磷蝦水解工藝探究

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本文作者：戴程程汪秋寬任丹丹何云海作者單位：大連海洋大學(xué)遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

南極磷蝦是一種生活在南極洲水域的磷蝦。它作為當(dāng)今世界資源量最大的單物種生物之一，為南極多數(shù)生物提供食物，是南極食物鏈體系中最重要的生產(chǎn)者[1]。南極磷蝦營(yíng)養(yǎng)極其豐富，被譽(yù)為地球上最大的“海洋蛋白庫(kù)”，具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[2]。研究發(fā)現(xiàn)南極磷蝦蛋白質(zhì)含量適中，脂肪含量豐富，氨基酸種類齊全，必需氨基酸比例適宜，微量元素含量極高，并且綠色、安全，是人類理想的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)食物[3-5]。因磷蝦體內(nèi)富含可迅速自溶的蛋白酶，故本研究利用快速自溶技術(shù)，探索影響磷蝦快速自溶因素，為研制富含游離氨基酸、蛋白肽的獨(dú)特風(fēng)味磷蝦調(diào)味料奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1原料

南極磷蝦由大連遼漁集團(tuán)提供，采自南極海域。

1.2主要儀器與設(shè)備

組織搗碎機(jī)，磁力攪拌器，水浴鍋，高速離心分離機(jī)，pH計(jì)，微量凱氏定氮裝置。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1基本成分測(cè)定

水分：常壓干燥法[6]；灰分：550℃干法灰化法[6]；粗蛋白：微量凱氏定氮法[6]；粗脂肪：索氏提取法[6]。

1.3.2水解液氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度及水解度測(cè)定

氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度：甲醛滴定法；水解液水解度：非蛋白氮，20%三氯乙酸處理自溶液，取上清液，用微量凱氏定氮法測(cè)定其含氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算自溶液水解度，如下公式：（略）。以氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度及自溶液的水解度為水解程度大小的指標(biāo)。

2結(jié)果與討論

2.1磷蝦的基本營(yíng)養(yǎng)成分

由表1可見(jiàn)，其粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)比新對(duì)蝦(13.2%)高[7]；其非蛋白氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為579mg/100g，而非蛋白氮成分中，一般多含有游離氨基酸、低肽、核苷酸關(guān)聯(lián)化合物質(zhì)[8]，這對(duì)制作高級(jí)磷蝦營(yíng)養(yǎng)海鮮調(diào)味料提供了優(yōu)越的條件。

2.2磷蝦自溶水解的單因素確定

2.2.1自溶時(shí)間對(duì)磷蝦自溶酶解的影響

在50℃恒溫條件下將磷蝦肉自溶酶解一定時(shí)間后，加熱至沸滅活，測(cè)其氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度，自溶時(shí)間分別為20、40、60、80、100、150、200、250、300min，自溶時(shí)間對(duì)磷蝦自溶酶解的影響見(jiàn)圖1。由圖1所示，氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度在150min以內(nèi)一直為上升趨勢(shì)，當(dāng)自溶時(shí)間超過(guò)165min時(shí)，自溶酶解液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度出現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。因此，165min確定為自溶酶解的最佳時(shí)間，其自溶酶解液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度為4.74g/L。165min以后，氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度又緩慢降低，幾乎接近穩(wěn)定。以上結(jié)論如圖1所示。自溶時(shí)間對(duì)自溶酶解水解度的影響見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)自溶時(shí)間對(duì)自溶酶解液水解度的影響很小，水解度一直在20%~30%之間浮動(dòng)，在自溶時(shí)間為165min時(shí)自溶液水解程度達(dá)到最高，為29.6%。在165min后，水解液水解度出現(xiàn)下降，然后隨時(shí)間變化很小。因此，確定165min為最佳溶酶解時(shí)間。由圖1和圖2可見(jiàn)，自溶酶解時(shí)間為165min時(shí)，自溶酶解液中的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度最高，并且溶液的水解程度也最大，由此可見(jiàn)，165min為自溶酶解的最佳時(shí)間?？酌捞m等[9]曾對(duì)羅非魚(yú)下腳料自溶酶解條件進(jìn)行研究，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)自溶酶解時(shí)間對(duì)自溶酶解液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度影響較大。研究結(jié)果表明自溶酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響較小，比較楊錫洪等[10]等對(duì)蝦頭自溶脫蛋白質(zhì)法制備殼聚糖的研究結(jié)果，后者發(fā)現(xiàn)蝦頭中含有大量的蛋白水解酶，其中包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶A、羧肽酶B[11]等，種類豐富且比蝦肉中的酶含量要高。

2.2.2自溶酶解溫度對(duì)磷蝦自溶的影響

將自溶酶解時(shí)間確定為165min，研究了溫度對(duì)磷蝦自溶酶解效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。由圖3可見(jiàn)，不同自溶溫度的自溶酶解液中游離氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度不同，在55℃時(shí)，自溶酶解液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度達(dá)到最大，約為4.26g/L。溫度大于55℃后，氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度隨溫度增加而降低，可見(jiàn)55℃為磷蝦自溶酶的最適溫度。由圖4可見(jiàn)，在溫度為55℃時(shí)，自溶酶解液水解度最大，達(dá)到32.91%。由此可以確定最適自溶酶解溫度為55℃。不同自溶酶解溫度對(duì)自溶酶解液游離氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度影響明顯，在低溫階段，隨著溫度的增加，氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度逐漸增加，在溫度為55℃時(shí)上升為4.26g/L，隨后就呈下降趨勢(shì)，可見(jiàn)55℃為磷蝦自溶酶的最適溫度。說(shuō)明在低溫階段，隨著溫度的升高自溶酶的反應(yīng)速度加快，因加熱能使蛋白質(zhì)變性，原本卷曲的蛋白質(zhì)肽鏈因變性而伸展，其結(jié)構(gòu)內(nèi)部的肽鍵充分暴露，從而活性位點(diǎn)增多，這就更易于蛋白酶的作用。但溫度過(guò)高時(shí)，部分自溶酶的結(jié)構(gòu)開(kāi)始松散無(wú)序，活性中心也隨之逐漸喪失，酶活性降低，導(dǎo)致自溶水解效果減弱。這與司偉蘭[12]等對(duì)魷魚(yú)內(nèi)臟的自溶分析結(jié)果和王靜[13]等人對(duì)海參多肽自溶工藝的研究趨勢(shì)一致，在低溫階段，隨著溫度的增加，游離氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度逐漸增加，并在55℃附近含量最高，之后隨著溫度的增加，氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度下降。

2.2.3pH對(duì)磷蝦自溶酶解的影響

將自溶溫度定為55℃、自溶時(shí)間定為165min，設(shè)定自溶酶解液的pH值，研究pH值對(duì)磷蝦自溶酶解的影響。其影響結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。由圖5中可知，pH對(duì)磷蝦自溶酶解的影響較大。當(dāng)pH為7.0時(shí)，自溶液中的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度最高。說(shuō)明中性條件利于磷蝦自溶酶解，其氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度為4.55g/L。由圖6可見(jiàn)，pH對(duì)自溶液水解度的影響較大，當(dāng)pH=7.0時(shí)，自溶酶解液水解度高達(dá)23.84%，說(shuō)明pH為7.0時(shí)自溶酶解效果最佳。pH對(duì)磷蝦自溶酶解的影響關(guān)系密切。說(shuō)明在特定pH條件下磷蝦肌肉中自溶酶被激活并與相應(yīng)的機(jī)體組織生物大分子底物作用，使機(jī)體組織被溶解，生成各種較低分子質(zhì)量的產(chǎn)物——肽和氨基酸[9]。而水解體系中pH值對(duì)自溶酶和底物的結(jié)構(gòu)、解離狀態(tài)及結(jié)合狀態(tài)都會(huì)產(chǎn)生影響。這種結(jié)果與鄭麗等[14]研究的pH值對(duì)扇貝加工廢棄物自溶影響的結(jié)果類似。

2.2.4紫外線照射時(shí)間對(duì)磷蝦自溶酶解的影響

用紫外線(光源功率30W，距樣液高度設(shè)計(jì)為0.40m)分別照射磷蝦自溶酶解液10、20、30、40、50min后，分別測(cè)定自溶酶解液中的游離氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。圖7表明，紫外線的照射時(shí)間對(duì)磷蝦自溶酶解液中的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度的影響較小，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，自溶液中的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度逐漸增大。由圖8可見(jiàn)，紫外線的照射時(shí)間對(duì)自溶酶解液的水解程度影響較大，它使整體自溶水解速度成大幅上升趨勢(shì)，在照射50min內(nèi)，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，自溶酶解液的水解度逐漸增加。本實(shí)驗(yàn)選擇紫外線的照射時(shí)間為50min以內(nèi)。紫外線的照射時(shí)間對(duì)磷蝦自溶水解液中的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度的影響不大，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，自溶酶解水解中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度緩慢上升?？紤]到紫外線照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能超過(guò)激活酶所需的計(jì)量，會(huì)導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)的改變，使磷蝦的蛋白質(zhì)變性，并產(chǎn)生一些不良?xì)馕丁Ｒ虼?，紫外線照射時(shí)間確定為50min。這一結(jié)果與亨氏仿對(duì)蝦的情況類似[15]，紫外線照射時(shí)間限制為50min為最佳紫外線照射時(shí)間。但章超華等對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦快速自溶的影響結(jié)果卻不同[15]，后者發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對(duì)蝦在紫外線照射超過(guò)30min時(shí)，自溶受到了抑制。這表明，紫外線對(duì)不同海洋生物的自溶效果影響是不同的。

2.2.5無(wú)機(jī)離子濃度對(duì)磷蝦自溶效果的影響

Na+和Ca2+對(duì)自溶酶解效果的影響由圖9和圖10所示。由圖9和圖10可見(jiàn)，Na+和Ca2+對(duì)快速自溶水解的影響相類似，Ca2+作用后的自溶酶解液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度高于Na+作用后自溶酶解中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度，并在Ca2+達(dá)到0.28mol/L時(shí)，水解液中的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度最大，為3.38g/L。圖10是Na+和Ca2+對(duì)溶液水解度的影響，2種離子對(duì)自溶酶解液影響趨勢(shì)類似，表明了Ca2+對(duì)自溶液水解度的影響較Na+的影響顯著。在Ca2+為0.28mol/L時(shí)，水解液的水解度最大，為13.87%。綜上所述結(jié)果表明，自溶時(shí)間與磷蝦自溶水解反應(yīng)密切相關(guān)，在自溶165min時(shí)，自溶酶解液達(dá)到最佳；磷蝦的自溶酶解受溫度影響較小，55℃為南極磷蝦快速自溶酶最佳作用溫度；pH對(duì)磷蝦自溶酶解影響顯著，pH為7.0時(shí)，可顯著加速磷蝦的自溶水解；在紫外線照射時(shí)間為50min時(shí)，對(duì)自溶反應(yīng)起到促進(jìn)作用；Ca2+對(duì)南極磷蝦自溶酶具有激活作用，加速自溶酶解，當(dāng)其濃度為0.28mol/L時(shí)達(dá)到較佳的自溶酶解效果。Ca2+對(duì)自溶酶的激活促進(jìn)作用較Na+強(qiáng)，可能是因?yàn)镃a2+可以控制細(xì)胞的滲透性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的酸堿平衡，同時(shí)對(duì)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種水解酶的活性起著十分重要的穩(wěn)定、活化作用。當(dāng)Ca2+達(dá)到0.28mol/L時(shí)，水解液中的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度可達(dá)到最大值3.38g/L。這些鈣會(huì)以溶解態(tài)的形式存于液體中，對(duì)人體吸收有利。因此，磷蝦自溶液中的鈣可以被人體吸收。

2.3磷蝦自溶條件的正交優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以時(shí)間、溫度、pH、紫外線照射時(shí)間、無(wú)機(jī)離子濃度5因素為影響因子設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)L16(54)，綜合優(yōu)化磷蝦的自溶酶解工藝，自溶優(yōu)化條件。其結(jié)果如表2、表3與表4所示。由表2可見(jiàn)，正交實(shí)驗(yàn)的最佳自溶酶解工藝A4B2C3D1E4，即反應(yīng)時(shí)間180min，溫度50℃，pH為7.0，紫外線照射時(shí)間20min，Ca2+濃度為0.28mol/L，此時(shí)自溶酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量為0.788g/L，水解度為35.07%。由表3可見(jiàn)，以水解度為指標(biāo)的極差分析結(jié)果表明，自溶酶解時(shí)間是影響水解度得率第一影響因素，pH值是次要因素，反應(yīng)溫度和無(wú)機(jī)離子濃度對(duì)水解影響較小，紫外線的照射時(shí)間對(duì)自溶酶解液的影響最小。以水解度為指標(biāo)的極差分析結(jié)果的最佳正交組合為A4B2C3D1E4。即最佳工藝條件為反應(yīng)時(shí)間180min，溫度50℃，pH為7.0，紫外線照射時(shí)間20min，Ca2+濃度為0.28mol/L。由表4可見(jiàn)，以氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度為指標(biāo)的極差分析結(jié)果表明，自溶酶解時(shí)間也是影響氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度的第一影響因素，pH值同樣為次要因素，Ca2+濃度為第三影響因素，反應(yīng)溫度與紫外線的照射時(shí)間對(duì)自溶酶解液的影響最小。最佳正交組合同樣為A4B2C3D1E4，與以水解度為指標(biāo)的極差分析結(jié)果一致。為此研究對(duì)最佳組合進(jìn)行了自溶酶解實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明在該最佳實(shí)驗(yàn)組合條件下自溶酶解液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度為0.875g/L，水解度為36.18%。

本文對(duì)南極磷蝦自溶酶解工藝研究結(jié)果表明，在單因素試驗(yàn)中，自溶酶解時(shí)間為165min時(shí)，溶液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度達(dá)到最高，即4.74g/L，此時(shí)自溶酶解液中的水解度為29.60%；當(dāng)最適溫度為55℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度最高，為4.26g/L，水解度為32.91%；當(dāng)pH為7.0時(shí)，自溶酶解液中的氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度達(dá)到最高值4.55g/L，水解度為23.83%；Na+和Ca2+對(duì)快速自溶水解的影響相類似，但Ca2+對(duì)自溶酶解液的激活促進(jìn)作用較Na+作用大。單因素試驗(yàn)后，正交實(shí)驗(yàn)L16(54)確定了南極磷蝦的最佳自溶酶解條件。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)自溶時(shí)間為180min，溫度為50℃，pH為7.0，紫外線照射時(shí)間為20min，Ca2+離子濃度為0.28mol/L時(shí)，水解液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度最大，為0.875g/L，其自溶酶解液的水解度為36.18%。