單鏈抗體臨床治療探討

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關(guān)鍵詞：單鏈抗體

單鏈抗體除本身的治療作用外，還可作為載體與細(xì)胞因子等結(jié)合，構(gòu)建成雙功能抗體用于腫瘤的導(dǎo)像治療。據(jù)文獻(xiàn)報道［1~3］各衍生因子兩個完整基因融合成單一蛋白，經(jīng)抗腫瘤活性檢測發(fā)現(xiàn)，融合蛋白具有雙重活性，但融合蛋白的親和性及抗腫瘤活性分別較衍生因子的功能及活性有所變化，可能由于融合蛋白結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致功能及活性的變化。利用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源分析融合蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)，為進(jìn)一步探討單鏈雙功能抗體基因融合蛋白提供依據(jù)。

1雙功能抗體的研究進(jìn)展

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤的藥敏基因治療成為各國學(xué)者研究的熱點(diǎn)［3~5］。將目的基因?qū)氚屑?xì)胞是基因治療過程中的一個重要環(huán)節(jié)，因?yàn)槟康幕驅(qū)氚屑?xì)胞效率的高低將直接影響基因治療的效果甚至成敗。由逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移所面臨的最大問題是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，原因之一是由于包裝后難以得到穩(wěn)定產(chǎn)生較高滴度感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞系。單鏈抗體（ScFv）是由Fv抗體衍生而來，將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過一段連接肽連接而成，ScFv具有天然抗體的親和力，而分子只有完整抗體的六分之一。具有分子小、穿透力強(qiáng)、容易進(jìn)入實(shí)體瘤周圍的血液循環(huán)等特點(diǎn)，體內(nèi)應(yīng)用具有較大的分布容積和較高的組織分布比例，ScFv是構(gòu)建雙功能抗體，雙特異性抗體等多種新功能抗體分子的理想元件。一個蛋白或蛋白片段可以融合到ScFv片段上以配備附加的性質(zhì)，如免疫毒素的產(chǎn)生，是通過將一個腫瘤特異的ScFv或Fab融合到一個內(nèi)源化能殺死靶細(xì)胞的毒素上。許多細(xì)胞特異抗體可將試劑傳遞到腫瘤部位發(fā)揮其細(xì)胞毒元件的作用。腫瘤特異性抗體片段已經(jīng)與細(xì)胞因子融合［4~8］。在這種情況下，稱免疫細(xì)胞因子的分子注射到患者體內(nèi)，在腫瘤細(xì)胞表面積聚，可以激活腫瘤附近的T淋巴細(xì)胞。這些融合蛋白內(nèi)在的腫瘤結(jié)合活性允許使用低濃度，沒有通常與系統(tǒng)細(xì)胞因子注射相關(guān)的副作用。

細(xì)胞因子融合蛋白均具有衍生因子的雙重活性，其中有一些的活性較各自野生型低，或者與野生型因子的相加一致，或者其活性高于衍生因子的相加活性，人工構(gòu)建的新蛋白可能具有與衍生因子無關(guān)的新活性［9~11］。事實(shí)證明：具有不同功能域的復(fù)合蛋白質(zhì)以及連接肽的設(shè)計(jì)是今后尋找新的治療因子的有效途徑和研究方向。生物信息學(xué)可以促進(jìn)藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過程，即充分利用生物信息學(xué)的生物學(xué)和遺傳學(xué)信息來尋找和開發(fā)以基因?yàn)榛A(chǔ)的藥物。

2雙功能抗體的表達(dá)及其生物學(xué)性質(zhì)的預(yù)測

對于cDNA序列包含一個完整的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，重要的則是分析所編碼蛋白質(zhì)的功能。蛋白質(zhì)序列的生物信息學(xué)分析是從理論分析邁向?qū)嶒?yàn)研究的最為重要的部分。如果擬對所感興趣的基因投入實(shí)驗(yàn)研究，那么，基于生物信息學(xué)獲得盡可能多的關(guān)于該基因/蛋白質(zhì)的信息是十分重要和極其重要的，尤其是當(dāng)采用生物信息學(xué)的分析得到其結(jié)構(gòu)功能域的信息后，將對研究思路的制定提供重要的指導(dǎo)信息［12，13］。

傳統(tǒng)生物學(xué)認(rèn)為，蛋白質(zhì)的序列決定了它的結(jié)構(gòu)，也就決定了它的功能［14，15］。因此，隨著近10年來生物學(xué)分子序列信息的爆炸性增長，大大促進(jìn)了各種序列分析和預(yù)測技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)可以用理論預(yù)測的方法獲得大量的結(jié)構(gòu)和功能信息，用生物信息學(xué)的方法，通過計(jì)算機(jī)模擬和計(jì)算來“預(yù)測”出未知蛋白質(zhì)信息或提供與之相關(guān)的輔助信息，可以用較低的成本和較快的時間就能獲得可靠的結(jié)果［16~18］。重組融合蛋白是通過DNA重組的方法，將功能上相關(guān)的兩種蛋白用連接肽連接，以達(dá)到優(yōu)化蛋白功能的目的，如免疫毒素和細(xì)胞因子融合蛋白，并已用于腫瘤治療。我們在構(gòu)建融合蛋白之后，運(yùn)用生物信息學(xué)資源DNAssist核酸序列分析軟件分析ScFv-TNF-αDNA序列翻譯并獲得了氨基酸序列，蛋白質(zhì)分析軟件（ANTHEPROTV5）分析融合蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)。利用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源進(jìn)行分析預(yù)測融合蛋白的性質(zhì)，為進(jìn)一步探討單鏈雙功能抗體基因融合蛋白提供依據(jù)。構(gòu)建重組導(dǎo)向的融合蛋白［19］，通過重組PCR方法在編碼ScFv與TNF-α的堿基之間引入酶切位點(diǎn)，并克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體PLxSN上表達(dá)，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染PA317包裝細(xì)胞，G418篩選10天后共挑選50個細(xì)胞集落，擴(kuò)大培養(yǎng)后測定29個細(xì)胞集落的病毒滴度，篩選出一株cfu>1×109/L的感染性重組病毒產(chǎn)生細(xì)胞系C26。

【參考文獻(xiàn)】

1StrubeRW，ChenSY.Characterizationofanti-cyclinEsingle-chainFvantibodiesandintrabodiesinbreastcancercells：enhancedintracellularstabilityofnovelsFv-F(c)intrabodies.JImmunolMethodsK，2002，263(1-2)：149-167.

2KimEJ，ChoD，HwangSY，etal.Interleukin-2fusionproteinwithanti-CD3single-chainFv(sFv)selectivelyprotectsTcellsfromdexamethasone-inducedapoptosis.Vaccine，2001，20(3-4)：608-615.

3PengLS，PenichetML，DelaCruzJS，etal.Mechanismofantitumoractivityofasingle-chaininterleukin-12IgG3antibodyfusionprotein(mscIL-12.her2.IgG3).JInterferonCytokineRes，2001，21(9)：709-720.

4ScherfU，BenharI，WebberKO，etal.Cytotoxicandantitumoractivityofarecombinanttumornecrosisfactor-B1(Fv)fusionproteinonLeYantigen-expressinghumancancercells.ClinCancerRes，1996，2(9)：1523-1531.

5ChenP，ChenCQ，YaoLB，etal.ReconstructionandanalysisofaHumansmallmolecularantibodytotumornecrosisfactoralpha.ShengwuHuaxueYuShengwuWuliXuebao，2001，33(1)：71-76.

6WuestT，GerlachE，BanerjeeD，etal.TNF-Selectokine：anovelprodruggeneratedfortumortargetingandsite-specificactivationoftumornecrosisfactor.Oncogene，2002，21(27)：4257-4265.

7MaJ，LiZ，LuoD.Singlechainantibodyvaccinationinmiceagainsthumanovariancancerenhancedbymicrospheresandcytokines.JDrugTarget，2003，11(3)：169-176.

8BremerE，KuijlenJ，SamploniusD，etal.Targetcell-restrictedand-enhancedapoptosisinductionbyascFv：sTRAILfusionproteinwithspecificityforthepancarcinoma-associatedantigenEGP2.IntJCancer，2004，109(2)：281-290.

9TrevorKT，HershEM，BraileyJ，etal.TransductionofhumandendriticcellswitharecombinantmodifiedvacciniaAnkaravirusencodingMUC1andIL-2.CancerImmunolImmunother，2001，50(8)：397-407.

10NiethammerAG，XiangR，RuehlmannJM，etal.Targetedinterleukin2therapyenhancesprotectiveimmunityinducedbyanautologousoralDNAvaccineagainstmurinemelanoma.CancerRes，2001，61(16)：6178-6184.

11LiuX，ZhangL，ZhangM，etal.Co-modificationofIL-2-TNFalphafusiongeneandB7.1genetomurinebreasttumorcellsleadstoimprovedtumorrejectionandvaccineeffect.ChinMedJ(Engl)，2000，113(2)：167-171.

12張成崗，賀福初.生物信息學(xué)方法與實(shí)踐.北京：科學(xué)出版社，2002，126-136.

13黃韌，薛成.生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源與應(yīng)用.廣州：中山大學(xué)出版社，2003，237-306.

14GuexN，PeitschMC.SWISS-MODELandtheSwiss-PdbViewer：Anenvironmentforcomparativeproteinmodelling.Electrophoresis，1997，18(15)：2714-2723.

15GuexN，DiemandA，PeitschMC.Proteinmodellingforall.TiBS，1999，24(9)：364-367.

16ClaverieJM.Effectivelarge-scalesequencesimilaritysearches.MethodsEnzymol，1996，266：212-227

putationalgeneidentification.JMolMed，1997，75(6)：389-393.

18GelfandIM，KisterAE.Analysisoftherelationbetweenthesequenceandsecondaryandthree-dimensionalstructuresofimmunoglobulinmolecules.ProcNatiAcadSciUSA，1995，92(24)：10884-10888.

19張建華，馬保安，張惠中.及重組人融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及瞬時表達(dá).腫瘤防治雜志，2002，9(2)：131-134.