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本文作者：其木格蘇都、白梅、孔亞楠、魏愛彬、王記成、張和平單位：青島君益食品有限公司、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

乳酸菌是發(fā)酵食品中的自然生物防腐劑,而其中的一些菌株對宿主健康有益,被稱為益生菌。發(fā)展到現(xiàn)在,由2001年FAO和WHO提出的益生菌定義為大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可,即“當(dāng)給予宿主足夠的量時(shí),可以對宿主起到有益作用的微生物活體”。益生菌制品從最初的亞洲小作坊加工逐漸傳播到歐洲和美國市場,由此而生的功能性食品更是目前增長最快的食品之一[1]。全球工業(yè)分析家預(yù)測預(yù)計(jì)到2015年全球益生菌市場將達(dá)到288億,即使這樣依然認(rèn)為該市場還處于起步階段,有著巨大的發(fā)展空間。因此,需要更有效、穩(wěn)定的益生菌及益生菌產(chǎn)品來迎接應(yīng)對這一挑戰(zhàn)。飲食是攝入益生菌最方便的方式,特別是便于儲(chǔ)存、裝卸、運(yùn)輸,而且是在保質(zhì)期內(nèi)穩(wěn)定的功能性益生菌食品。乳及其制品是大多數(shù)益生菌良好的載體,其中發(fā)酵乳是公認(rèn)最好的載體之一。腸道中足夠的益生菌活菌數(shù)是對宿主達(dá)到良好益生功效的保證[2],因此各個(gè)國家對產(chǎn)品中益生菌的活菌數(shù)都有明確規(guī)定,其含量不得低于106CFU/mL[3]。雙歧桿菌(Bifidobacterium)的益生特性已被人們普遍接受,但Bifidobacterium屬于專性厭氧菌,在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)需要解決由于氧中毒而導(dǎo)致其活菌數(shù)較低的問題。Miller、CraigWilliam等[45]將高氧氣消耗菌種與雙歧桿菌進(jìn)行復(fù)配,兼性厭氧菌嗜熱鏈球菌(Stretococcusther-mophilus)在生長時(shí)能利用溶解氧,可有效保護(hù)雙歧桿菌生長,但到發(fā)酵后期,S.thermophilus代謝產(chǎn)生的酸會(huì)抑制Bifidobacterium生長,所以這種保護(hù)只在發(fā)酵初期有效,對隨后的加工及貯存期間溶氧起不到作用(酸奶一般用聚乙烯和高聚苯乙烯來包裝,厚度在300μm350μm之間,對酸奶的溶氧率為1.05.0cm2/(kg•d)[6])。Dave和Shah報(bào)道將L-半胱氨酸[7]和抗壞血酸[8]作為除氧劑添加到酸奶生產(chǎn)中,L-半胱氨酸是一種含硫氨基酸,既可以降低氧化還原電位,又可以作為一種氨基酸氮源;抗壞血酸是一種常見的食品添加劑,二者都可以減少溶氧維持低的氧化還原電位,有利于Bifidobacterium生長,但會(huì)影響到一般酸奶發(fā)酵劑中S.thermophilus的生長,進(jìn)而影響到酸奶的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味,因此對于一般酸奶可能不太適合。微膠囊包埋技術(shù)也被用來提高Bifidobacterium活菌數(shù),但多項(xiàng)研究表明微膠囊包埋只對一部分菌有作用,應(yīng)用受限[9]。Mills等研究發(fā)現(xiàn),直接降低溶氧、氧化還原電位可保護(hù)非發(fā)酵巴氏殺菌乳在儲(chǔ)存期間的Bifidobacterium活菌數(shù)[10],但只能維持原來的接菌量,活菌數(shù)不會(huì)增加。乳雙歧桿菌V9(B.lactisV9)分離自健康蒙古族兒童糞便,其具有較強(qiáng)的耐酸性,在人工胃腸液中具有良好的耐受性[11]。對致病菌株(志賀氏痢疾桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、埃希氏大腸桿菌)具有一定程度的拮抗作用,可以有效治療小鼠的腹瀉[12]。臨床研究表明,B.lactisV9具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用,對便秘和急慢性腹瀉患者治療效果顯著,服用B.lactisV93周,對便秘、急性腹瀉和慢性腹瀉患者的治療有效率分別為95.3%、95.4%和89.9%[13]。對其基因組學(xué)研究顯示,其菌株遺傳極為穩(wěn)定,在傳代保藏過程中發(fā)生重組、突變幾率極小,可保障其安全生產(chǎn)[14]。本文以上述綜述為出發(fā)點(diǎn),通過改變培養(yǎng)基質(zhì)中氣體組成,研究B.lactisV9在固體MRS培養(yǎng)基表面和液體MRS及脫脂乳中的生長情況,為其在益生菌制品生產(chǎn)應(yīng)用開闊思路,并提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源:B.lactisV9由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種保藏中心(LABCC)提供。

1.1.2試劑和儀器:紐西蘭超特級脫脂乳粉;合成MRS培養(yǎng)基(Oxoid);高純氣體(北京華通精科氣體化工有限公司);REX-C700厭氧培養(yǎng)箱;厭氧指示條(Oxoid,AnaerobicIndicatorBR0055);除氧劑(Oxiod,AnaeroGenAN35);MINIVACPD-52真空泵(Yamato-ULVAC,日本);U-2000型紫外可見分光光度計(jì)(HITACHI,日本);1100液相色譜系統(tǒng)(Agilent,美國);NSC-ⅡA-1200無菌工作臺(tái);HA-300M全自動(dòng)高壓滅菌器(HIRAYAMA,日本)。稀釋液PBS和雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基TPY的配制參照文獻(xiàn)[11]。

1.2方法

1.2.1菌落形成:將真空冷凍保存的B.lactisV9菌粉接種于液體MRS培養(yǎng)基中,37°C厭氧培養(yǎng)活化2代后,劃線于固體MRS培養(yǎng)基上,并將劃線平板分別置于普通培養(yǎng)箱(空氣環(huán)境,N2:O2≈79:21)、充氮?dú)馀囵B(yǎng)箱(N2:99.99%)和混合氣體培養(yǎng)箱(N2:H2:CO2=80:10:10)中,37°C恒溫培養(yǎng)72h,觀察菌落形成狀況。在厭氧培養(yǎng)箱中預(yù)置厭氧指示條以檢驗(yàn)無氧環(huán)境。用于劃線的固體MRS培養(yǎng)基預(yù)先置于厭氧培養(yǎng)箱24h進(jìn)行脫氧處理。在厭氧培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)箱中空氣要先充高純氮?dú)庵脫Q2次,然后再充混合氣體或氮?dú)狻１ＷC每次充氣后培養(yǎng)箱為正壓,防止空氣吸入,同時(shí)可以在培養(yǎng)期間隨時(shí)觀測培養(yǎng)箱的密封情況。另外,培養(yǎng)箱中預(yù)先放置除氧劑和厭氧指示條,充氣后指示條的顏色由淺紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨?說明培養(yǎng)箱中為無氧環(huán)境。

1.2.2B.lactisV9在MRS液體中生長:B.lactisV9活化方法同1.2.1,跟蹤測定第3代OD600值,取OD600=1.0(Mid-logphase)時(shí)培養(yǎng)液以2%(V/V)接種于MRS液體中,分別置于普通培養(yǎng)箱和混合氣體培養(yǎng)箱中,37°C恒溫培養(yǎng)。具體操作方法同1.2.1。每3h測定pH值、OD600值和活菌數(shù),同時(shí)留樣測定乳酸和乙酸含量。

1.2.3B.lactisV9在脫脂乳中生長:B.lactisV9活化方法同1.2.1,取第3代OD600=1.0時(shí)菌液離心所得菌體,加同體積11%滅菌脫脂乳,以2%接種于巴氏殺菌(95°C,5min)脫脂乳中,分別置于普通培養(yǎng)箱和混合氣體培養(yǎng)箱,37°C恒溫箱中培養(yǎng)。具體操作方法同1.2.1。每6h測定pH值、OD600值和活菌數(shù),同時(shí)留樣測定乳酸和乙酸含量。

1.2.4pH值測定:試驗(yàn)樣品調(diào)整溫度至20°C,采用精密pH計(jì)(雷磁PHS-3C,海精密科學(xué)儀器有限公司)測量。1.2.5濁度測定:MRS培養(yǎng)基樣品適當(dāng)稀釋后測定,以未加菌的空白樣為參比,采用比濁法于600nm處測定其濁度。

1.2.6活菌數(shù)測定:10.0g樣品于90.0gPBS稀釋液中,于水平搖床(200r/min)振搖15min,然后梯度稀釋,采用雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基TPY固體培養(yǎng)基平板傾注法,37°C厭氧(N2:H2:CO2=80:10:10)培養(yǎng)72h。

1.2.7液相色譜法測定乳酸、乙酸含量:準(zhǔn)確稱取樣品1g于10mL離心管中,加入3mL1mol/LHCl振蕩混勻,3500×g,離心10min,95°C水浴15min。取上清液經(jīng)0.45μm膜過濾待進(jìn)樣分析。色譜條件:流動(dòng)相:甲醇緩沖溶液(濃度為10mmol/L的PBS,pH2.0)=3:97(V/V),流速為0.5mL/min,紫外檢測波長為210nm,柱溫為35°C,進(jìn)樣量10μL。1.2.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SASANOVA程序處理。

2結(jié)果與討論

2.1氣體環(huán)境對B.lactisV9菌落形成的影響雙歧桿菌是一類專性厭氧乳酸菌,既沒有呼吸鏈也不含有過氧化氫酶,一般認(rèn)為是嚴(yán)格厭氧的,因此在工業(yè)化生產(chǎn)中會(huì)出現(xiàn)氧中毒。然而在具體的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),部分菌株具有氧代謝酶,可以在0.1%21.0%氧氣環(huán)境中存活[1519],表明不同的雙歧桿菌菌株對氧氣的耐受能力不同。目前,國內(nèi)在雙歧桿菌菌種的分離鑒定中較常使用的厭氧氣體組成為N2:H2:CO2=80:10:10[11],同時(shí),越來越多的研究發(fā)現(xiàn),一些雙歧桿菌的氧氣耐受力與二氧化碳有關(guān),即這些菌只在二氧化碳存在時(shí)才表現(xiàn)出一定的氧耐受力。對于B.lactisV9,在空氣、氮?dú)夂突旌蠚怏w環(huán)境中,其菌落形成情況完全不同,見圖1。在混合氣體和氮?dú)猸h(huán)境中菌落形成明顯多于空氣環(huán)境,說明B.lactisV9在很大程度上受到了空氣中氧氣的抑制。B.lactisV9在混合氣體中菌落生長狀況優(yōu)于氮?dú)庵械?說明單純的無氧環(huán)境不一定能保證B.lactisV9的生長處于最佳狀態(tài),還需要考慮無氧氣體環(huán)境的組成成分。此結(jié)果與ShinjiKawasaki等[20]的報(bào)道一致,在無氧條件下,CO2可以促進(jìn)雙歧桿菌菌落生長,但不會(huì)改變菌株的氧氣耐受能力。部分雙歧桿菌菌種在CO2存在時(shí)具有一定的氧耐受性,而且可在一定濃度的CO2條件下生長,也是部分雙歧桿菌的分離鑒定依據(jù)。CO2刺激菌落形成與一些參與CO2固定、水解和羧基化反應(yīng)的酶有關(guān)。另外,推測可能因?yàn)镃O2是氧化形式的“C”,可以像氧氣一樣作為電子受體,來維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位平衡。但CO2促進(jìn)作用的具體機(jī)理還有待研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,B.lactisV9不是嚴(yán)格厭氧菌,在空氣環(huán)境中有菌落形成,但在混合氣體環(huán)境中生長更加良好。

2.2氣體環(huán)境對B.lactisV9在液體MRS培養(yǎng)基中生長的影響鑒于2.1的研究結(jié)果,采用混合氣體和空氣條件對B.lactisV9的生長進(jìn)行進(jìn)一步研究。混合氣體和空氣環(huán)境下,B.lactisV9在液體MRS培養(yǎng)基中的生長曲線見圖2。可以看出,在混合氣體環(huán)境中,B.lactisV9生長曲線呈“S”型,18h左右是對數(shù)生長中期(Mid-logPhase),24h開始進(jìn)入穩(wěn)定期;而在空氣環(huán)境中,OD600值一直持續(xù)緩慢增長,表示B.lactisV9生長明顯受到限制。另外,在混合氣體環(huán)境下,由于CO2在液體MRS中的溶解,不接種B.lactisV9的液體MRS作為對照樣培養(yǎng)30h后的pH值從初始6.43降到了6.29。從表1可以看出,接種B.lactisV9培養(yǎng)30h后,混合氣體環(huán)境pH值(4.42±0.24)顯著低于空氣環(huán)境pH值(5.55±0.24)(P<0.01)。從B.lactisV9的生長趨勢和培養(yǎng)基的pH值變化上可以看出,液體MRS培養(yǎng)基在混合氣體環(huán)境下可有效促進(jìn)B.lactisV9生長。這一點(diǎn)也可以從活菌數(shù)變化上得到證實(shí),培養(yǎng)24h后,混合氣體環(huán)境中B.lactisV9活菌數(shù)(9.11±0.11logCFU/mL)顯著高于空氣環(huán)境(8.04±0.10logCFU/mL)(P<0.01)?，F(xiàn)有的研究表明,對氧氣敏感的雙歧桿菌在有氧時(shí)會(huì)積累H2O2,而H2O2會(huì)抑制其糖代謝的關(guān)鍵酶——果糖-6-磷酸-磷酸酮酶(F6ppk),從而引起氧中毒[17]。在這些反應(yīng)中,NADH氧化酶、NADH過氧化酶和超氧化物歧化酶(SOD)的作用最關(guān)鍵。在一定范圍內(nèi)增加氧氣的濃度,雙歧桿菌分解H2O2的NADH氧化酶和NADH過氧化酶活力都明顯高于無氧環(huán)境[21]。這些酶在兼性厭氧乳酸菌中也存在,并且某些菌株在有氧環(huán)境下生長良好,這種對氧氣的耐受能力與菌體內(nèi)碳水化合物代謝轉(zhuǎn)變聯(lián)系在一起。本研究對培養(yǎng)基中主要的碳水化合物——葡萄糖的代謝產(chǎn)物乳酸、乙酸的含量進(jìn)行了跟蹤檢測。本實(shí)驗(yàn)所用液體MRS培養(yǎng)基中含有16.70±0.35mmol/L的乙酸(源于添加的無水乙酸鈉),不含有乳酸。培養(yǎng)24h時(shí),去除原來培養(yǎng)基中含有的乙酸,在混合氣體環(huán)境下B.lactisV9代謝生成的乙酸和乳酸量分別為12.79±0.86mmol/L和11.99±0.73mmol/L,顯著高于在空氣環(huán)境中生成量為0.65±0.07mmol/L和2.75±0.57mmol/L(P<0.01),混合氣體和空氣環(huán)境中乙酸/乳酸比值分別為1.06:1和0.24:1。Talwalkar和Kailasapathy研究了4株雙歧桿菌在不同氧環(huán)境中的代謝變化,發(fā)現(xiàn)每個(gè)雙歧桿菌菌株的氧耐受能力不同,如代謝物中乙酸與乳酸的比例隨著環(huán)境中氧氣濃度的增加而減少[21]。R.González報(bào)道[22],在缺氧條件下,代謝TPYG培養(yǎng)基產(chǎn)乳酸的最大濃度為8.1mmol/L,乙酸/乳酸的摩爾比為3.5:1;而在有氧條件下,乳酸濃度增加超過2倍,乙酸/乳酸下降到1.5:1。本研究發(fā)現(xiàn),液體MRS培養(yǎng)基中乙酸、乳酸產(chǎn)量受氣體組分條件影響,在混合氣體環(huán)境下產(chǎn)生的乳酸濃度是空氣環(huán)境的4倍左右,而乙酸卻多出約20倍。當(dāng)有氧培養(yǎng)轉(zhuǎn)向無氧培養(yǎng)時(shí)糖代謝產(chǎn)物會(huì)發(fā)生變化,主要是乳酸轉(zhuǎn)化成乙酸,同時(shí)伴隨產(chǎn)生2倍的ATP[23]。以上結(jié)果可以說明混合氣體環(huán)境有利于B.lactisV9在液體MRS培養(yǎng)基中生長,可以有效增加活菌數(shù),代謝產(chǎn)生乙酸、乳酸量增加,且改變了乙酸與乳酸比例。

2.3氣體環(huán)境對B.lactisV9在脫脂乳中生長的影響在巴氏殺菌脫脂乳中,B.lactisV9的生長情況與液體MRS培養(yǎng)基中類似,pH值和活菌數(shù)變化結(jié)果見表2。發(fā)酵18h,混合氣體環(huán)境pH值(4.48±0.07)顯著低于空氣環(huán)境pH值(5.03±0.12)(P<0.01),混合氣體環(huán)境的活菌數(shù)(9.02±0.15logCFU/mL)顯著高于空氣環(huán)境的活菌數(shù)(8.53±0.08logCFU/mL)(P<0.01)?；旌蠚怏w和空氣環(huán)境下發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)生的乙酸、乳酸量分別為60.52±2.30mmol/L、5.17±1.02mmol/L和16.86±0.34mmol/L、5.92±0.81mmol/L,乙酸/乳酸比值分別為11.71:1和2.85:1。在混合氣體環(huán)境下,B.lactisV9發(fā)酵脫脂乳(主要是乳糖)生成的乙酸量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于乳酸。此結(jié)果與B.lactisV9在MRS中生長類似,B.lactisV9發(fā)酵脫脂乳生成的酸以乙酸為主。Meile等[24]發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌可以耐受反應(yīng)器頂空10%氧氣,在氧氣環(huán)境中乳酸濃度為9.9mmol/L,明顯高于厭氧條件下的5.6mmol/L,乳酸的增量引起了代謝產(chǎn)物中乙酸/乳酸摩爾比的變化,從10.1:1降到4.7:1。這樣的變化趨勢與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。但是乙酸/乳酸摩爾比的變化范圍相差較大,這可能是由于菌株自身特性、介質(zhì)中糖濃度不同以及氣體條件不同等因素造成的。從本研究對益生菌B.lactisV9的研究可以看出,無氧環(huán)境的氣體組成會(huì)影響到B.lactisV9的生長及代謝。目前,我國國標(biāo)《GB4789.35-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[25]和《GB/T4789.34-2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)雙歧桿菌檢驗(yàn)》[26]中在對雙歧桿菌計(jì)數(shù)方法中只提到“厭氧培養(yǎng)48±2h后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)”,未對具體的氣體環(huán)境做出規(guī)定。所以對于B.lactisV9而言,同為厭氧條件的純氮?dú)猸h(huán)境和混合氣體環(huán)境,B.lactisV9的菌落形成明顯有差異,這樣就有可能在執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)時(shí)因?yàn)閰捬鯕怏w組成的不同造成B.lactisV9活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的不同。誠然,雙歧桿菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果還受其他諸多條件影響,正如劉偉等所報(bào)道的“雙歧桿菌目前還沒有一套準(zhǔn)確和嚴(yán)格的計(jì)數(shù)方法”[27],這就需要人們進(jìn)一步全面地探索研究。

3結(jié)論

本研究通過在固體MRS培養(yǎng)基、液體MRS培養(yǎng)基及巴氏殺菌脫脂乳接種乳雙歧桿菌BifidobacteriumlactisV9(B.lactisV9),研究不同氣體環(huán)境對B.lactisV9生長及代謝的影響。研究顯示,B.lactisV9不是絕對厭氧菌,混合氣體(N2:H2:CO2=80:10:10)環(huán)境可有效促進(jìn)其菌落形成,更有利于其在MRS液體和巴氏殺菌脫脂乳中生長。此混合氣體環(huán)境,可應(yīng)用于益生菌制劑及制品的生產(chǎn)。這一研究結(jié)果可為B.lactisV9益生菌發(fā)酵乳的生產(chǎn)和產(chǎn)品中B.lactisV9活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)提供指導(dǎo)。此外,氣體組成條件對代謝產(chǎn)物中乙酸/乳酸摩爾濃度比變化的影響,為改善益生菌產(chǎn)品口感提供新思路和可行性證據(jù)。綜上研究可見,環(huán)境中氣體組成影響著B.lactisV9的生長速度及代謝組成,但具體的相關(guān)關(guān)系和作用機(jī)理尚不明確,仍需深入研究。