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本文作者：張澤高淑悅程繼龍顏士慧李翀李玉婷張莉作者單位：山東大學海洋學院

近年來，隨著海洋生物工程技術(shù)的運用，從海洋生物中獲得活性成分成為開發(fā)高效、安全藥物的重要資源，也是現(xiàn)代海洋科學研究的新熱點[1]。海洋生物的種類繁多，例如貝類、腔腸動物、被囊動物、棘皮動物和微生物等。其中雙殼貝類是其中很重要的一部分，它們在抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗疲勞和增強機體免疫力等方面均有良好的生物活性，是新型的創(chuàng)新藥物、功能性和保健食品資源，是一類有巨大開發(fā)潛力的海洋生物。牡蠣俗稱海蠣子，又稱蠔，是世界上第一養(yǎng)殖貝類，也是我國四大養(yǎng)殖貝類之一。它營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)、多糖、?；撬帷\等營養(yǎng)素含量較高，具有很好的抗氧化抗衰老功效[2]。此外，XueQG[3]等在牡蠣的血漿中分離出一種溶菌酶，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的生長均有抑制作用。又經(jīng)RobertS.Anderson[4]等研究的結(jié)果表明，牡蠣的血漿有抗巨大芽孢桿菌的作用。至今，牡蠣活性成分的提取和開發(fā)已經(jīng)是開發(fā)海洋資源的一個重要途徑，雖然國內(nèi)外對牡蠣的成分都進行了一些研究，但是尚有不足，對于牡蠣血漿及其純化蛋白的抗氧化活性研究更是少見。本文中作者報告牡蠣血漿中一種活性蛋白的分離純化及其抗氧化作用的研究，希望能為其開發(fā)成新型的海洋抗氧化藥物提供一定的理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1太平洋牡蠣市售。

1.1.2主要試劑

硫酸銨(分析純)、丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、二苯代苦味酰自由基(DPPH)：Sigma公司；標準相對分子質(zhì)量蛋白：上海博亞生物有限公司；考馬斯亮藍R250：上海生工生物工程有限公司；Tris：分析純；SDS：BiomoI；檸檬酸三鈉：分析純；SephadexG-100：A.P.。

1.1.3主要儀器

TGLL218型冷凍離心機：太倉市醫(yī)療器材廠；層析柱：北京江晨宏偉生物科技有限責任公司，16mm×50cm；DYY2Ⅲ型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及電泳槽：北京市六一儀器廠；真空冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司。

1.2方法

1.2.1血漿的提取

本研究以血漿及其沉淀蛋白檢測其基本抗氧化活性。用裝配有1.5英寸22號針頭的注射器插入牡蠣的閉殼肌靜脈竇，抽取血液，然后迅速把抽取的血液推入到浸入冰水浴的潔凈器皿中，之后將抽取的牡蠣血液在300g、10℃條件下離心10min以除去血細胞，取出上清液即為牡蠣血漿。

1.2.2原血漿的蛋白含量的測定

以考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為對照制作標準曲線。

1.2.3抗氧化活性測定

抗氧化活性測定采用鄰苯三酚自氧化法[5]。在比色管中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL原血漿，加蒸餾水至1mL。加入Tris-HCl溶液(pH8.2)5.0mL和50mmol/L鄰苯三酚溶液1mL，迅速搖勻，以蒸餾水為空白對照。每30s在325nm處測定吸光值。按下式計算清除率。清除率(%)=(F0-Fs)/F0×100(1)式中：F0為鄰苯三酚的自氧化速率；Fs為加樣品的反應(yīng)溶液吸光值變化率。

1.2.4血漿粗蛋白的制備及其抗氧化活性測定

取血漿50mL移入放置于冰水浴中的小燒杯中，然后在攪拌下緩慢加入32.500g硫酸銨使溶液中硫酸銨的終濃度達到95%，靜置30min后3000r/min離心20min，收集沉淀蛋白后脫鹽處理，最后制備成凍干粉即為牡蠣血漿粗蛋白。稱取牡蠣血漿粗蛋白100mg溶于10mL雙蒸水中，配制成濃度為10mg/mL的蛋白液，測定抗氧化活性的方法仍采用1.2.3中的方法。

1.2.5血漿蛋白的分離純化及抗氧化活性測定

將配置好的蛋白液上樣到以pH6.5NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液充分平衡的SephadexG-100層析柱(1.6cm×50cm)進行層析，用平衡液進行洗脫，收集各個峰，脫鹽，冷凍干燥備用。用雙蒸水配制成1mg/mL的蛋白液，用1.2.3中方法測定各個峰的抗氧化活性從而確定活性峰。

1.2.6抗氧化蛋白的相對分子質(zhì)量檢測

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定，蛋白濃縮液(10、15μL)直接上樣進行SDS-PAGE分析，分離膠濃度為15％，電泳條件：電壓200V，90min，用0.5%考馬斯亮藍R250染色，使用不同相對分子質(zhì)量的標準蛋白(10~260ku)對抗氧化蛋白進行相對分子質(zhì)量及其分布測試及分析。

1.2.7純化血漿蛋白抗氧化活性和熱穩(wěn)定性測定

1.2.7.1還原能力的測定[6]

在比色管中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的樣品，配制的樣品濃度為1mg/mL，加蒸餾水至1mL。加入2.5mL的磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH6.6)，再加入1%鐵氰化鉀2.5mL。混合物50℃水浴20min后加入1mL10%的三氯乙酸。取2.5mL反應(yīng)液，加入蒸餾水2.5mL和0.1%氯化鐵0.5mL。在700nm處測吸光值，吸光值越高說明樣品的還原性越強。以0.5mg/mL的抗壞血酸為參照。

1.2.7.2清除超氧陰離子自由基能力的測定

配制的樣品濃度為1mg/mL，試驗方法同1.2.3所述。

1.2.7.3熱穩(wěn)定性試驗

配制的樣品濃度為1mg/mL，將樣品溶液分別經(jīng)過30、50、70、90℃水浴處理30min后，以鄰苯三酚自氧化法測抗氧化活性，加入樣品1.0mL。

2結(jié)果與分析

牡蠣的原血漿、粗蛋白、血漿純化蛋白均具有不同程度的抗氧化效果，以血漿純化蛋白的效果最優(yōu)，而原血漿和粗蛋白次之，純化血漿蛋白在與原血漿和粗蛋白的蛋白含量之比為1:10時即可表現(xiàn)出與原血漿和粗蛋白相似的抗氧化活性。

2.1原血漿的蛋白含量測定結(jié)果

經(jīng)考馬斯亮藍法測定原血漿后，確定牡蠣原血漿的蛋白含量是11.25mg/mL。

2.2原血漿的蛋白抗氧化結(jié)果

按照1.2.3的方法進行清除超氧陰離子自由基能力的測定，以清除率和加入原血漿的量作圖。由圖1可知，牡蠣原血漿具有清除超氧陰離子自由基的能力，清除率隨加入量的增大而增加?？傮w來說，在低濃度情況下清除能力不是很高，而在比較高的濃度下，清除率非常顯著。加入樣品體積達到1.0mL時，清除率達到了89.89%。

2.3血漿粗蛋白抗氧化結(jié)果

按照1.2.3的方法進行清除超氧陰離子自由基能力的測定，以清除率和加入粗蛋白的量作圖。由圖2可知，牡蠣血漿粗蛋白同樣具有清除超氧陰離子自由基的能力，清除率在開始時隨加入量的增大而增加，但當加入量達到0.6mL以后清除率則趨于平緩，達到最大值61.54%。

2.4蛋白質(zhì)純度鑒定以及相對分子質(zhì)量的測定

血漿蛋白的層析圖譜如圖3，在層析中有2個峰，其中Ⅱ峰的蛋白含量很低且無抗氧化活性，Ⅰ峰蛋白含量高且具有抗氧化活性。純化后獲得的抗氧化蛋白質(zhì)為單一條帶，由標準蛋白可知其相對分子質(zhì)量約為15ku，結(jié)果見圖4。

2.5抗氧化活性蛋白的部分性質(zhì)

2.5.1抗氧化活性的測定

2.5.1.1還原能力的測定

加入不同量的純化血漿蛋白，按照1.2.7.1的方法進行還原能力的測定，以反應(yīng)體系的吸光值和加入樣品的量作圖，同時以抗壞血酸為對照，結(jié)果見圖5。由圖5可知，樣品的還原能力較強，還原能力隨加入量的增大而增加，但明顯低于抗壞血酸。

2.5.1.2清除超氧陰離子自由基的測定

按照1.2.7.2的方法進行清除超氧陰離子自由基能力的測定，以清除率和加入樣品的量作圖。由圖6可知，牡蠣血漿純化蛋白也具有清除超氧陰離子自由基的能力，清除率隨加入量的增大而增加。從總體上看，在低濃度情況下清除能力比較差，而在比較高的濃度下，清除率顯著，加入樣品體積達到1.0mL時，清除率達到56.18%。

2.5.1.3熱穩(wěn)定性試驗

樣品溶液分別經(jīng)過30、50、70、90℃水浴處理30min后，利用鄰苯三酚自氧化法測定其抗氧化活性，結(jié)果見圖7。由圖7可知，純化牡蠣血漿蛋白在30~50℃的溫度范圍內(nèi)清除率變化較小，當處理溫度升高到50℃以上時，清除率的下降開始加快，有可能是因為較高的溫度會使蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，而使其抗氧化活性下降。由圖7可知，純化牡蠣血漿蛋白在30~50℃的溫度范圍內(nèi)清除率變化較小，當處理溫度升高到50℃以上時，清除率的下降開始加快，有可能是因為較高的溫度會使蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，而使其抗氧化活性下降。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，自由基具有很高的化學活性，它一方面是機體有效防御系統(tǒng)的一部分，另一方面也是許多疾病的誘因[7-8]。自然界中的很多動物和植物體內(nèi)都含有具有良好抗氧化活性的物質(zhì)，不但有抗氧化、防衰老的作用，還能防病、治病且無毒副作用。因此，目前在全球范圍內(nèi)掀起了一股發(fā)掘天然具備抗氧化活性的物質(zhì)并將其應(yīng)用于藥物和食品工業(yè)的潮流[9]。無疑，對天然產(chǎn)物中的抗氧化活性物質(zhì)的研究，已成為當今最活躍也是最有潛力研究方向之一[10-11]。通過國際上各大科研院所做的大量研究表明，牡蠣提取物具有降血糖、增強免疫力、降血壓和抗腫瘤等諸多功效。除了研究較為廣泛的多糖、氨基酸等物質(zhì)外，牡蠣還中含有大量的蛋白質(zhì)，其在血漿中的含量豐富，濃度達11.25mg/mL。本試驗對其血漿成分進行了較為深入的研究，旨在使人們對牡蠣血漿及其所含蛋白的抗氧化作用有更加全面徹底的了解。本文報道了牡蠣血漿及從血漿中分離出的一種蛋白質(zhì)，結(jié)果表明二者均具有良好的抗氧化活性。牡蠣血漿純化蛋白具備還原能力以及較好的清除羥基自由基的能力，對超氧陰離子也有顯著的清除能力，在30~50℃的水浴處理后仍保持穩(wěn)定。對于該蛋白的抗氧化作用機制、構(gòu)效關(guān)系及牡蠣中其他活性成分的分離純化與活性測定還有待進一步研究和探討。