釀酒酵母酶活性的變化

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本文作者：張利王碩劉寶祥姚繼兵董亮趙長新作者單位：大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院

釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的酵母，傳統(tǒng)上用于制作面包和饅頭等食品，工業(yè)上，主要應(yīng)用于發(fā)酵谷類釀造酒類[1]。釀酒酵母的老化問題直接影響發(fā)酵的效率和產(chǎn)物，但目前沒有明確的方法來鑒定酵母的老化程度，因此，研究釀酒酵母酶老化過程中活力的變化趨勢(shì)，對(duì)于現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)有著極其深遠(yuǎn)的意義。酵母細(xì)胞內(nèi)含有多種酶，如：蛋白酶、蔗糖酶、核酸酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、乳糖酶、脂肪酶等[2-4]。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白酶、蔗糖酶、脂肪酶和核酸酶進(jìn)行測(cè)定分析，最終確定酵母老化過程收稿日期：2011-11-28*通訊作者作者簡介：張利(1986—)，男，遼寧寬甸人，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。中酶活力的變化趨勢(shì)，為酵母老化的鑒定奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑和設(shè)備

氫氧化鈉、福林試劑、酪蛋白、三氯乙酸、碳酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、可溶性淀粉、葡萄糖、醋酸鈉、鄰硝基苯酚(ONP)。B-22M高速冷凍離心機(jī)：ThermoIEC；超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝科器研究所；恒溫水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)：上海洪福儀器儀表有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；微量天平：上海方瑞儀器廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析有限公司。

1.2菌種

釀酒酵母FCC2144：大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏所提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)條件及代數(shù)的定義

本實(shí)驗(yàn)將從菌種保藏中心斜面上接下的菌種定義為第1代菌種。采用L-B培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)，24h轉(zhuǎn)接1次，并且定義為1代。將種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中于29.5℃、180r/min搖床培養(yǎng)60h。

1.3.2粗酶液的制備

將發(fā)酵液于4℃、10000r/min離心15min，收集菌體，并用去離子水洗滌菌體沉淀3次，將菌體放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥處理。然后稱取干燥后的菌體按5%(w/v)的比例溶于pH8.8的磷酸緩沖液中，菌懸液在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，超聲波條件為：工作3s，間歇5s，功率550W，溫度4℃，全程時(shí)間10min。將細(xì)胞破碎液于4℃、10000r/min離心15min，收集上清液，上清液即為粗酶液。

1.3.3乳糖酶活力測(cè)定方法

乳糖酶又稱β-D乳糖苷酶，能催化鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)水解生成鄰硝基苯酚(ONP)，ONP在中性和堿性范圍呈黃色，在420nm處有最大吸收峰。取3個(gè)15×100的試管，分別加入pH7.0的磷酸緩沖液2.8mL，37.5℃恒溫水浴5min，加入100μL濃度為4mg/mL的ONPG溶液和100μL粗酶液，37.5℃恒溫反應(yīng)5min，于420nm處比色取平均值[5]。乳糖酶活力定義：在37.5℃下，1mL乳糖酶每分鐘催化ONPG水解生成1μmol鄰硝基酚(ONP)定義為1個(gè)酶活力單位。

1.3.4蛋白酶活力測(cè)定方法

采用國標(biāo)法測(cè)定蛋白酶活力。取3個(gè)15×100的試管，加入粗酶液1mL，置于40℃水浴中預(yù)熱5min，然后在各試管中加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1mL，精確反應(yīng)10min，時(shí)間到后馬上再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以終止反應(yīng)。繼續(xù)放置在水浴鍋中保溫20min，時(shí)間到后立即4000r/min離心10min取上清液。然后另取3個(gè)試管，分別加入上清液1mL，再加入0.4mol碳酸鈉5mL、已稀釋的福林試劑1mL，搖勻后置于40℃水浴鍋中保溫20min后在660nm出測(cè)定吸光值[6-7]。參比實(shí)驗(yàn)操作方法同上，唯在加入酪蛋白前先加入0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。樣品的平均光密度-參比的平均光密度=凈OD值蛋白酶活力定義：在40℃下，每分鐘蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1個(gè)活力單位。

1.3.5α-淀粉酶活力測(cè)定

通過3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的含量來反映α-淀粉酶的活力。取1mL酶液于15×100的試管中，70℃放置15min，迅速冷卻后40℃預(yù)熱15min后，加入含量為1%的可溶性淀粉(40℃預(yù)熱)2mL，搖勻，40℃反應(yīng)5min，加入0.4mol/L氫氧化鈉4mL，搖勻，取1mL反應(yīng)液加1mLDNS，沸水浴顯色5min，迅速冷卻，蒸餾水定容至10mL，520nm下測(cè)定OD值[8-9]。參比：1mL酶液，70℃放置15min迅速冷卻后，40℃預(yù)熱15min，加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液，搖勻，加入1%可溶性淀粉2mL(40℃預(yù)熱)，其余同上。空白：1mL蒸餾水+1mLDNS，其余同上。酶活力定義：在上述條件下，每分鐘由底物催化生產(chǎn)1μg還原糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

1.3.6核酸酶活力測(cè)定方法

核酸降解后，降解產(chǎn)物的吸光值會(huì)增加，即所謂的增色效應(yīng)，通過OD260值的改變來鑒定核酸酶的活力大小。參照Yasuda等[10]方法，在4mL反應(yīng)體系中加入1mL酵母胞內(nèi)核酸酶提取液，與3mL底物迅速混勻，在3min內(nèi)迅速測(cè)定混合液OD260值的變化。底物液的配制：2mg放線菌DNA，60mL去離子水，0.1mol/L的醋酸鈉緩沖液10mL，混勻。酶活力定義：25℃下，每分鐘降解放線菌DNA的產(chǎn)物使260nm處吸光值變化0.01所需要的酶量定義為1個(gè)活力單位。

2結(jié)果與討論

2.1酵母生長曲線

本實(shí)驗(yàn)對(duì)酵母進(jìn)行老化培養(yǎng)，分別對(duì)第1代、第5代、第10代、第15代酵母的發(fā)酵液進(jìn)行每3h取1次樣品，在600nm出測(cè)定光密度(OD值)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，釀酒酵母在8h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，24h進(jìn)入穩(wěn)定期，不同代數(shù)之間有輕微的差異性，即隨著代數(shù)的升高，酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期和穩(wěn)定生長期的時(shí)間提前了，但酵母在穩(wěn)定生長期的菌濃度隨著代數(shù)的增加而減小。

2.2釀酒酵母老化過程中乳糖酶活力的變化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)酶液進(jìn)行3次平行測(cè)定，取平均值所得結(jié)果見表1。以鄰硝基苯酚的濃度為橫坐標(biāo)、OD值(420nm)為縱坐標(biāo)，得鄰硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。根據(jù)酶活力定義及鄰硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，酵母乳糖酶活力在酵母老化過程中降低，從第1代的4.286降低到15代的1.261，大約降低70%。酵母乳糖酶活力的減弱說明酵母細(xì)胞在老化過程中對(duì)乳糖的利用能力在逐漸下降。

2.3釀酒酵母老化過程中蛋白酶活力的變化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)酶液進(jìn)行3次平行測(cè)定，所得結(jié)果見表2。根據(jù)酶活力定義及酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，酵母蛋白酶活力在酵母老化過程中逐漸增加，從第1代的50.25升高到15代的82.16，大約升高65%。蛋白酶活力的明顯增加，加速催化水解酵母細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞失去穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和活性，這與細(xì)胞衰老的理論相吻合。

2.4釀酒酵母老化過程中α-淀粉酶活力的變化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)酶液進(jìn)行3次平行測(cè)定，取平均值所得結(jié)果見表3。根據(jù)α-淀粉酶活力定義及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果見圖7所示。由圖7可知，在釀酒酵母老化過程中，α-淀粉酶的活力在逐漸下降，從第1代的3.362下降到第15代的1.100，α-淀粉酶活力的降低，說明酵母細(xì)胞老化過程中，對(duì)于淀粉的分解和利用率在逐漸下降。

2.5釀酒酵母老化過程中核酸酶活力的變化

通過3min內(nèi)A260值的變化來鑒定核酸酶的作用，所得結(jié)果如表4。根據(jù)核酸酶活力定義及酶活力計(jì)算公式得：酶活力=△OD260(3min)/(3×0.001)由圖8可知：在酵母老化過程中，酵母核酸酶的活力在逐漸下降，從第1代的31.4降低到第15代的7.8，大約降低75%。

3結(jié)論

經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)證明：在酵母老化過程中，蛋白酶的活力逐漸升高，乳糖酶、α-淀粉酶、核酸酶的活力逐漸降低。目前國內(nèi)尚未見有報(bào)道關(guān)于酵母老化與酶活力變化關(guān)系的研究，本實(shí)驗(yàn)通過酵母代數(shù)為載體針對(duì)酵母老化過程中酶活力的變化做了細(xì)致的研究，為酵母老化程度的鑒定提供有力依據(jù)。