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本文作者：張鳳春1,2，南飛飛1，徐海燕1，王紅霞3，唐雷3，馬越3，徐迎春3作者單位：1上海交通大學醫(yī)學院附屬蘇州九龍醫(yī)院腫瘤科2海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院腫瘤科3上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院腫瘤科

原代乳腺癌細胞微球體的特征

結果顯示，2組的細胞密度和微球體大小均十分相似，提示采用細胞懸浮培養(yǎng)法可以從乳腺癌組織中成功培養(yǎng)獲得乳腺癌細胞微球體（圖1）。45例乳腺癌組織標本中，共有12例獲得原代乳腺癌細胞微球體，其中8例（66.70%）病理分級為Ⅲ級、4例（33.30%）為Ⅱ級。根據(jù)ER、PR和HER-2的表達情況對這12例患者進行分型：luminalA型9例，luminalB型1例，ER、PR和HER-2三陰性2例。培養(yǎng)至第7～10天，可觀察到原代乳腺癌細胞微球體的形成，此后微球體逐漸增大，數(shù)目逐漸增多；培養(yǎng)至第14天時，微球體趨于穩(wěn)定，直徑可達100μm。12例患者中，2例的微球體形成率為6.0‰，2例為7.0‰，1例為9.0‰，3例為10.0‰，以及11.0‰、12.0‰和13.0‰和15.0‰各1例；平均微球體形成率為（9.67±2.84）‰。

原代乳腺癌細胞微球體干細胞樣表型特征的鑒定

在獲得乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細胞微球體細胞后，采用FCM分析其微球體細胞中CD44和CD24的表達情況，結果顯示微球體細胞表現(xiàn)出CD44＋/CD24low/－的特征，且CD44＋/CD24low/－表型細胞所占百分率（24.71%）明顯高于原代乳腺癌細胞的1.30%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2A）。對原代乳腺癌細胞微球體細胞進行了干細胞相關基因表達量的測定。RFQ-PCR檢測結果顯示，原代乳腺癌細胞微球體細胞中SOX2、Nanog、KLF4、OCT-4和MDR1mRNA的表

乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細胞微球體形成率與臨床病理特征之間的關系

bcsc是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉移的根源，BCSC對化療和放療均表現(xiàn)出明顯的耐藥，可能直接影響乳腺癌患者的無病生存期和總生存期。因此，根據(jù)是否形成原代乳腺癌細胞微球體進行分組，并分析了微球體形成與患者臨床病理特征之間的關系。研究結果顯示，12例獲得原代乳腺癌細胞微球體，其微球體形成與絕經(jīng)情況、組織學分級、PR狀態(tài)、HER-2狀態(tài)和腫瘤復發(fā)明顯相關（P＜0.05，表1），與患者的發(fā)病年齡和初潮年齡也具有一定的相關性（P＜0.05，表1）。生存分析顯示，微球體形成與否與DFS和OS無明顯相關性（P＞0.05，表1）進一步按照平均微球體形成率，將12例患者分為微球體高形成率組（≥9.0‰）和微球體低形成率組（＜9.0‰），未發(fā)現(xiàn)其與患者的臨床病理特征及分子分型之間存在相關性，推測可能與本組病例數(shù)較少有關（表3）。

近年來的大量實驗研究證實，腫瘤組織和腫瘤細胞系中存在著不同分化階段的細胞，其中只有極少量的腫瘤細胞充當干細胞的角色，具有自我更新和多向分化的潛能，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵性的作用，這些細胞被稱之為腫瘤干細胞[1]。細胞懸浮培養(yǎng)法是利用干細胞能夠在富含生長因子的無血清培養(yǎng)液中懸浮生長并形成微球體的特性以富集干細胞。最早由Dontu等[2]和Ponti等[5]采用該方法分別從人乳腺組織和人乳腺癌組織來源的細胞中培養(yǎng)獲得微球體，此后便廣泛應用于乳腺癌細胞系來源的腫瘤干細胞的富集[6]。然而，對于乳腺癌組織來源的原代BCSC的研究[7,8]卻很少。

本研究選擇45例乳腺癌患者的乳腺癌組織，參照乳腺癌細胞系MCF-7來源干細胞的體外培養(yǎng)條件，采用無血清培養(yǎng)方式和細胞懸浮培養(yǎng)形成乳腺癌細胞微球體的方法，獲得12例患者乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細胞微球體。由于原代乳腺癌細胞微球體的培養(yǎng)時間較長，因此微球體形成率較低，平均僅為（9.67±2.84）‰，較乳腺癌細胞系MCF-7的微球體形成率低。推測可能與如下因素有關：從乳腺癌組織中分離乳腺癌細胞時所采用的機械和化學消化對細胞可能產(chǎn)生一定的損傷，導致細胞活性下降；體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境不同，從體內(nèi)分離得到的細胞需要一段適應期才能適應體外培養(yǎng)環(huán)境；不同組織學類型的乳腺癌組織中干細胞的數(shù)量不同。

本研究結果顯示，乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細胞微球體細胞中的CD44＋/CD24low/－表型細胞所占百分率高于原代乳腺癌細胞（分別為24.71%和1.30%，P＜0.05），提示原代乳腺癌細胞微球體富集了BCSC樣表型細胞。干細胞相關基因Nanog、OCT-4、SOX2和KLF4都是維持胚胎干細胞自我更新以及多能性轉錄調控網(wǎng)絡中的核心轉錄因子[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細胞微球體細胞均表達SOX2、KLF4、Nanog和OCT-4mRNA，且表達量明顯高于原代乳腺癌細胞（P＜0.05），表明前者具有干細胞樣基因表達特征。本研究還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細胞微球體細胞表達MDR1mRNA，提示其對化療藥物的敏感性較差，因此應選擇其他有效的治療方法進行干預。乳腺癌臨床病理特征和分子分型與治療選擇及預后相關，但對于原代BCSC數(shù)是否會影響預后尚無定論。Idowu等[13]采用免疫組織化學方法檢測了50例乳腺癌組織CD44＋/CD24low/－的表達，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌中CD44＋/CD24low/－表型細胞所占百分率較高。李媛[14]報道，CD44＋/CD24low/－細胞所占百分率較高者更易發(fā)生遠處轉移，特別是骨轉移。田允鴻等[15]檢測了87例乳腺癌組織來源的CD44＋/CD24low/－腫瘤干細胞的平均含量，結果顯示ER和PR與腫瘤干細胞含量及能否成功形成球囊明顯相關，而HER-2、年齡和T分期等與腫瘤干細胞含量及能否成功形成球囊無明顯相關性。本研究中，按照平均微球體形成率將患者分成微球體高形成率組（≥9.0‰）和微球體低形成率組（＜9.0‰），結果未發(fā)現(xiàn)微球體形成率與臨床病理特征和分子分型之間存在相關性，推測可能與本組病例數(shù)較少有關。12例獲得原代乳腺癌細胞微球體，其微球體形成率與絕經(jīng)情況、組織學分級、PR狀態(tài)、HER-2狀態(tài)和腫瘤復發(fā)明顯相關（P＜0.05），與患者的發(fā)病年齡和初潮年齡也具有一定的相關性（P＜0.05）。這些結果均提示，原代乳腺癌細胞微球體數(shù)量可能成為重要的療效及預后判斷指標。今后有必要開展長期的隨訪研究，同時擴大樣本量以進行進一步的驗證。

乳腺癌作為實體腫瘤，其干細胞的純化十分困難，一方面是由于原代BCSC數(shù)量非常少，另一方面也是因為缺少明確的干細胞表面標志物。因此，尋找能夠有效分離并富集原代BCSC的新方法仍然是BCSC研究中亟待解決的問題。本研究利用獲自于乳腺癌患者腫瘤組織的乳腺癌細胞，在無血清的干細胞培養(yǎng)條件下獲得原代乳腺癌細胞微球體，這些微球體細胞高表達干細胞相關基因，并具有自我更新和增殖能力，提示其含有相對較多的腫瘤干細胞樣表型細胞，且與患者的部分臨床病理特征相關，可能為未來以乳腺癌患者腫瘤組織來源的BCSC為靶點的研究以及乳腺癌預后的判斷提供參考依據(jù)。