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熱休克蛋白范文第1篇

關鍵詞：HSP27；HSP47；HSP70；腎臟纖維化

【中圖分類號】Q51;R692 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783(2012)06-0237-01

1 HSP27與腎臟纖維化

HSP27是小分子熱休克蛋白家族主要成員，在細胞抗應激損傷、維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用，參與多種效應反應[3]。

有研究報道，熱應激、ATP耗竭等損傷可誘導腎小管上皮細胞表達HSP27，高滲透壓可誘導腎組織細胞表達HSP27，IL-1、轉化生子因子β等可誘導細胞合成HSP27，說明HSP27在腎小管上皮細胞生理和功能狀態(tài)的維持和調節(jié)中發(fā)揮作用[4]。

周生國等[5]通過建立單側輸尿管梗阻腎小管間質纖維化大鼠模型，應用組織病理學和免疫組織化學法檢測HSP27在腎小管間質纖維化大鼠腎組織中的表達，發(fā)現(xiàn)腎小管間質纖維化過程中腎皮質腎小管中HSP27的表達明顯上調，主要分布于擴張的腎小管，這提示HSP27表達上調可能與腎小管上皮細胞對損傷的早期應激反應有關。

2 HSP47與腎臟纖維化

HSP47存在于內質網(wǎng)，與多種類型膠原和前膠原特異性結合的內質網(wǎng)駐留蛋白，在體內主要作為“分子伴侶”幫助新合成前膠原形成正確的三股螺旋結構，穩(wěn)固前膠原的三股螺旋分子，防止結構錯誤的前膠原泌出內質網(wǎng)，協(xié)助前膠原在正常狀況下分泌等，對膠原成熟的質量控制起著重要作用，與腎臟纖維化形成有著緊密的聯(lián)系[6]。

正常生理情況下，腎內HSP47僅微量表達。在腎臟病理狀態(tài)下，HSP47的表達或活性增加，可分布在多種細胞中如腎小球臟層上皮細胞、腎小球壁層上皮細胞等，并可直接刺激系膜細胞及腎小管上皮細胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型及Ⅳ型膠原，積極參與腎小管上皮細胞-間質轉換（EMT）過程，促進細胞外基質(ECM)的合成及過度聚集，引起腎纖維化過程中組織的過度修復，最終導致腎小球硬化和腎間質纖維化。因此，HSP47可能是腎臟纖維化的關鍵因子，通過HSP47為切入點研究腎纖維化，研制針對HSP47的拮抗劑，可能會找到防治腎臟纖維化的新方法。

已有研究報道，采用干擾HSP47表達的方法來改善腎纖維化[7]。在抗Thy-1腎小球腎炎大鼠模型中，HSP47反義寡聚脫氧核苷酸轉染大鼠腎小球細胞，抑制了HSP47表達，從而成功減少了膠原的合成，減輕了腎小球硬化的程度。單側輸尿管梗阻大鼠模型，通過輸尿管注射HSP47siRNA入梗阻側腎，腎纖維化程度明顯減輕，膠原蛋白明顯減少[8]。HSP47的相關研究已經(jīng)成為近年防治器官纖維化的研究熱點。

3 HSP70與腎臟纖維化

HSP70是熱休克蛋白家族中具有最高敏感性和高度保守性的一個家族，主要作為“分子伴侶”可促進新生多肽鏈的正確折疊，對解聚蛋白及維持恰當構型，分子重排以及新生多肽鏈在細胞內外跨膜轉運有重要輔助作用。HSP70在正常細胞中含量較低，在應激狀態(tài)下，蛋白合成量顯著增加。

在離體的人腎培養(yǎng)細胞NRK52E中，暴露TGF-β誘導腎上皮細胞纖維化和細胞凋亡，通過保留上皮細胞鈣粘蛋白表達水平和α-肌動蛋白來選擇性誘導HSP72的表達可以抑制TGF-β誘導的腎上皮細胞纖維化，說明HSP72對腎臟纖維化有著密切的關系。該研究首次證實，HSP72通過調控Sat3介導的信號通路抑制腎間質成纖維細胞的活化、增殖以及細胞外基質的積聚，從而抑制腎臟纖維化。提示HSP72具有多途徑、多水平和多靶點阻抑腎臟纖維化進程的作用，為慢性腎臟病的防治提供新的思路和途徑。

由于HSP70能夠加強自身體內細胞本身抗損傷潛能，有效減輕腎缺血再灌注損傷及腎間質纖維化，若能闡明HSP70基因表達調控的機制，通過無毒性的藥物或基因轉染等手段，誘導HSP70局部合理表達，可使腎臟細胞耐受潛在損傷刺激的能力增加，將為創(chuàng)傷、外科手術或移植等病理生理過程中腎臟的保護提供一個新的有效途徑。

4 結語

腎臟纖維化是所有腎臟疾病發(fā)展到終末期衰竭的共同變化，及早阻止甚至逆轉腎臟纖維化對防治終末期腎衰竭有重大意義。腎纖維化過程涉及很多細胞和分子參與，各種因素相互作用，機制非常復雜，本文簡要介紹了HSP27、HSP47、HSP70與腎臟纖維化的關系，在腎臟纖維化過程中發(fā)揮著重要的作用，為治療腎臟纖維化提供新的靶點和思路。但對其作用的機制和原理缺乏充分的認識，隨著研究的不斷深入，HSP27、HSP47、HSP70在腎臟纖維化過程中的作用機制將逐步被闡明，對防治腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展具有一定的指導意義。

參考文獻

[1] 宋偉等.熱休克蛋白70與心血管疾病關系的研究進展[J].中國心臟起搏與心電生理雜志,2011,25(2）:167-169

[2] 鐘文英等.熱休克蛋白的分子生物學研究進展[J].醫(yī)學綜述,2005,11(2):148

[3] Oh DJ et al. Heat shock protein express in adenosinie triphosphate depleted renal epithelial cells[J]. Korean J Intern Med, 2004, 19, (3):149-54

[4] 周生國等. 小分子熱休克蛋白在大鼠腎間質纖維化中的表達[J].中外醫(yī)療, 2009, 27: 28-29

熱休克蛋白范文第2篇

【關鍵詞】

大腸癌;熱休克蛋白;治療

DOI:10.3760/cma.j.issn 16738799.2010.01.178

作者單位:200127上海電力醫(yī)院/上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院

近年的研究發(fā)現(xiàn)HSP的高表達和腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間存在著聯(lián)系,其機制可能與增強了腫瘤細胞抗凋亡能力有關,曾有研究發(fā)現(xiàn) HSP 在結腸息肉與結腸癌組織中的表達不論是在量上或質上均有相當?shù)牟町?并且HSP可能與結腸腫瘤的惡性程度及預后相關,HSP的抗體或反義HSP能增加結腸癌細胞對治療的敏感性,為結腸腫瘤的治療提供了新的方向。在HSP家族中HSP70,HSP90是拮抗細胞凋亡的兩大家族,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切,以下對熱休克蛋白(HSP70,HSP90)在腫瘤發(fā)生特別是結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用作一研究。

1 熱休克蛋白家族及其功能

HSP首先發(fā)現(xiàn)于熱休克的果蠅唾液腺,此后的研究證實各種應激狀態(tài)能誘導細胞過量表達HSP,HSP被認為是應激狀態(tài)下細胞產(chǎn)生的保護細胞免受損害的蛋白質。更深入的研究發(fā)現(xiàn)HSP是一組結構保守廣泛存在的蛋白質,在非應激狀態(tài)下在細胞內亦有基本表達,表明其在保持細胞內的動態(tài)平衡中起重要作用,HSP能幫助其他蛋白質進行正確的折疊與重構,并能在細胞內幫助蛋白質的轉運,把受損害的蛋白質遞呈給蛋白酶進行降解[1],在免疫應答抗原遞呈反應過程中HSP能作為一種危險信號幫助機體免疫系統(tǒng)識別死亡與受損害的細胞,因此HSP被稱為分子伴侶。

作為分子伴侶,HSP能調節(jié)細胞自體平衡并能提高細胞生存能力,90年代以來,隨著對細胞抗調亡機制研究的深入,各種研究表明HSP能通過抑制細胞凋亡起到細胞保護作用,而許多腫瘤細胞也能通過過度表達HSP從而使腫瘤細胞避免凋亡,并使腫瘤細胞進一步進展與惡化。

2 熱休克蛋白(HSP70,HSP90)家族的抗凋亡機制

在HSP家族中HSP70,HSP90是拮抗細胞凋亡的兩大家族,其抗凋亡機制主要為:

2.1 抑制多種死亡受體信號途徑,阻止caspase酶活化 HSP70能抑制TNF、 Fas(Apo1/CD95)等死亡受體家族并能抑制JNK、Ask1等信號蛋白途徑誘導的凋亡[4,5]。HSP90能抑制絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)途徑誘導的凋亡,并與ErbB2、Src等癌基因的激活有關[6]。

2.2 直接抑制多種caspase酶 HSP70、HSP90直接抑制多種caspase酶如caspase3,caspase9等[7],從而抑制細胞凋亡。

2.3 抑制線粒體凋亡途徑 近年的研究提示線粒體是細胞凋亡的中央處理器,在細胞凋亡中起重要作用,其中線粒體細胞色素C的釋放以及Apaf1、AIF的活化能促進凋亡,HSP70、HSP90都能抑制線粒體細胞色素C的釋放,并能抑制Apaf1、AIF的活化從而抑制線粒體凋亡途徑。

2.4 影響一些凋亡調控基因以抑制凋亡 Bcl2、p53是重要的凋亡調控基因,Bcl2能抑制凋亡,而p53能促進凋亡,有研究表明HSP90能上調Bcl2基因[8],而HSP70能使野生型p53失活或使p53基因突變從而抑制凋亡[9]。

3 熱休克蛋白(HSP70,HSP90)在結腸癌中的作用

熱休克蛋白(HSP70,HSP90)與結腸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關,Yusei Kanazawa等[10]通過免疫組化技術研究50例結腸癌組織中HSP70,HSP40的表達,陽性率分別為80%與14%,均高于正常對照組織,Cen等[11]應用RTPCR技術研究35例散發(fā)的人結直腸癌中HSF1,HSF27,HSP90的表達情況,結果發(fā)現(xiàn)HSF1表達率為86%(30/35),HSP90表達率為63%(22/35),均顯著高與正常組織,提示其可能在散發(fā)的人結直腸癌的發(fā)生中起重要作用。也有研究對80例人結腸癌組織中HSP70及grp94的表達用免疫組化法進行分析,結果發(fā)現(xiàn)在結腸癌組織中HSP70及grp94的表達率分別為92.5%、85.0%,顯著高于鄰近組織的56.3%(HSP70)和42.5%(grp94)。在有轉移的結腸癌組織中HSP70及grp94的表達率均為100%,顯著高于沒有轉移的結腸癌組織,其表達率分別只有75%、50%[12]。以上研究均證實結腸癌組織中存在HSP70,HSP90的高表達。

結腸癌組織中HSP70,HSP90的高表達通過多種途徑抑制腫瘤細胞凋亡并與結腸癌患者預后相關。Dundas SR等[13]用比較蛋白組學分析方法發(fā)現(xiàn)在結直腸腺癌中存在mhsp 70(線粒體hsp 70)的過度表達,并通過免疫染色結合患者臨床資料,發(fā)現(xiàn)存在mhsp 70的過度表達的患者預后較差,提示mhsp 70在結直腸腫瘤的形成中起作用并與患者預后相關。其作用機制可能與mhsp 70能結合p53蛋白并影響RasRafMAPK信號蛋白途徑有關。Rashmi R等[14]發(fā)現(xiàn)hsp27 和 hsp70的高表達與胃腸道腫瘤患者腫瘤細胞轉移、不良預后以及對放療化療的不敏感有關。其機制可能為hsp70能抑制細胞色素c釋放、AIF活化并能抑制caspases3和 caspases9的活性,從而促進腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展。

HSP70,HSP90的高表達與結腸癌細胞的惡性增殖密切相關。腫瘤的形成過程中,腫瘤細胞不斷增殖,合成代謝增強,需要大量的HSP調節(jié)和穩(wěn)定這一異常增殖過程,而腫瘤組織生長旺盛,其增生的血管存在相對血供不足,缺氧與應激的細胞環(huán)境也反過來誘導了HSP的過度表達。HSP70,HSP90的高表達一方面介導癌基因及抑癌基因產(chǎn)物的構象成熟、跨膜轉運,另一方面介導錯配蛋白的降解,協(xié)調腫瘤細胞的蛋白質快速代謝平衡,使腫瘤細胞得以無限增殖。Yokota等[15]發(fā)現(xiàn)HSP的復合物在人結腸癌中的表達較正常組織顯著增高,并且其表達水平與PCNA(增殖細胞核抗原)相關,而PCNA是細胞增殖的一個重要指標,提示HSP的復合物的高表達與結腸癌細胞的快速增殖有關。

4 熱休克蛋白研究在結腸癌的治療中的意義

近年來的研究發(fā)現(xiàn)在結腸癌的治療中使用HSP70,HSP90的抗體或應用反義寡核苷酸技術抑制這些基因的表達,能增加腫瘤細胞對治療的敏感性,從而為結腸癌的治療提供了新的方向。Yang WL等[16]在裸鼠皮下種入人結腸癌HT29細胞,切除腫瘤組織并進行射頻消容(RFA),分別使用42°C,45 °C,50°C三種溫度,抽提RNA逆轉錄使用Western blot法分析HSP的表達,結果發(fā)現(xiàn)50 d后50°C組腫瘤復發(fā)率為0%,45°C組為30%,42°C組為100%,HSP70的表達在RFA后明顯升高,提示熱療可能誘導HSP70產(chǎn)生并使腫瘤細胞存活,而抑制HSP70的表達能提高RFA的療效。Kobayashi S等[17]發(fā)現(xiàn) HSP90的拮抗劑geldanamycin(格爾德霉素)能增加人結腸癌HT29細胞對放療的敏感性并減少放射劑量,同時應用HSP90的拮抗劑及MAPK途徑激動劑Indomethacin(吲哚美辛)能進一步增加放射治療的療效。Rashmi R等[18]用人結腸癌SW480細胞株轉染正義或反義hsp70 cDNA并選擇穩(wěn)定的克隆細胞株檢測其對姜黃誘導的細胞凋亡的敏感性,結果發(fā)現(xiàn)Hsp70能使結腸癌細胞對姜黃誘導的細胞凋亡產(chǎn)耐藥,而反義hsp70能提高結腸癌細胞對姜黃的敏感性。

HSP多肽復合物可制成免疫疫苗,為結腸癌提供腫瘤免疫療法,Mazzaferro等[19]在29例結腸癌根治術后肝轉移的患者中接種HSP多肽復合物疫苗,發(fā)現(xiàn)其能誘導CD8和T細胞介導的免疫反應,限制原發(fā)瘤的復發(fā)及轉移,并且未發(fā)現(xiàn)嚴重的毒性反應。

5 展望

綜上所述,熱休克蛋白家族與結腸癌及多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關,其機制與通過各種途徑抑制腫瘤細胞凋亡有關,并且多種研究證實HSP在胃腸道腫瘤組織中的高表達與腫瘤的分級及預后相關,對腫瘤診斷與預后存在意義。熱休克蛋白的抗體如HSP90的抗體geldanamycin(格爾德霉素)的衍生物17丙烯基脫氧格爾德霉素毒性較小,作為抗腫瘤藥物與腫瘤的放療、化療相結合,已進入II期臨床試驗階段[20],而應用反義寡核苷酸技術抑制HSP70、HSP90等基因的表達能抑制腫瘤細胞增生、促進腫瘤細胞凋亡并能增加腫瘤細胞對放療、化療及熱療的敏感性[21]。HSP肽類復合物能刺激CD8(+)T淋巴細胞的免疫保護作用,限制腫瘤的生長與轉移,因而體外合成的HSP多肽復合物可制成免疫疫苗,在腫瘤的治療中具有潛在優(yōu)勢[22]。以上的各種方法在結腸癌及其他多種腫瘤的治療中存在良好的前景,更深入的研究還在進行之中。

總之,隨著對熱休克蛋白作用的了解不斷深入,使熱休克蛋白與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關理論更加完善;為我們對腫瘤治療方法的研究提供更多的方向,使治療的方式方法更加多元化。同時對患者的預后的評估也有積極意義。

參考文獻

[1] F.U.Hartl,M.K.HayerHartl.Molecular chaperones in the cytosol:from nascent chain to folded protein,Science,2002,295:18521858.

[2] Gabai VL,Mabuchi K,Mosser DD,et al.Hsp72 and stresskinase cjun Nterminal kinase regulate the biddependent pathwayin tumor necrosis factorinduced apoptosis.Mol.Cell Biol,2002,22:34153424.

[3] Park,HS,Cho,SG,Kim,CK,et al.Heat shock proteinhsp72 is a negative regulator of apoptosis signal regulating kinase 1.Mol Cell Biol,2002,22:77217730.

[4] W.Xu,E.G.Mimnaugh,J.S.Kim,J.B.Trepel,(2002).Hsp90,not Grp94,regulates the intracellular trafficking and stabilityof nascent ErbB2,Cell Stress Chaperones 7:9196.

[5] Acehan,D.,Jiang,X.,Morgan,D.G.,et al.(2002).Threedimensional structure of the apoptosome:implicationsfor assembly,procaspase9 binding,and activation.Mol Cell 9,423432.

[6] Dias,S.,Shmelkov,S.V.,Lam,G.,& Rafii,S.(2002).VEGF(165)promotessurvival of leukemic cells by Hsp90mediated induction of Bcl2expression and apoptosis inhibition.Blood 99,25322540.

[7] Zylicz,M.,King,F.W.,& Wawrzynow,A.(2001).Hsp70 interactions withthe p53 tumour suppressor protein.EMBO J 20,46344646.

[8] Yusei Kanazawa.(2003).Expression of Heat Shock Protein(Hsp)70 and Hsp 40 in Colorectal Cancer.Medical Oncology.June,vol.20,no.2,pp.157164(8).

[9] Cen H,Zheng S,Fang YM,Tang XP,Dong Q.(2004).Induction of HSF1 expression is associated with sporadic colorectal cancer.World J Gastroenterol.Nov 1;10(21):31223126.

[10] Wang XP,Qiu FR,Liu GZ,Chen RF.(2005).Correlation between clinicopathology and expression of heat shock protein 70 and glucoseregulated protein 94 in human colonic adenocarcinoma.World J Gastroenterol.Feb 21;11(7):10561059.

[11] Dundas SR,Lawrie LC,Rooney PH,Murray GI.(2005).Mortalin is overexpressed by colorectal adenocarcinomas and correlates with poor survival.J Pathol.Jan;205(1):7481.

[12] Rashmi R,Kumar S,Karunagaran D.(2004).Ectopic expression of Hsp70 confers resistance andsilencing its expression sensitizes human colon cancer cells to curcumininduced apoptosis.Carcinogenesis.Feb;25(2):179187.

[13] Yokota S,Yamamoto Y,Shimizu K(2001)Increased expression of cytosolic chaperonin CCT in human hepatocellular and colonic carcinoma.Cell Stress Chaperones.Oct;6(4):345350.

[14] Yang WL,Nair DG,Makizumi R,Gallos G,Ye X,Sharma RR,Ravikumar TS(2004).Heat shock protein 70 is induced in mouse human colon tumor xenografts after sublethal radiofrequency ablation Ann Surg Oncol.Apr;11(4):399406.

[15] Kobayashi S,Nantz R,Kitamura T,Higashikubo R,Horikoshi N.(2005).Combined inhibition of extracellular signalregulated kinases and HSP90 sensitizes human colon carcinoma cells to ionizing radiation.Oncogene.Apr 21;24(18):30113019.

[16] Rashmi R,Kumar S,Karunagaran D.(2004).Ectopic expression of Hsp70 confers resistance and silencing its expression sensitizes human colon cancer cells to curcumininduced apoptosis.Carcogenesis.25:179187.

[17] Mazzaferro V,Coppa J,Carrabba MG(2003).Vaccination with autologous tumorderived heatshock protein gp96 after liver resection for metastatic colorectal cancer.Clin Cancer Res.Aug 15;9(9):32353245.

[18] Banerji U.;Judson I;Workman P.(2003).The Clinical Applications of Heat Shock Protein Inhibitors in CancerPresent and Future Current Cancer Drug Targets October vol.3,no.5 pp.385390(6).

熱休克蛋白范文第3篇

【摘要】

【目的】觀察慢性胃炎患者胃黏膜炎癥改變和熱休克蛋白70(hsp70)、核因子κb(nfκb)及其下游炎癥因子白細胞介素8（il8）、腫瘤壞死因子α（tnfα）蛋白水平的表達,并以脾氣虛證為對照,探討脾胃濕熱證與hsp70及nfκb炎癥通路表達的關系。【方法】臨床收集慢性胃炎患者51例(包括脾胃濕熱證36例、脾氣虛證15例),另招募正常志愿者8例作為正常對照組。胃鏡下取胃竇黏膜,采用蘇木素—伊紅（he）染色檢測炎癥改變,快速尿素酶和美藍法檢測幽門螺桿菌(hp)感染,抗生蛋白鏈菌素—生物素免疫組織化學法檢測各組hsp70、nfκb、il8及tnfα蛋白水平表達?！窘Y果】脾胃濕熱證與脾氣虛證hp感染率相當,但脾胃濕熱證hp感染程度及炎癥程度均較脾氣虛證明顯,尤以脾胃濕熱證hp陽性患者炎癥程度最重；胃黏膜炎癥程度及活動度與hp感染呈正相關。脾胃濕熱證患者hsp70、nfκb、il8及tnfα表達均較脾氣虛證顯著升高(p ＜0.05)。從hp感染與hsp70及nfκb炎癥通路情況看,脾胃濕熱證hp陽性患者hsp70、nfκb表達顯著高于hp陰性患者(p ＜0.05)；盡管脾胃濕熱證hp陽性患者il8、tnfα表達與hp陰性患者之間的差異無顯著性意義,但也呈增高趨勢。wWw.133229.COm胃黏膜hp感染與hsp70、nfκb及il8表達呈一定程度的正相關,但與tnfα表達無明顯相關性。【結論】慢性胃炎脾胃濕熱證的發(fā)生與胃黏膜hsp70及nfκb炎癥通路的表達相關。hsp70與nfκb及其下游炎癥因子在胃黏膜的過表達可能部分體現(xiàn)了慢性胃炎脾胃濕熱證“邪正交爭”的亢奮狀態(tài)；相比之下,慢性胃炎脾胃濕熱證hp陽性患者“邪正交爭”更為劇烈。

【關鍵詞】 慢性胃炎；脾胃濕熱；脾氣虛；胃黏膜/病理學

abstract: objectiveto observe inflammatory changes and expression levels of heat shock protein 70 (hsp70) and nuclear factorkappa b (nfκb) as well as the correlated inflammatory factors of interleukin 8 (il8) and tumor necrosis factor alpha (tnfα) in gastric mucosa of chronic gastritis patients, and to explore the relationship of spleenstomach dampheat syndrome with hsp70 and nfκb inflammatory pathway. methodsfiftyone chronic gastritis patients were enrolled into the study. of them, 36 patients were classified into spleenstomach dampheat syndrome and 15 into spleenqi deficiency syndrome. eight healthy volunteers served as the control. gastric mucosa was sampled under gastroscope. he staining was applied for the inflammatory changes of gastric mucosa. helicobacter pylori (hp) infection of gastric mucosa was detected by fast urea enzyme and methylene blue method. the protein expression of hsp70, nfκb, il8 and tnfα in gastric mucosa was detected by streptavidinbiotin complex(sabc) immunohistochemical method. resultsthe gastric mucosal hp infection rate in patients with spleenstomach dampheat syndrome was similar to that in patients with spleenqi syndrome. however, patients with spleenstomach dampheat syndrome had severer hp infection and inflammatory changes than those in patients with spleenqi syndrome. the inflammatory changes were more obvious in spleenstomach dampheat patients with hp infection positive. the inflammatory degree and activity of gastric mucosa was positively correlated with hp infection. the protein expression level of hsp70, nfκb, il8 and tnfα in gastric mucosa of patients with spleenstomach dampheat syndrome was higher than that in patients with spleenqi deficiency syndrome（p＜0.05）. in regards of relationship of hp infection with the condition of hsp70 and nfκb inflammatory pathway, spleenstomach dampheat syndrome patients with hp positive had higher hsp70 and nfκb expression levels than those with hp negative (p＜0.05). the expression of il8 and tnfα showed an increasing trend in spleenstomach dampheat syndrome patients with hp positive as compared with that in hp negative patients, but the difference was insignificant. gastric mucosal hp infection was positively correlated with hsp70, nfκb and il8 expression to some extent, while was not correlated with the expression of tnfα. conclusionthe occurrence of spleenstomach dampheat chronic gastritis is related with hsp70 and nfκb inflammatory pathway of gastric mucosa. the overexpression of gastric mucosal hsp70 and nfκb and their associated inflammatory factors maybe partially reflect the excited state of the struggling of healthy qi or pathogenic qi in spleenstomach dampheat chronic gastritis patients, which is more obvious in those patients with hp positive.

key words: chronic gastritis; spleenstomach dampheat;

作為內源性保護蛋白,熱休克蛋白70(heat shock protein70,hsp70)對維持胃黏膜的完整有重要作用［1］，核因子κb(nuclear factor κb,nfκb)活化后的表達與胃黏膜炎癥密切相關［2］。本研究以hsp70及nfκb炎癥通路的表達為切入點,并以脾氣虛證為對照,探討慢性胃炎脾胃濕熱證發(fā)生的生物學機制，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1病例資料收集2007年6月至10月就診于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院消化內科門診屬于慢性胃炎患者51例，辨證為脾胃濕熱證者36例,其中幽門螺桿菌(helicobacter pylori,hp)感染陽性者19例,hp陰性者17例；男23例,女13例；平均年齡為(35.36±5.70)歲；平均病程為(1.90±1.00)年。辨證為脾氣虛證者15例,男5例,女10例；平均年齡為(33.31±7.35)歲；平均病程為(2.17±0.77)年。另招募正常志愿者8例作為正常對照組，男3例,女5例；平均年齡(31.88±2.23)歲。3組在性別、年齡以及脾胃濕熱證與脾氣虛證患者的病程之間差異均無顯著性意義(p>0.05)。

1.2診斷標準慢性胃炎的診斷采用中華醫(yī)學會消化病學學會制定的《全國慢性胃炎研討會共識意見》中的標準［3］，脾胃濕熱證和脾氣虛證的辨證診斷參照《中藥新藥臨床研究指導原則》(試行)標準［4］，hp感染判斷參照2003桐城會議標準［5］。

1.3納入標準符合上述診斷標準，年齡在18~50歲之間，自愿且能夠配合參加試驗的受試者,并簽署知情同意書。

1.4排除標準不符合上述診斷標準者；近1個月內使用過抗生素、鉍劑、h2受體拮抗劑及質子泵抑制劑治療者；合并消化性潰瘍、萎縮性胃炎、食管炎、食管靜脈曲張、肝炎、肝硬化等消化系統(tǒng)疾病者；合并有嚴重心、肝、腎、肺系等疾病者及孕婦、哺乳期婦女；年齡在50歲以上或18歲以下者。

1.5主要試劑及儀器鼠抗人hsp70單克隆抗體（由北京中杉金橋生物有限公司提供，批號:77091220),鼠抗人nfκb/p65單克隆抗體（購自美國santa cruz公司，批號:sc8008),兔抗人白細胞介素8（il8）親和純化抗體（由博士德生物工程有限公司提供，批號：ba0996),兔抗人多克隆抗體腫瘤壞死因子α（tnfα）（購自北京博奧森公司，批號:bs0078r),gifxq240型電子胃鏡及bx50f3雙目顯微鏡(附帶自動照相裝置nikon e990)均由日本奧林巴斯公司提供。

1.6問卷調查各組受試對象均完成臨床觀察表,由專人詢問,對癥狀進行評定計分并填寫表格。為準確記錄患者癥狀,對于不容易準確判斷的舌象、脈象,均由2位以上有經(jīng)驗的醫(yī)師復核。

1.7標本收集各組受試對象均行胃鏡檢查,于胃竇距幽門2～3 cm處的大彎和小彎鉗取胃黏膜組織共2塊,1塊立即進行hp快速尿素酶和美藍法檢測，1塊放入40 g/l多聚甲醛中固定,石蠟包埋，行胃黏膜炎癥、hp感染病理組織學及上述各指標免疫組織化學標記檢測。

1.8指標檢測

1.8.1胃黏膜炎癥檢測采用常規(guī)蘇木素—伊紅（he）染色方法進行。胃黏膜炎癥程度、活動度的判斷采用文獻［3］標準,由2位病理醫(yī)師在同一設定條件和未知病理診斷情況下進行。

1.8.2胃黏膜hp感染檢測采用快速尿素酶和美藍法進行,兩種方法檢測均呈陽性者判斷為hp感染陽性,而均呈陰性者判斷為hp陰性,一陰一陽者不納入結果分析。

1.8.3胃黏膜hsp70及nfκb通路的檢測采用抗生蛋白鏈菌素—生物素(streptavidinbiotin complex, sabc)免疫組織化學標記方法進行。hsp70、nfκb、il8及tnfα一抗的工作濃度為1∶100,并于4℃過夜,其他具體操作步驟按試劑盒說明書進行。胃黏膜上述指標表達染色指數(shù)的觀察采用北航圖像分析系統(tǒng)3000進行病理圖像分析。染色指數(shù)（i染色）計算：染色指數(shù)＝染色強度×染色面積；按顯色強弱記錄為：陰性-0,弱陽性-1,陽性-2,強陽性-3；染色面積比為染色細胞數(shù)占總體細胞數(shù)的百分比。

1.9統(tǒng)計學方法采用spss for windows 16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)的分析。以均數(shù)±標準差（±s）表示,組間均數(shù)比較用t檢驗；多組間計量資料比較用方差分析,等級資料用秩和檢驗；相關分析用spearman等級相關分析方法。顯著水平設α＝0.05。

2結果

2.1各組hp感染與胃黏膜炎癥程度、活動度的情況脾胃濕熱證患者黏液糊大多量偏多而濁,部分伴糜爛或黏膜下出血點；其胃黏膜充血水腫及炎癥程度均重于脾氣虛證,但炎癥活動度則2組之間未見明顯差異。脾胃濕熱證與脾氣虛證患者胃黏膜hp感染率相當,分別為52.78%和53.33%,但脾胃濕熱hp陽性患者炎癥程度及活動度均較hp陰性患者明顯,胃黏膜炎癥程度及活動度與hp感染的相關系數(shù)分別為0.608和0.620,呈正相關；hp陽性患者胃黏膜除固有層炎癥細胞浸潤、上皮破壞外,部分還可見淋巴濾泡形成。結果見表1~表4及圖1~圖2（見彩圖頁第669頁）。表1各組胃黏膜的炎癥程度（略）表2脾胃濕熱證hp感染與胃黏膜炎癥程度的關系（略）表3各組胃黏膜的炎癥活動度（略）表4脾胃濕熱證hp感染與胃黏膜炎癥活動度的關系（略）

2.2各組胃黏膜hsp70及nfκb炎癥通路的表達脾胃濕熱證和脾氣虛證患者hsp70、nfκb及il8蛋白水平的表達定位于胃黏膜上皮、腺體及固有膜細胞的胞核和胞漿,tnfα蛋白水平的表達主要定位于胃黏膜上皮、腺體及固有膜細胞的胞漿；正常對照組各指標的表達主要定位于胃黏膜上皮、腺體及固有膜細胞的胞漿。脾胃濕熱證患者hsp70、nfκb、il8及tnfα表達均顯著高于脾氣虛證組(p ＜0.05)。從hp感染與hsp70及nfκb炎癥通路情況看,脾胃濕熱證hp陽性患者hsp70、nfκb表達顯著高于hp陰性患者(p ＜0.05)；盡管il8、tnfα表達與hp陰性患者之間未見顯著差異,但其表達也呈增高趨勢。本研究病例胃黏膜hp感染程度與hsp70、nfκb及il8表達的相關系數(shù)分別為0.322、0.288和0.277,呈一定程度正相關；與tnfα表達的相關系數(shù)為0.064,未見明顯的相關性。結果見表5、表6及圖3~圖6（見彩圖頁第670頁）。表5各組胃黏膜hsp70、nfκb、il8及tnfα免疫組化的表達比較(略)表6脾胃濕熱證hp感染與胃黏膜hsp70、nfκb、il8及tnfα表達的關系(略)

3討論

hp是造成胃黏膜損傷的主要攻擊因子之一,與慢性胃炎、潰瘍甚至胃癌均具有明確的病因學聯(lián)系［6－7］。作為重要的轉錄調控因子,nfκb活化入核后能與炎癥反應基因啟動子部位的κb位點特異性結合,啟動和調節(jié)相關炎癥基因轉錄,在炎癥反應細胞因子網(wǎng)絡調節(jié)通路中起重要作用。研究顯示,hp感染易導致nfκb活化，而隨著nfκb活化后在胃黏膜表達的增加,炎癥性細胞因子il8及tnfα表達也逐漸上升，且后者還可進一步促進nfκb的活化,產(chǎn)生級聯(lián)反應,從而使炎癥持續(xù)和放大［2,7－8］，這與中醫(yī)認為“濕熱邪氣”具有熏蒸、粘滯以及致病隱匿、漸進和纏綿易反復的特點較類似。

眾所周知,中醫(yī)在強調“邪氣”致病的同時,往往更加注重機體“正氣”的御邪能力。作為內源性保護蛋白,hsp70在維持胃黏膜的完整中有著重要作用［1］。已有研究發(fā)現(xiàn),hp陽性患者胃黏膜hsp70表達隨hp感染程度的加重而增強［9］；hsp70可通過nfκb通路調節(jié)脂多糖所誘導的炎癥性細胞因子的表達［10］。筆者于此也曾提出hp感染可能通過激活nfκb通路,使相關炎癥因子過表達而致病，而hsp70則可能通過介導細胞保護,阻止nfκb活化從而能一定程度提高胃黏膜對hp和相關炎癥因子的防御和耐受能力的觀點［11］。本課題組近期mrna水平定量研究也提示,慢性胃炎脾胃濕熱證患者胃黏膜hsp70及nfκb的表達明顯高于脾氣虛證組和正常對照組［12］。

從本研究病例看,慢性胃炎脾胃濕熱證與脾氣虛證hp感染率相當,但脾胃濕熱證hp感染程度及胃黏膜炎癥程度較脾氣虛證為重,尤其以脾胃濕熱證hp陽性患者的炎癥程度最重。脾胃濕熱證和脾氣虛證組患者胃黏膜hsp70與nfκb及其下游炎癥因子il8、tnfα蛋白水平的表達分別較正常對照組升高和下降；與正常對照組僅呈胞漿未活化狀態(tài)的表達不同,2組hsp70、nfκb及其il8均呈胃黏膜上皮、腺體和固有膜活化后細胞核和胞漿的同時表達,且2組之間的表達存在著顯著性差異，一定程度體現(xiàn)了脾胃濕熱證邪氣亢盛與正氣奮起抗邪以及脾氣虛證正虛體弱不足以奮起抗邪的特點。從與hp感染的相關性來看,胃黏膜炎癥程度和活動度以及hsp70、nfκb及其炎癥因子il8表達均與hp感染程度呈一定的正相關；但tnfα表達與hp感染程度未見明顯相關性,是否與tnfα體內效應呈表達量依賴性有關,尚待進一步的探討。

上述研究初步提示,慢性胃炎脾胃濕熱證的發(fā)生與hsp70和nfκb及其炎癥通路相關；相對而言,hp陽性脾胃濕熱證患者的炎癥反應最為明顯；具有胃黏膜保護作用的hsp70可能部分體現(xiàn)了機體正氣的作用,而nfκb及其下游炎癥因子則可能部分體現(xiàn)了體內邪氣的力量。根據(jù)hp的致病性、hsp70本身的特點及其在本研究病例中醫(yī)證候的表達,結合前期的相關研究,本研究進一步提出hp可能屬中醫(yī)“濕熱邪氣”,而hsp70可能屬“正氣”范疇的觀點；并初步認為hsp70與nfκb及其下游炎癥因子在胃黏膜的過表達可能部分體現(xiàn)了慢性胃炎脾胃濕熱證“邪正交爭”的亢奮狀態(tài)；相比之下,慢性胃炎脾胃濕熱證hp陽性患者“邪正交爭”更為劇烈。

【參考文獻】

［1］choi s r, lee s a, kim y j, et al. role of heat shock proteins in gastric inflammation and ulcer healing［j］. j physiol pharmacol,2009，60(7)：5．

［2］doqer f k, meteoqlu i, ozkara e, et al. expression of nfkappa b in helicobacter pylori infection［j］. dig dis sci,2006,51(12)：2306．

［3］中華醫(yī)學會消化病學學會. 全國慢性胃炎研討會共識意見［j］. 中華消化雜志,2000,20(3)：199．

［4］國家食品藥品安全監(jiān)督管理局.中藥新藥臨床研究指導原則(試行) ［s］. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2002：362,371．

［5］中華醫(yī)學會消化病學分會. 幽門螺桿菌共識意見［j］. 中華消化雜志,2004,24(2)：126．

［6］ding s z, goldberg j b, hatakeyama m. helicobacter pylori infection, oncogenic pathways and epigenetic mechanisms in gastric carcinogenesis［j］. future oncol,2010，6(5)：851.

［7］yanai a, maeda s, shibata w,et al. activation of ikappab kinase and nfkappab is essential for helicobacter pyloriinduced chronic gastritis in mongolian gerbils［j］. infect immun, 2008,76(2)：781．

［8］kim s y, lee y c, kim h k, et al. helicobacter pylori caga transfection of gastric epithelial cells induces interleukin8［j］. cell microbiol, 2006,8(1)：97．

［9］yi p, li g c, liu s h, et al. effect of xiaokuiling prescription on the expression of hsp72, hsp b in gastric mucosa of patients with helicobacter pyloriassociated duodenal ulcer［j］. j tongji med univ, 2001,21(4)：310．

［10］dokladny k, lobb r, wharton w, et al. lpsinduced cytokine levels are repressed by elevated expression of hsp70 in rats: possible role of nfkappa b［j］. cell stress and chaperones, 2010,15(2)：153．

熱休克蛋白范文第4篇

[主題詞]　電針;心臟外科手術;熱休克蛋白質類/代謝;RNA,信使/代謝

Effects of Electroacupuncture on Myocardial Cellular HSP70mRNA Gene Expression in Patients Undergoing Cardiac Surgery

Wang Xiangrui1,Zhang Tengfei2,Ma Shuliang1,et al(1. Renji Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University,Shanghai 200127;2. Teaching and Research Section of Biochemistry,Shanghai Second Medical University)

[Abstract]　Purpose　To observe the effect of electroacupuncture on myocardial cellular HSP70mRNA gene expression in patients undergoing cardiac surgery(ASD).Methods　28 ASD patients were randomly divided into 3 groups,i,e,acupuncture anesthesia group(groupⅠ,n=6),acupuncture combined with general anesthesia group(group Ⅱ,n=10) and general anesthesia group(groupⅢ,n=9).The sample from left atrium at 10 min before CPB,stopping CPB,30 min and 1 h after stopping CPB.Extration of total RNA from myocardial tissue using Reagent Kit.The concentration of mRNA was measured through RTPCR and CKMB was detected.Results　After CPB CKMB in the three groups was significantly higher than the value of 10 min before CPB,and CKMB in the group Ⅲ was remarkedly higher than the group Ⅰ and Ⅱ;HSP70mRNA expression was found to be higher in the group Ⅰ than that of group Ⅲ at 30 min and 1 h after stopping CPB.Conclusion　Electroacupuncture can induce the expression of HSP70mRNA in ischemic myocardial tissue of patients undergoing cardiac surgery.

[Key words]　Electroacupuncture;Heart Surgery;RNA,Massenger/metab;HeatShock Proteins/metab;Myocardium/metab

體外循環(huán)心臟手術術后并發(fā)癥的發(fā)生率與術中心肌缺血、缺氧的保護有明顯關系[1]。除采用低溫、不同成份灌注液的冠脈灌注等方法外,近年發(fā)現(xiàn)機體有自身的保護機制,心肌缺血、缺氧后誘導心肌內應激蛋白增加,從而增強機體抗御缺血的能力。筆者發(fā)現(xiàn)針刺麻醉病人術后恢復快,并發(fā)癥少。為探討針刺對心臟功能的調節(jié)作用[2],本文觀察針刺對心臟手術病人心肌細胞熱休克蛋白mRNA基因表達的影響,初步分析兩者之間的相互關系。

1　資料和方法

1.1　一般資料

隨機選擇房間隔缺損修補術(ASD)28例,分針麻組(組 Ⅰ)6例,男 女各3例,年齡26.0±5.3歲;針刺加全麻組(組 Ⅱ)10例,男4例,女6例,年齡27.1±7.4 歲;全麻組(組 Ⅲ)9例,男5例,女4例,年齡26.8±5.4歲。各組病人術前心功能 Ⅰ ～Ⅱ級。

1.2　麻醉方法

針刺穴位取雙側內關、列缺、云門,進針后接G 6805針麻刺激儀,脈沖頻率為3～4 Hz,電流量以病人舒適為度,誘導時間20～30 min,體外循環(huán)肝素化時,留針停止刺激,待魚精蛋白中和肝素后恢復刺激。

全麻組病人術前用藥為肌注苯巴比妥鈉0.1 g,哌替啶50 mg,東莨菪堿0.3 mg,麻醉誘導安定0.1 mg/kg,維庫溴銨0.25 mg/kg,依托咪酯0.2 mg/kg,芬太尼5 μg/kg,麻醉維持吸入異氟醚,間斷靜注芬太尼和維庫溴銨。

1.3　標本采集

上腔靜脈插管前(轉流前10 min),停心肺轉流機和停機后30 min,1 h分別自右心耳剪下1 mm×1 mm×1 mm標本。體外循環(huán)機最大轉速4 L/min,最低溫度針麻組26.02±0.12 ℃,針刺加全麻組23.41±1.52 ℃,全麻組 22.92±1.65 ℃。

1.4　HSP70mRNA的分離提取

應用Reagent抽取組織總RNA,通過勻漿化、分離、洗滌、溶解、沉淀分離總RNA,紫外分光光度儀測定RNA濃度,加入隨機引物和探針,經(jīng)RTPCR擴增后,溴芬蘭染色在0.8%膠走電泳,以123 Mark標記分子量。顯色后斑點雜交膜用密度掃描儀(島津CS920型)對HSP70mRNA進行定量。

1.5　心肌酶譜CKMB測定

自右頸內靜脈導管抽取近右心房處血標本,采用日立7150全自動分析儀測定肌酸磷酸激酶同功酶(CKMB)。

1.6　術后并發(fā)癥發(fā)生率

術后低血壓、循環(huán)功能不穩(wěn)定者所應用血管活性藥物發(fā)生率和每人平均用量;神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,包括腦栓塞、腦出血、意識功能障礙;腎功能不全監(jiān)測、少尿、無尿及術中知曉發(fā)生率。

1.7　統(tǒng)計學處理

各時點數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。各數(shù)值輸入SAS軟件進行統(tǒng)計學處理。組內各數(shù)據(jù)采用配對t檢驗,組間各數(shù)據(jù)采用方差分析。

2　結果

2.1　3組病人體外循環(huán)轉流前后CKMB的變化

3組病人停轉流和轉流后1 h CKMB均較轉流前明顯增高(P

2.2　3組HSP70mRNA含量的比較

通過斑點切跡雜交顯色,可見針刺組HSP70mRNA表達高于對照組,斑點切跡經(jīng)薄層掃描儀定量,其密度值見表2。

2.3　CKMB與HSP70mRNA含量之間的關系

停轉流1 h時,組ⅠHSP70mRNA增高39.7%, CKMB增高272.7%,組ⅢHSP70mRNA增高10.3%,CKMB增高696.6%,HSP70mRNA基因表達率增加與CKMB增加的幅度相關,HSP70mRNA明顯增加,CKMB的增幅明顯下降。

2.4　術后并發(fā)癥發(fā)生率

組Ⅲ術后1天循環(huán)功能不穩(wěn)定需用血管活性藥物5例,占總數(shù)31.0%;神經(jīng)意識障礙、腦栓塞2例,占14.4%;平均術后恢復天數(shù)5.41±0.82天,均明顯高于組Ⅰ和組Ⅱ(P

3　討論

當機體受到應激因子刺激,組織細胞可產(chǎn)生應激蛋白,對機體產(chǎn)生自身保護作用,熱休克蛋白屬一類應激蛋白,包括HSP90,HSP70,HSP60和HSP27等類型,參與組織蛋白質折疊和復合物的形成[3]。

近年對HSP70的研究較為詳細,HSP70家族至少包括4種同分異構體,HSP75,78為葡萄糖調節(jié)蛋白,前者存在于線粒體,后者存在于肌漿網(wǎng),HSP為存在于胞漿中的非應激蛋白,HSP72在非應激狀態(tài)下不存在于細胞中,而在各種引起細胞蛋白損傷因素(缺血、熱、缺氧、代謝抑制、乙醇、蛋白變性等)存在時迅速合成。減輕心肌缺血再灌注損傷,提高缺血后心臟的機械功能,有利于ATP的保存和保護線粒體功能[4],心功能的恢復與HSPmRNA表達和HSP70的含量有關[5]。

心肌缺血再灌注損傷的主要原因之一是氧自由基產(chǎn)生,損傷細胞膜,破壞細胞核和核糖蛋白,抑制細胞酶系統(tǒng),影響細胞功能[6,7]。熱休克蛋白能減少氧自由基釋放,穩(wěn)定細胞膜和溶酶體膜,防止蛋白質變性,減輕心肌的缺血再灌注損傷。

本研究結果表明針麻組和針刺加全麻組停心肺轉流和停轉流后1 h HSP70mRNA基因和HSP70含量高于單純全麻組病人。因而針刺對心肌細胞熱休克蛋白mRNA基因表達有一定的增強作用。分析3組病例熱休克蛋白mRNA基因表達與反映心肌缺血酶指標之間的關系可見,針刺組和針刺加全麻組,轉流后熱休克蛋白mRNA表達高于全麻組,而CKMB指標的增高幅度則小于全麻組,表明針刺對心臟手術病人的心肌缺血有一定保護作用。其中增強術中熱休克蛋白的基因表達,減少氧自由基生成可能是針刺增加心肌對缺血心肌的保護作用機制之一。在心臟外科領域,如能通過不同方法誘導心肌HSP70mRNA的表達,對于減輕心肌的缺血再灌注損傷,改善心臟手術的預后具有一定的臨床意義。

術后并發(fā)癥的統(tǒng)計表明,全麻組術后2天以內,由于循環(huán)功能不穩(wěn)定者需用血管活性藥物占31.0%,精神神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥占14.4%,全麻輔助針刺和針麻病人術后均未應用血管活性藥物,未見神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。雖然針麻體外循環(huán)病人轉流中最低溫度較其它兩組要高,但術中心臟全部自動復跳,明顯高于全麻組病人,表明針刺有助于減輕全麻藥對循環(huán)系統(tǒng)的抑制作用,通過內在的調節(jié)機制增強心肌對缺血缺氧的耐受性。

4　參考文獻

1　Robers AJ.Perioperative Myocardial Infarction:Changes in Left Ventricular Performance Related to Coronary Artery Bypass Graft Sugery.Ann Thorac Surg,1983;35:208

2　王祥瑞,杭燕南,孫大金,等.針刺下心臟手術患者血流動力學的變化.中國針灸,1999;19(10):628

3　Ang D,Liberek,K.Skowyral D,et al.Bioloigical Role and Regulation of the Universally Conserved Heat Shock Protein.J Biol Chem,1991;266:24233

4　Yellon DM,Pasini E,Cargnoni A,et al.The Protector Role of Heat Stress in the Ischemic and Reperfused Rabbit Myocardium.J Mol Cell Cardiol,1992;24:895

5　Hutter M,Sievers RF,Barbosa V,et al.Heatshock Protein Induction in Rat Heat.A Direct Correlation Between the Amonut of HeatShock Protein Induced and the Degree of Myocardial Protection.Circulation,1994;89:355

6　Lucchesi BR.Myocardial Ischemia,Reperfusion,and Free Radical Injury.Am J Cardiol,1990;65:141

熱休克蛋白范文第5篇

【摘要】 目的 通過槲皮素灌胃阻斷熱休克蛋白(HSP)70表達，觀察艾灸預處理對大鼠急性胃黏膜損傷指數(shù)及細胞凋亡的影響，以進一步探明艾灸的細胞保護作用及其與HSP70的關系。方法 40只大鼠隨機分為捆綁對照組(A組)、模型組(B組)、艾灸＋模型組(C組)、槲皮素＋艾灸＋模型組(D組)、槲皮素＋模型組(E組)。D、E組每日采用槲皮素灌胃。C、D組每日艾灸足三里、梁門，以上處理共8 d。第9日，B、C、D、E組均采用無水乙醇灌胃制作大鼠急性胃黏膜損傷模型。采用western-blot方法檢測胃黏膜HSP70蛋白表達；TUNEL法檢測胃黏膜細胞凋亡指數(shù)(AI)。結果 與A組比較，模型組大鼠胃黏膜AI明顯增高(P＜0.05)，胃黏膜HSP70表達升高(P＜0.01)。與B組相比，C組大鼠AI明顯降低(P＜0.05)，HSP70表達顯著升高(P＜0.01)；D組大鼠胃黏膜AI值明顯增加(P＜0.01)，HSP70表達未見上調。與C組相比，D組大鼠胃黏膜AI值升高明顯(P＜0.01)，HSP70表達明顯下調。結論 艾灸預處理上調胃黏膜HSP70表達，急性病胃黏膜損傷所致的細胞凋亡被抑制。槲皮素阻斷HSP70合成后，艾灸預處理抑制急性胃黏膜損傷細胞凋亡的作用被取消，證明艾灸預處理對胃黏膜的保護作用確與艾灸上調HSP70表達有關。

【關鍵詞】 槲皮素；艾灸；熱休克蛋白；細胞凋亡；大鼠

Abstract：Objective To observe the effects of pre-moxibustion on gastric mucosal ulcer apoptosis index (AI) and cell apoptosis in acute gastric mucosal injuring rats by perfusing quercetin into the stomach to blocking HSP70 expression， to further prove up the cell protecting effect of moxibustion and its connection with HSP 70. Methods Forty healthy Wistar rats were randomly assigned to group A (binding control)， group B (model)， group C (moxibustion ＋ model)， group D (quercetin ＋ moxibustion ＋ model)， and group E (quercetin ＋ model). Quercetin was given by gavage in group D and E， and moxibustion at Zusanli and Liangmen acupoint in group C and D every day for 8 days. At the ninth day， acute gastric mucosal injuring model was made by ethanol in group B， C， D and E. AI was checked by TUNEL method， and HSP70 by western-blot method in gastric mucosa of all groups. Results Compared with group A， the value of AI was increased obviously (P＜0.05)， and HSP70 expression of gastric mucosa was up-regulated in group B(P＜0.01). Compared with group B， the value of AI was reduced obviously (P＜0.05) and HSP70 expression of gastric mucosa was up-regulated obviously in group C (P＜0.01). The value of AI was increased obviously in group D (P＜0.01)， but HSP70 expression of gastric mucosa has no change. Compared with group C， the values of AI was raised obviously， but HSP70 expression of gastric mucosa was down-regulated markedly in group D. Conclusion While HSP70 expression of gastric mucosa was up-regulated by treatment with pre-moxibustion， the cell apoptosis was suppressed in acute gastric mucosal injuring rats. But after HSP70 expression was blocked by quercetin， the effect of restraining the cell apoptosis with pre-moxibustion was canceled. This study certificates that pre-moxibustion has the gastric mucosal protecting efficacy， and the effect is related with up-regulation of HSP70 expression.

Key words：quercetin；moxibustion；HSP70；cell apoptosis；rat

以往的實驗研究已經(jīng)表明，艾灸可以上調大鼠胃黏膜熱休克蛋白(HSP)70表達，從而達到保護胃黏膜、抑制胃黏膜細胞凋亡的目的。為了進一步明確艾灸的預保護作用與HSP70的關系，本實驗采用槲皮素灌胃阻斷HSP70表達后，觀察了艾灸預處理對急性胃黏膜損傷大鼠胃黏膜損傷程度、細胞凋亡及HSP70表達的變化。

1 實驗材料

1.1 動物

健康Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質量220～250 g，月齡3～4月，河南實驗動物中心提供，合格證號：scxk(豫)2005-0001。

1.2 儀器與試藥

艾條為南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠生產(chǎn)的“天然華佗念盈艾條”(型號：mg-454，規(guī)格：18 mm×200 mm)。兔抗大鼠(HSP70)多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；槲皮素(Sigma)，細胞凋亡試劑盒(德國ROCHE公司)，細胞及組織總蛋白抽提試劑盒(KangChen，KC-415)；BCA蛋白質定量試劑盒(KangChen， KC-430)；KC·化學發(fā)光試劑盒(KangChen， KC-420)。石蠟切片機(美國820型AO切片機)；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學)。低溫離心機(上海安亭科學醫(yī)學儀器廠)；電泳儀(北京六一儀器廠)；磁力攪拌器(太倉華美生化儀器廠)；掃描儀(上海天能儀器有限公司)；圖像分析軟件Image J。

2 實驗方法

2.1 分組

40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組。捆綁組(A組)、模型組(B組)、艾灸＋模型組(C組)、槲皮素＋艾灸＋模型組(D組)、槲皮素＋模型組(E組)，每組8只。

2.2 動物穴位定位及艾灸方法

參考文獻[1]常用動物穴位定位法及擬人對照法定位。足三里：膝關節(jié)后外側，腓骨小頭下約5 mm處。梁門：以胸骨柄上緣至外生殖器連線的上3/4與下1/4交界處為肚臍，胸劍聯(lián)合到肚臍連線中點旁開至鎖骨中線中點處。取大鼠單側足三里、梁門，每日左右交替艾灸。將大鼠捆縛于鼠板，C、D組大鼠取單側穴位，定位剪毛，將艾條固定于自制艾灸支架上，使艾灸垂直對準大鼠穴位或者非穴對照點，距離約0.5 cm，點燃施灸，局部溫度維持在43 ℃左右，每日每穴艾灸約30 min。各組每日處理后松綁，回籠正常飼養(yǎng)，連續(xù)處理8 d。

2.3 造模

采用無水乙醇灌胃法制作大鼠急性胃黏膜損傷模型[2]：大鼠禁食24 h后，用灌胃針將無水乙醇注入大鼠胃腔內，注入劑量為0.6 mL/100 g，造模時間2 h。

2.4 給藥

D、E組大鼠每日早晚以槲皮素灌胃2次，每次灌胃量為100 mg/kg，連續(xù)灌胃8 d。

步驟：A、B、E組大鼠每日捆綁約30 min，不艾灸，E組捆綁后槲皮素灌胃1次；C、D組捆綁后艾灸足三里、梁門約30 min，D組艾灸后槲皮素灌胃，以上連續(xù)處理8 d。第8日處理完畢后松綁回籠，禁食不禁水。第9日，B、C、D、E組大鼠均以無水乙醇灌胃2 h造成急性胃黏膜損傷模型，A組大鼠同時以等量蒸餾水灌胃。造模后每組隨機抽取4只大鼠準備摘取全胃。取胃前，先將幽門部用線結扎，然后用注射器抽取4%多聚甲醛3 mL，自食道注入胃內，拔出針頭，結扎賁門。在兩結扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃，10 min后沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗，計算胃黏膜損傷指數(shù)(UI)。然后取胃竇部組織一小塊(約5 mm×10 mm)，放入4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h，石蠟包埋，供細胞凋亡檢測。剩余每組4只大鼠，于取胃前，將幽門和賁門部結扎，在兩結扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。用冰生理鹽水沖洗干凈，取胃竇部組織一小塊(約5 mm×10 mm)，迅速裝入凍存管中入液氮罐，用于檢測HSP70表達。

2.5 指標檢測

2.5.1 熱休克蛋白70蛋白表達測定

采用western-blot方法檢測。①取凍存胃竇組織放入管中，加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提試劑，勻漿，離心15 min；②配置BCA工作液。分別吸25 μL標準品和2.5 μL待測樣品至微孔板對應孔中，并加入22.5 μL稀釋液；③SDS-PAGE電泳：制備分離膠(pH 8.8)和積層膠(pH 6.8)，加入電泳緩沖液，上樣，電泳；④蛋白質轉移：以吸水紙-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-吸水紙的順序裝配于轉移裝置上。30 mA恒流條件下，4 ℃轉移過夜；⑤膜在5% BSA溶液中室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結合。KC·化學發(fā)光試劑盒中2種試劑等比例混合為反應液。將膜置于反應液中室溫孵育5 min，去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光。每張膜上做1種目的蛋白和相應的內參蛋白。圖片掃描保存為電腦文件，并用Image J分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化，將目的蛋白的灰度值除以內參B-actin的灰度值以校正誤差，其比值(相對灰度值)作為檢測指標單位。

2.5.2 細胞凋亡測定

采用TUNEL(原位末端標記法)法檢測細胞凋亡。組織切片按照常規(guī)方法進行脫蠟及水合，其余步驟按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明進行：滴加末端轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)反應液60 min， PBS洗3次，每次5 min；滴加Anti-fluorescein antibody工作液30 min，DAB顯色，蘇木精復染后漂洗脫水。細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞(凋亡細胞)。采用IMS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(上海申騰信息技術有限公司)，光鏡下(10×40倍)隨機選5個視野，每個視野觀察100個細胞，計數(shù)陽性細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)＝陽性細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù)×100%。

3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用x±s表示，并進行正態(tài)性檢驗。符合正態(tài)分布者，多組計量資料采用方差分析，方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法；不符合正態(tài)分布者采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗(K Independent Samples)。所有數(shù)據(jù)使用SPSS11.5 for Windows軟件進行處理。

4 結果

(見表1)表1 各組大鼠AI值及HSP70表達比較(略)注：與A組比較，P＜0.05，P＜0.01；與B組比較，P＜0.05， P＜0.01；與C組比較，P＜0.05，P＜0.01

5 討論

HSPs是生物體(或離體培養(yǎng)細胞)在不良環(huán)境因素作用下所產(chǎn)生的一組具有高度保守性的應激蛋白，它普遍存在于整個生物界，幾乎所有的細胞均能合成HSPs。大多數(shù)HSPs因環(huán)境改變而被誘導。如熱損傷、缺血、氧化應激、射線、組織損傷、病毒、細菌以及某些化學物質如乙醇、亞砷酸鈉等[3]。根據(jù)其分子量及等電點不同將HSPs分成5大類(或家族)：低分子量HSPs家族、中等分子量HSPs家族、HSP70家族、HSP90家族等。其中HSP70家族是研究最為深入的一種。機體細胞在受到各種應激，如高熱、氧化等有害應激時，產(chǎn)生的HSP70可以增強細胞對損害的耐受程度，維持細胞的正常功能代謝，提高細胞在應激狀態(tài)下的生存率。如將培養(yǎng)細胞置于中等溫度下誘導HSP70合成，能避免高溫應激時的細胞畸變。進一步試驗證明，不同類型的細胞和物種經(jīng)熱誘導合成HSPs后能提高其在高溫應激下的生存率[4-5]，此即為HSPs的細胞保護作用。

現(xiàn)有資料表明，HSP70可從以下幾方面發(fā)揮其細胞保護作用：①提高細胞對應激原的耐受性。②分子伴侶作用(Molecular chaperones)：HSP70作為主要的分子伴侶蛋白，與新生、未折疊、錯折疊或聚集的蛋白質相結舍，減少產(chǎn)生不溶性聚集物的危險性，促進某些變性蛋白的降解和清除，以維護細胞功能。③抗細胞凋亡作用[6]：阻斷或抑制HSPs誘導細胞凋亡，而HSPs的高表達則能發(fā)揮細胞保護作用，抑制細胞凋亡。④抗氧化antioxidition)作用：HSP70通過抑制氧自由基的產(chǎn)生，清除氧自由基，釋放和增加內源性過氧化物酶(SOD)水平，實現(xiàn)細胞保護作用[7]。此外，HSP70在參與機體免疫、抗腫瘤、細胞周期調控、胚胎形成的細胞分化和胚胎發(fā)育過程中也扮演重要角色。

在正常胃組織中可檢測到HSPs的少量表達，但在應激條件下，胃黏膜可出現(xiàn)大量HSP表達[8]。胃黏膜經(jīng)常受到食物、乙醇、病原體等因素的刺激，細胞應激誘發(fā)凋亡，依照細胞適應性保護原則，胃黏膜上皮細胞能積極調整保護機制，促進HSP合成，減輕應激損傷[9]。已有多項研究表明，HSPs可以防止應激性潰瘍的發(fā)生[10-l1]，并對高熱、缺血再灌注、氧化應激和化學毒物等因素引起的受損胃黏膜細胞有促進功能恢復的作用。HSP70作為分子伴侶在胃黏膜應激反應中能保護線粒體并減少應激引起的細胞內蛋白質變性和聚集，減少細胞凋亡[12-14]。

現(xiàn)代醫(yī)學多采用短暫的缺血、缺氧、高溫等物理化學的預處理方法來啟動機體內源性保護機制[15-17]，以加強機體對隨后疾病的抵抗與耐受力。但上述這些預處理方法的安全性及可操作性尚存爭議，因此其臨床應用受到限制。近年將針灸作為一種“預處理”的方法，來研究其“預適應”作用的報道逐漸增多，并提出“穴位針刺預處理”[18]、“針灸預處理”、“針灸良性預應激”[19]等概念。經(jīng)過大量實驗和臨床研究顯示，針灸預處理對心、腦、胃腸、脊髓等部位缺血缺氧有良好的保護作用。大量文獻提示，針灸預處理的細胞保護作用與HSP密切相關[20-25]，故人們認為，如果通過針灸預處理的手段，誘導HSPs等生物活性物質產(chǎn)生，啟動內源性保護體系，提高機體防御疾病能力，對于推動中醫(yī)藥學乃至生物學發(fā)展具有重要意義。

筆者所在課題組曾報道艾灸對胃黏膜細胞的損傷修復具有良好的細胞保護作用，如艾灸足三里、梁門能降低應激性潰瘍，胃黏膜丙二醛(MAD)和內皮素(ET)含量，對受損胃黏膜出現(xiàn)抗氧化損傷作用；抑制胃黏膜細胞凋亡，刺激胃黏膜上皮細胞增殖與修復。而以上作用均與艾灸上調應激性潰瘍大鼠胃黏膜細胞HSP70蛋白其及基因表達有一定關系[7，25-28]。為了確認HSPs與細胞保護作用之間的關系，常采用基因敲除或蛋白質合成阻斷方法來驗證兩者之間關系。槲皮素(quercetin)因其具有抑制HSP轉錄與翻譯的特點已被廣泛應用于HSP的研究中[29-31]。如姜氏等[32]發(fā)現(xiàn)腹腔注射鋅離子可誘導大鼠視網(wǎng)膜HSP72表達，而對照組注射槲皮素后HSP72呈陰性表達，且實驗組凋亡細胞少于實驗對照組，表明通過誘導HSP72可減輕病理性細胞凋亡的發(fā)生。因HSP70對腫瘤細胞也具有保護作用，故也有人采用槲皮素特異性抑制腫瘤細胞HSP70的表達來誘導腫瘤細胞凋亡[33]。

實驗表明，適當劑量的槲皮素灌胃可抑制胃黏膜細胞HSP合成，但不會對大鼠產(chǎn)生毒性作用[34]。為了進一步驗證艾灸的預保護作用與HSP70的關系，本實驗采用槲皮素灌胃方法阻斷HSP70合成后，觀察了艾灸預處理對急性胃黏膜損傷大鼠胃黏膜損傷程度，HSP70表達及細胞凋亡的影響。實驗結果表明，D組大鼠HSP70含量明顯低于C組(P＜0.01)，接近于B組和A組(P＞0.05)，說明槲皮素確實阻斷了急性胃黏膜損傷大鼠胃黏膜HSP70的合成。同時，D組大鼠UI和AI均明顯高于C組。這表明槲皮素阻斷HSP70的合成后，艾灸預處理對急性胃黏膜損傷的保護作用也隨之減弱，表現(xiàn)為胃黏膜損傷加劇和細胞凋亡增多。由此再一次證明，艾灸預處理對胃黏膜的保護作用確與艾灸上調HSP70表達有關，艾灸作為激發(fā)機體內源性保護機制的有效手段，其作用機制的分子生物學基礎與HSP70的表達是分不開的。

參考文獻

[1] 李忠仁.常用實驗動物針灸穴位圖[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007. 314－329.

[2] Takano H， Satoh M， Shimada A， et al. Cytoprotection by metallothionein against gastroduodenal mucosal injury caused by ethanol in mice[J]. Lab Invest，2000，80(3)：371－377.

[3] Maio AD. Heat Shock Proteins：facts，thoughts，and dreams[J]. Shock，1999，l1(1)：1－12.

[4] Santoro G. Heat shock factors and the control of the stress response[J]. Biochem Pharmacol，2000，59(1)：55－63.

[5] 袁志強，彭毅志.熱休克蛋白70與細胞保護[J].國外醫(yī)學·臨床生物化學與檢驗學分冊，2002，23(5)：287－288.

[6] 于 楓，張 達，田文儒.熱休克蛋白70與細胞凋亡[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2005，(1O)：84－85.

[7] 常小榮，彭 娜，易受鄉(xiāng)，等.艾灸足三里和梁門穴誘導熱休克蛋白70抗大鼠胃黏膜氧化損傷作用[J].世界華人消化雜志，2006，14(35)：3405－3408.

[8] 向廷秀，王丕農(nóng).熱休克蛋白在胃潰瘍中的表達及意義[J].世界華人消化雜志，2003，ll(5)：628－630.

[9] 劉瑋麗，姒健敏.熱休克蛋白在胃腸疾病中的研究進展[J].中華內科雜志，2004，43(1)：7l－73.

[10] Mizushima T， Tsutsumi S， Rokutan K， et al. Supression of ethanol-induced apoptosis DNA fragmentation by geranylgeranylacetone in cultured guinea pig gastric mucosal cells[J]. Dig Dis Sci，1999， 44：510－514.

[11] Itoh YH， Noguehi R. Pre-treatment with mild whole body heating prevents gastric ulcer induced by restraint and water-immersion stres in rats[J]. Int J Hyperthermia，2000，l6(2)：183－19l.

[12] Tsukimi Y， Okabe S. Recent advances in gastrointestinal pathophysiology：role of heat shock proteins in mucosal defense and ulcer healing[J]. Biol pharm Bull，2001，24：1－9.

[13] 陳國裕，王志榮，陳錫美.熱休克蛋白在胃黏膜保護中的作用[J].世界華人消化雜志，2002，10(8)：969－997.

[14] Rokutan K. Role of heat shock proteins in gastric mucosal protection[J]. J Gastroenterol Hepatol，2005，15(Suppl)：D12－19.

[15] J Moncayo， GR de Freitas， J Bogousslavsky， et al. Do transient ischemic attacks have a neuroprotective effect[J]. Neurology， 2000，54(11)：2089－2094.

[16] 李洪波，陳潤芬，王長謙.間歇性低氧預處理對缺血心肌的促血管生成作用的實驗研究[J].中國病理生理雜志，2004，20(1)：103－108.

[17] 呂國蔚，崔秀玉，趙蘭峰.低氧預適應的腦機制[J].中國應用生理學雜志，2004，20(1)：98－102.

[18] 解秸萍，李曉泓.針灸預處理的作用規(guī)律及機理研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2007，25(2)：398－402.

[19] 李曉泓.針灸“治未病”與“針灸良性預應激假說”[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2001，26(3)：82－85.

[20] 陳澤斌，王 華.大鼠穴位針刺預處理抗腦缺血再灌注損傷的作用[J].針刺研究，2003，28(3)：165－169.

[21] Kobayashi K. Induction of heat-shock protein(hsp)by moxibustion[J]. Am J Chin Med，1995，23(3/4)：327－330.

[22] 劉旭光，宋開源，郝 亮，等.艾灸對實驗性RA大鼠熱休克蛋白(HSP70)表達的影響[J].中醫(yī)藥學刊，2003，21(7)：1034－1036.

[23] 王祥瑞，張騰飛，馬曙亮.電針刺激對心臟手術病人心肌熱休克蛋白mRNA基因表達的影響[J].中國針灸，2001，21(2)：99－101.

[24] 王勁柏.刺血療法對實驗性腦缺血大鼠相關腦區(qū)HSP70mRNA的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2008，(6)：811－812.

[25] 易受鄉(xiāng)，彭 艷，常小榮，等.艾灸足三里、梁門穴對應激性潰瘍大鼠胃黏膜細胞凋亡的干預作用[J].世界華人消化雜志，2006，14(33)：3163－3168.

[26] Shou-Xiang Yi， Yan Peng， Xiao-Rong Chang， et al. Effect of pre-moxibustion on apoptosis and proliferation of gastric mucosa cells[J]. World J Gastroenterol，2007，13(15)：2174－2178.

[27] Xiao-Rong Chang， La Peng， Shou-Xiang Yi， et al. Association of high expression in rat gastric mucosal heat shock protein 70 induced by moxibustion pretreatment with protection against stress injury[J]. World J Gastroenterol，2007，13(32)：4355－4359.

[28] 常小榮.彭 娜，易受鄉(xiāng)，等.艾灸預處理對應激性潰瘍大鼠胃黏膜HSP70蛋白及mRNA表達的影響[J].世界華人消化雜志，2006，14(13)：13－15.

[29] Nakanoma T， M Ueno， M Iida， et al. Effects of quercetin on the heat-induced cytotoxicity of prostate cancer cells[J].Int J Urol， 2001，8：623－630.

[30] Nagai N， Nakai A， Nagata K， et al. Quercetin suppresses heat shock response by down regulation of HSF1[J]. Biochem Biophys Res Commun，1995，208：1099－1105.

[31] Mitsuhiro F， Masami N， Mickio M， et al. Synegistic cytotoxic effect of querecetin and heat treatment in a lymphoid cell line (OZ) with low HSP70 expression[J]. Leukemia Res，1997，21(2)：139－143.

[32] 姜松梅，王欽玲，孫慧明，等.HSP72 在視網(wǎng)膜的表達及其對抗細胞凋亡作用的研究[J].山東大學耳鼻喉眼學報，2006，20(2)：167－169.