)果表明，該模型可以準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)白蛋白納米粒的質(zhì)量特性參數(shù)。另制劑學(xué)特性表征均按照最優(yōu)處方進(jìn)行測(cè)定。

2.6 體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

2.6.1 白蛋白納米粒的細(xì)胞毒性 參考文獻(xiàn)[13]方法，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，取100 μL的細(xì)胞懸液接種于96孔板，在96孔板孔中，分別加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基以避免邊緣效應(yīng)，于37 ℃，5% CO2，飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)12 h過(guò)夜。每孔加入經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的空白載體溶液（白蛋白濃度依次為200，100，50，25，5 mg?L-1，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔）40 μL，同時(shí)設(shè)置不加載體的對(duì)照組（含細(xì)胞）及調(diào)零孔（不含細(xì)胞），然后置孵箱中培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT液（5 g?L-1）20 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL SDS，放置過(guò)夜后，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm測(cè)定各孔的吸光度（A），按公式“細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%”計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果為經(jīng)不同濃度白蛋白納米粒處理的細(xì)胞，其存活率為90%±0.84%（n=3），表明空白納米粒對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性。

2.6.2 載藥納米粒的抗腫瘤作用 細(xì)胞鋪板同2.5.1項(xiàng)。用培養(yǎng)基將載藥白蛋白納米粒稀釋至50，25，12.5，6.25，3.12 mg?L-1（每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔）加入96孔板中，后續(xù)操作同2.5.1項(xiàng)。同時(shí)用培養(yǎng)基將丹參酮ⅡA儲(chǔ)備液稀釋至與載藥白蛋白納米粒相同濃度作為對(duì)照考察，結(jié)果見(jiàn)圖3。游離丹參酮ⅡA和載丹參酮ⅡA白蛋白納米粒對(duì)NB4細(xì)胞的殺傷作用均具有濃度依賴(lài)性，且載藥白蛋白納米粒的細(xì)胞毒性顯著強(qiáng)于游離丹參酮ⅡA，IC50分別為（10.43±0.12），（5.69±0.04） mg?L-1（n=3）。

3 討論

血清白蛋白是一種安全、無(wú)毒、生物相容、可降解的廣泛存在于血液中的蛋白質(zhì)，這些特性使其成為一種良好的載體材料[14]。目前制備白蛋白納米粒的方法主要有超聲乳化法、去溶劑化法以及蛋白結(jié)合技術(shù)。其中去溶劑化法是制備白蛋白納米粒常用的方法，但作者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA在無(wú)水乙醇中溶解度差，無(wú)法形成載藥納米粒，故采用蛋白結(jié)合技術(shù)制備丹參酮ⅡA白蛋白納米粒。蛋白結(jié)合技術(shù)指的是在高速剪切力作用下，載藥的有機(jī)溶劑以納米液滴的形式分布于白蛋白水溶液中，在均質(zhì)過(guò)程中產(chǎn)生的空穴和熱效應(yīng)，會(huì)引起血清白蛋白的二硫鍵橋聯(lián)而形成納米粒[15]。與去溶劑化法制備的白蛋白納米粒相比，其制備工藝簡(jiǎn)單，包封率和載藥量較高，可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。另在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入一定量的蛋黃卵磷脂和膽固醇可顯著降低納米粒的粒徑，這可能是由于它們的存在提供了親脂性的微環(huán)境，增加了難溶性藥物丹參酮ⅡA與白蛋白的結(jié)合作用[16]。由溶解度測(cè)定結(jié)果可知丹參酮ⅡA在水中的溶解度為2.31 mg?L-1，而以白蛋白納米粒的制劑形式其溶解度可達(dá)到708 mg?L-1，與其水溶性相比提高了近300倍，較好地解決了丹參酮ⅡA的難溶性問(wèn)題。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，載丹參酮ⅡA白蛋白納米粒較游離藥物表現(xiàn)出更優(yōu)的抑瘤效果，這可能是由于白蛋白納米粒提高了丹參酮ⅡA的溶解度以及腫瘤細(xì)胞對(duì)白蛋白納米粒具有較強(qiáng)的攝取能力，從而增加了丹參酮ⅡA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的聚集，發(fā)揮藥物的抗腫瘤功效[17]。

綜上，本研究采用高壓均質(zhì)法制備得到的丹參酮ⅡA白蛋白納米粒，不僅提高了其溶解度，還增強(qiáng)了其抗腫瘤藥效，將有助于拓展丹參酮ⅡA在抗血液腫瘤方面的應(yīng)用。

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