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本文作者：孫占斌1袁行方1王音嫻1張輝2張文會(huì)2馮永君1

作者單位：1.北京理工大學(xué)生命學(xué)院2.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

植物內(nèi)生菌能定殖在健康植物組織內(nèi)并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系,它們能通過(guò)產(chǎn)生IAA、細(xì)胞激動(dòng)素等物質(zhì),促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育;還可通過(guò)產(chǎn)生抗生素、生物堿類(lèi)物質(zhì)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位等起到對(duì)植物的保護(hù)作用[1],甚至能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性來(lái)增強(qiáng)宿主的生存適應(yīng)性[2]。植物-內(nèi)生菌這種和諧共生、互利共棲的生命形式,是“資源節(jié)約型,環(huán)境友好型”生態(tài)型農(nóng)業(yè)發(fā)展的一條重要思路。

黃瓜是世界上分布最廣泛、最重要的蔬菜栽培作物之一,在我國(guó)蔬菜周年供應(yīng)中同樣占有極其重要的地位。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì),2004年我國(guó)黃瓜栽培面積已達(dá)1502900hm2,產(chǎn)量達(dá)到25558000Mt[3]。黃瓜生長(zhǎng)周期主要包括營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)兩個(gè)階段。前者包括發(fā)芽和幼苗期;后者包括初花和結(jié)瓜期,該階段占據(jù)了大部分生育期且與產(chǎn)量形成密切相關(guān)。影響初花和結(jié)瓜期的因素除了環(huán)境因素(如溫度、光照、水分),還有生物因素如植物自身分泌的激素及內(nèi)生菌的影響等[4]。由于植物與內(nèi)生菌的作用是相互的,因此由于植物生長(zhǎng)發(fā)育階段更替帶來(lái)的生理生化變化,必然會(huì)影響到定殖微生物的種群與數(shù)量等[5],相關(guān)研究對(duì)從微生態(tài)角度研究作物生長(zhǎng)、產(chǎn)量形成具有重要意義,備受關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃瓜內(nèi)生菌的研究相對(duì)較少,且主要集中在內(nèi)生真菌和放線(xiàn)菌方面,其研究目的也主要是在抗病與促生方面[6],關(guān)于黃瓜內(nèi)生細(xì)菌的多樣性研究尚未見(jiàn)報(bào)到。本文則主要探索黃瓜初花和結(jié)瓜期內(nèi)葉片可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的種類(lèi)、數(shù)量及優(yōu)勢(shì)菌的種類(lèi)變化,為黃瓜促生內(nèi)生細(xì)菌的理論探索和生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1黃瓜品種與植株

黃瓜為“中農(nóng)16”品種,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所研制,抗多種病害,為目前華北地區(qū)瓜農(nóng)種植主栽品種。黃瓜植株,于2010年4月中旬至5月中旬分3次采自北京市平谷區(qū)農(nóng)業(yè)推廣學(xué)校蔬菜大棚。取樣階段為初花期和結(jié)瓜期,試驗(yàn)對(duì)象為植株葉片。

1.2內(nèi)生菌的分離與培養(yǎng)

分別取初花和結(jié)瓜期的黃瓜植株葉片各1g,用無(wú)菌水沖洗干凈,無(wú)菌濾紙吸干后,分別用75%酒精浸泡2min,2.6%NaClO浸泡5min,75%酒精浸泡1min進(jìn)行表面消毒,再用無(wú)菌水沖6次,將最后一次沖洗液涂營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3,蛋白胨10,氯化鈉5,瓊脂1820,pH6.87.0,1105Pa高壓蒸汽滅菌20min。平板檢查表面消毒效果,要求對(duì)照平板無(wú)菌落生長(zhǎng),確保表面消毒徹底。將消毒后的樣品放在加有9mL無(wú)菌水的無(wú)菌研缽充分研磨,靜置20min,再稀釋3個(gè)濃度梯度,各取0.1mL涂布到NA培養(yǎng)基中,每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù),置于恒溫培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)13d。每個(gè)葉片樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.3內(nèi)生菌的純化與保存

細(xì)菌培養(yǎng)13d后分別記錄各平板的菌落數(shù)量,根據(jù)菌落形態(tài)(大小、形狀、顏色、表面光澤度、邊緣整齊度、透明度和質(zhì)地等),鏡檢菌體形態(tài)(形狀、革蘭氏染色反應(yīng)、排列方式和有無(wú)芽孢等);分別挑取有差異的菌落,在NA平板上劃線(xiàn)純化3次,將純化后的內(nèi)生細(xì)菌編號(hào)后接種到相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上4°C冰箱保存,同時(shí)采用80°C甘油管凍存。

1.4內(nèi)生細(xì)菌DNA模板的提取與16SrDN段擴(kuò)增

將內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)至指數(shù)期,取1.5mL菌液用基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA,進(jìn)行16SrDNA序列擴(kuò)增。擴(kuò)增選用通用引物[7],由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成：P1:27f(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3),P2:1492r(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)。PCR擴(kuò)增時(shí),94°C4min;94°C1min,55°C1min,72°C2min,共30個(gè)循環(huán);72°C10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5細(xì)菌16SrDNA序列測(cè)定與同源性比對(duì)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序后,用CHECK-CHIMERA進(jìn)行嵌合體序列的鑒定,除去嵌合體及怪異序列,再與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行NCBIBLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對(duì)分析,尋找具有較高同源性的16SrDNA序列。確定各菌株有效序列后用ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)[8],再用Megaversion4.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,其中系統(tǒng)進(jìn)化矩陣按Kimura2-Parameter模型計(jì)估算[9],采用鄰接法(Neighbor-Joining)聚類(lèi)分析[10],構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。重復(fù)取樣1000次進(jìn)行自展值(Bootstrapvalue)分析評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

根據(jù)文獻(xiàn),定義16SrDNA序列相似性大于98%歸于同一個(gè)物種[11]。

2結(jié)果與分析

2.1初花期和結(jié)瓜期黃瓜葉片內(nèi)生菌的分離

將初花和結(jié)瓜期兩時(shí)期的黃瓜葉片表面消毒后,進(jìn)行組織內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng),結(jié)果表明,在NA平板上長(zhǎng)出大量菌落,菌落形態(tài)存在明顯差異,說(shuō)明黃瓜葉片中不僅存在大量?jī)?nèi)生細(xì)菌,且種類(lèi)豐富。菌落計(jì)數(shù)得到兩時(shí)期內(nèi)生菌數(shù)量分別為:初花期為(2.6±0.18)106CFU/g鮮重,結(jié)瓜期為(5.2±0.42)105CFU/g鮮重(顯著性水平P＜0.05),前者是后者的5倍。選擇差異明顯的菌落進(jìn)行平板劃線(xiàn)純化,共得到81株內(nèi)生菌;其中,初花期38株,結(jié)瓜期43株。

2.216SrDNA序列擴(kuò)增及菌種鑒定

將兩個(gè)時(shí)期分離的81株內(nèi)生細(xì)菌成功提取基因組DNA,對(duì)其16SrDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增均得到片段約1.5kb的單一條帶(圖1,圖中僅列出兩個(gè)時(shí)期部分內(nèi)生菌的電泳條帶,其它菌的條帶位置與圖中一致)。將PCR產(chǎn)物測(cè)序并將測(cè)得的序列提交登陸GenBank并獲得登錄號(hào)(JN084129-JN084164,HQ874629)。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)上述初花期的38株和結(jié)瓜期的43株內(nèi)生細(xì)菌的16SrDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果見(jiàn)表1和2以及圖2和4。從分析結(jié)果(表1和圖2)看,初花期的38株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于4個(gè)細(xì)菌類(lèi)群中的14個(gè)已知屬。其中放線(xiàn)菌類(lèi)(Actinobacteria)最多,占60.5%,為優(yōu)勢(shì)菌群,包含7屬。其次是厚壁菌類(lèi)(Firmicutes),占28.9%,包含2屬。剩余的兩類(lèi)：伽馬變形桿菌類(lèi)(Gammaproteobacteria)和阿爾法變形桿菌類(lèi)(Alphaproteobacteria)各占7.9%和2.7%,分別包含2屬和1屬(圖3A)。其中,短小桿菌屬(Curtobacterium)含有7株細(xì)菌,在初花期為優(yōu)勢(shì)屬,其次是芽孢桿菌屬(Bacillus),含有6株細(xì)菌。其中,隸屬于短小桿菌屬的菌株Y1為最優(yōu)勢(shì)種,占初花期分離內(nèi)生菌總量(以CFU計(jì))的57.6%。此外,隸屬于藤黃單胞菌屬(Luteimonas)的一株編號(hào)Y4的內(nèi)生菌與已知序列同源性為96.8%,通過(guò)分子生物學(xué)及生理生化指標(biāo)測(cè)定確定其為一新種,將在近期另文發(fā)表。需要指出的是,鑒于優(yōu)勢(shì)種在所有分離菌的比例僅是依據(jù)形態(tài)學(xué)特征來(lái)區(qū)分和計(jì)算的,其統(tǒng)計(jì)數(shù)量和比例僅供參考之用。

從表2和圖4可以看出,結(jié)瓜期的43株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于5個(gè)細(xì)菌類(lèi)群中的11個(gè)已知屬。其中伽馬變形桿菌類(lèi)細(xì)菌最多,占46.5%,為優(yōu)勢(shì)菌群,包含3屬。其次是阿爾法變形桿菌類(lèi),占23.3%,包含2屬,放線(xiàn)菌類(lèi)和厚壁菌類(lèi)占有相同的比例13.9%,分別包含3屬和2屬。異常球菌類(lèi)(Deinococci)含量最少,為2.4%,僅含有1屬(圖3B)。其中,泛菌屬(Pantoea)含有15株細(xì)菌,是結(jié)瓜期的優(yōu)勢(shì)菌屬,其次是農(nóng)桿菌屬(Aqrobacterium),含有9株細(xì)菌。其中,隸屬于泛菌屬的菌株CE1為最優(yōu)勢(shì)種,占結(jié)瓜期分離內(nèi)生菌總量(以CFU計(jì))的65.0%。

3討論

植物內(nèi)生菌的分離鑒定是內(nèi)生菌研究的首要問(wèn)題,是內(nèi)生菌與植物的互作研究、發(fā)現(xiàn)重要功效內(nèi)生菌的前提,一直受到高度重視。本文選用在我國(guó)蔬菜種植中占有重要地位的黃瓜“

中農(nóng)16”品種為研究對(duì)象,探究初花期和結(jié)瓜期葉片內(nèi)生菌的多樣性,并對(duì)這些內(nèi)生菌進(jìn)行了16SrDNA鑒定。兩時(shí)期共分離到內(nèi)生菌81株,初花期38株,分屬于14個(gè)已知屬,其中隸屬于短小桿菌屬的菌株Y1為最優(yōu)勢(shì)種,占57.6%,發(fā)現(xiàn)Y4菌株屬于新種Luteimonassp.。結(jié)瓜期43株分屬于11個(gè)已知屬,其中隸屬于泛菌屬的菌株CE1為最優(yōu)勢(shì)種,占65.0%。顯示出兩個(gè)時(shí)期黃瓜葉片組織內(nèi)生菌的多樣性。

內(nèi)生菌數(shù)量方面,初花期內(nèi)生菌含量是結(jié)瓜期的近5倍,體現(xiàn)出不同生育期內(nèi)生菌數(shù)量的顯著差異。這種變化可能與植物不同生長(zhǎng)期的生理生化變化有關(guān),或由于內(nèi)生菌群之間出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致種類(lèi)和數(shù)量發(fā)生變化。初花期的某些內(nèi)生菌群可能與莖葉的形成、根系的發(fā)展和花的開(kāi)放相關(guān);結(jié)瓜期的某些內(nèi)生菌群可能與結(jié)瓜期果實(shí)的發(fā)育成熟有關(guān)。因此,了解生殖生長(zhǎng)期內(nèi)生菌多樣性及動(dòng)態(tài)變化,對(duì)于研究?jī)?nèi)生菌群和產(chǎn)量的關(guān)系十分重要。這種在不同生長(zhǎng)時(shí)期,植物內(nèi)生菌的種類(lèi)和數(shù)量會(huì)發(fā)生變化的現(xiàn)象也在其它一些植物中發(fā)現(xiàn)。McInroy報(bào)道,棉花內(nèi)生菌數(shù)量在不同生育期存在明顯差異：從苗期開(kāi)始增加,到成株期達(dá)到最大,然后到成熟期又開(kāi)始下降[12]。此外,在水稻[5]、番茄[13]、豆科植物[14]和花生[15]中也發(fā)現(xiàn)此類(lèi)現(xiàn)象。

本研究顯示,黃瓜葉片內(nèi)生菌種類(lèi)豐富,表現(xiàn)出很強(qiáng)的多樣性,其中很多很可能具有一定的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)瓜期的優(yōu)勢(shì)菌株CE1,占分離內(nèi)生菌數(shù)量的65.0%,與其同源性最高的成團(tuán)泛菌具有潛在的促生作用,例如我們前期研究發(fā)現(xiàn)與CE1同源性較高的成團(tuán)泛菌YS19是水稻優(yōu)勢(shì)菌群,它可以通過(guò)固氮或產(chǎn)生四種植物激素來(lái)促進(jìn)水稻的生長(zhǎng)[16]。有些則與抗病相關(guān),與Y22菌株同源的蘇云金芽孢桿菌有殺蟲(chóng)作用[17];與CE42菌株同源的多粘類(lèi)芽孢桿菌有很高的殺菌抗病活性[18]。還有一些在環(huán)境治理修復(fù)方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值,比如與Y20菌株同源的裂解烴微桿菌,與Y37菌株同源的藤黃微球菌,與CE27菌株同源的簡(jiǎn)單芽孢桿菌等[1920]。在初花期占分離菌總數(shù)的57.6%的優(yōu)勢(shì)種Y1菌株,與其同源性最近的海洋短小桿菌在應(yīng)用價(jià)值方面目前缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究所獲得的內(nèi)生菌在與黃瓜互作中的生物學(xué)效應(yīng),以及潛在的環(huán)境應(yīng)用價(jià)值等都值得進(jìn)一步研究。