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本文作者：潘超強(qiáng)、高強(qiáng)、鄭春陽(yáng)、孟慶艷、段強(qiáng)、馮少龍單位：天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室、天津強(qiáng)微特生物科技有限公司

由于公眾對(duì)全球變暖以及世界范圍內(nèi)能源安全的擔(dān)憂,使得由可再生資源生產(chǎn)生物質(zhì)燃料越來(lái)越受到重視[13]。盡管微生物發(fā)酵產(chǎn)乙醇已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史,而且在生物質(zhì)燃料中扮演重要角色,但是由于它有低能量密度、高蒸汽壓、高吸濕性這些缺點(diǎn)而不能作為汽油的理想替代品[4]。相比較而言,長(zhǎng)鏈醇擁有高能量密度、低腐蝕性、低吸濕性、更易與汽油和柴油混合以及與現(xiàn)今的設(shè)備更好的相容性等特點(diǎn),使其成為潛在的新型可再生能源替代品和燃料添加劑[5]。用丙酮丁醇梭菌發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇已經(jīng)擁有近百年的歷史,最近也正受到極大的關(guān)注[6]。近年來(lái),通過(guò)大腸桿菌代謝生產(chǎn)正丁醇,以及正丙醇、異丁醇、2-甲基正丁醇、3-甲基正丁醇等長(zhǎng)鏈醇都被證明是可行的[5,711]。最近研究人員又成功地在細(xì)長(zhǎng)聚球藍(lán)細(xì)菌內(nèi)通過(guò)光合CO2循環(huán)生產(chǎn)異丁醛和異丁醇[12]。2010年3月17日,異丁醇被美國(guó)LeMansSeries(ALMS)學(xué)會(huì)宣布其為第五能源。然而現(xiàn)今世界范圍內(nèi)異丁醇的生產(chǎn)仍然主要依靠石油為原料進(jìn)行化學(xué)合成,但是隨著石油價(jià)格的持續(xù)上漲,以及石油化工引起的環(huán)境污染問(wèn)題等制約了其進(jìn)一步發(fā)展,從而使由可再生資源生產(chǎn)異丁醇展示了良好的發(fā)展前景。過(guò)去的研究表明,自然界中尚未發(fā)現(xiàn)能夠由葡萄糖合成異丁醇的原核生物。目前研究人員通過(guò)特定的基因工程技術(shù)對(duì)一些宿主菌進(jìn)行改造獲得合成異丁醇的能力。2007年美國(guó)UCLA的研究小組首次向大腸桿菌內(nèi)導(dǎo)入酮酸脫羧酶和醇脫氫酶基因以改造其纈氨酸合成途徑從而成功合成異丁醇[5],此后分別于2010年和2011年在谷氨酸棒桿菌和解纖維梭菌內(nèi)利用此套系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了異丁醇的生物合成[4,13]。國(guó)內(nèi)林麗華等[14]也利用相似的系統(tǒng)進(jìn)行了異丁醇生物合成,產(chǎn)量達(dá)到3g/L。異丁醇的生物合成途徑是將纈氨酸前體2-酮異戊酸通過(guò)2-酮異戊酸脫羧酶(KivD)代謝成異丁醛,然后由醇脫氫酶(AdhA)還原成異丁醇(圖1)。大腸桿菌自身沒(méi)有2-酮異戊酸脫羧酶和以輔酶Ⅰ為輔酶的醇脫氫酶,因此需要外源引進(jìn)這兩個(gè)基因并使其表達(dá)。本研究將乳酸乳球菌1.2829的kivD和adhA基因單獨(dú)或串聯(lián)克隆到大腸桿菌DH5α宿主中進(jìn)行表達(dá),從而合成異丁醇,并研究了KivD和AdhA酶活的最適溫度和pH。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種和質(zhì)粒:乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)1.2829購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所普通微生物菌種保藏管理中心,大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒pZY507由德國(guó)斯圖加特大學(xué)GeorgA.Sprenger教授贈(zèng)送,質(zhì)粒載體pMD19-TSimpleVector購(gòu)自寶生物(大連)公司。

1.1.2主要試劑:限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、T4DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒與細(xì)菌質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自RenogenBiolab科技有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、2-酮異戊酸、異丁醛、異丁醇與輔酶Ⅰ(NADH)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:大腸桿菌培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化子篩選采用LB培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)基為添加終濃度0.2mol/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化子篩選培養(yǎng)基添加抗生素為氨芐青霉素(終濃度為100mg/L)和鹽酸四環(huán)素(終濃度為50mg/L)。培養(yǎng)條件為37°C或30°C、200r/min。1.1.4引物:根據(jù)GenBank中乳酸乳球菌基因組序列設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物(表1,下劃線部分為酶切位點(diǎn)),并委托北京華大基因技術(shù)有限公司合成。引物1-s、1-as用于擴(kuò)增2-酮異戊酸脫羧酶基因kivD。引物2-s、2-as用于擴(kuò)增醇脫氫酶基因adhA。

1.2方法

1.2.1表達(dá)載體pZY507-kivD、pZY507-adhA、pZY507-kivD-adhA的構(gòu)建:這3種表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建如圖2所示。乳酸乳球菌基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。使用引物1、2分別進(jìn)行目的基因kivD和adhA的PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95°C5min;92°C45s,63°C45s,72°C90s,共32個(gè)循環(huán);72°C10min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒提取、DN段與載體的酶切和連接分別參照相應(yīng)的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,大腸桿菌轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。

1.2.2KivD和AdhA酶的表達(dá):將經(jīng)過(guò)基因改造后篩選得到的大腸桿菌E.coli-K、E.coli-A、E.coli-X(分別含有質(zhì)粒pZY507-kivD、pZY507-adhA、pZY507-kivD-adhA)過(guò)夜活化后按1:100接入發(fā)酵培養(yǎng)基,37°C、200r/min培養(yǎng),當(dāng)OD600達(dá)到0.4時(shí)添加IPTG至終濃度1mmol/L,30°C、200r/min培養(yǎng)8h以誘導(dǎo)工程菌中KivD和AdhA酶的表達(dá)。

1.2.3KivD和AdhA酶的粗提:將方法

1.2.2得到的菌體離心(7000r/min,4°C,10min),再用預(yù)冷的0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.5)洗滌3遍,最后重懸于磷酸鈉緩沖液中。用超聲波破碎儀破碎菌體重懸液(功率400W,工作2s/間隔4s,共20min),離心(12000r/min,4°C,10min),取上清液即為粗酶液。

1.2.4異丁醇發(fā)酵:將基因工程菌E.coli-K、E.coli-A、E.coli-X活化后按1:100接入于LB種子培養(yǎng)基,37°C、200r/min培養(yǎng)過(guò)夜后再以1:100接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,當(dāng)OD600達(dá)到0.4時(shí)添加IPTG至終濃度1mmol/L,30°C、200r/min發(fā)酵24h。

1.2.5異丁醛、異丁醇和殘?zhí)菧y(cè)定:發(fā)酵液中異丁醛與異丁醇產(chǎn)量采用Agilent7890氣相色譜儀結(jié)合G1888頂空進(jìn)樣器測(cè)定。色譜條件:Poly-ethyleneGlycolHP-INNOWax色譜柱,FID(250°C)檢測(cè)器;進(jìn)樣口壓力4.7543psi;初始柱溫40°C保持2min,再以15°C/min的速率升到110°C保持4.5min;氫氣流量30mL/min,空氣流量400mL/min,氮?dú)饬髁?0mL/min;頂空條件:爐溫50°C,環(huán)溫60°C,傳輸管溫100°C,平衡時(shí)間5min,加壓0.4min,注射1min,重復(fù)測(cè)定3次取均值。發(fā)酵液殘?zhí)鞘褂肧BA-40C型生物傳感分析儀測(cè)定,重復(fù)測(cè)定3次取均值。

1.2.6KivD和AdhA酶活測(cè)定與蛋白電泳檢測(cè):KivD和AdhA酶活測(cè)定分別參照文獻(xiàn)[16]和[17]進(jìn)行,在4mL反應(yīng)體系中,KivD和AdhA粗酶液的加入量分別為500L與15L,重復(fù)測(cè)定2次取均值。粗酶液中蛋白含量使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定,重復(fù)測(cè)定3次取均值。粗酶液的蛋白電泳檢測(cè)參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以乳酸乳球菌(L.lactis)1.2829的總DNA為模板,按照方法1.2.1用引物1、2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在1.4kb和1.1kb附近分別有特異的單一DNA條帶(圖3),與目的基因片段大小一致。將PCR產(chǎn)物與pMD19-TSimpleVector連接后委托北京華大基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,經(jīng)過(guò)比對(duì),PCR產(chǎn)物與目的基因序列kivD和adhA基本一致。按圖2所示,將質(zhì)粒載體pZY507與相應(yīng)的DN段進(jìn)行酶切、連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α宿主,然后在選擇培養(yǎng)基上挑取單菌落、提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證和PCR驗(yàn)證,最后經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證,逐步構(gòu)建得到改造菌株E.coli-K(含有表達(dá)質(zhì)粒pZY507-kivD)、圖3L.lactis1.2829目的基因PCR產(chǎn)物Fig.3PCRproductsofthetargetgenesofL.lactis1.2829注:1:1kbDNA分子量標(biāo)準(zhǔn);2:引物1-s與1-as的PCR產(chǎn)物;3:引物2-s與2-as的PCR產(chǎn)物.Note:1:1kbDNAladder;2:PCRproductbyprimers1-sand1-as;3:PCRproductbyprimers2-sand2-as.E.coli-A(含有表達(dá)質(zhì)粒pZY507-adhA)和E.coli-X(含有表達(dá)質(zhì)粒pZY507-kivD-adhA),其中表達(dá)質(zhì)粒pZY507-kivD、pZY507-adhA為tac啟動(dòng)子下的單順?lè)醋酉到y(tǒng),pZY507-kivD-adhA為tac啟動(dòng)子下的雙順?lè)醋酉到y(tǒng),且導(dǎo)入的2個(gè)外源基因均攜帶自身的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。

2.2溫度和pH對(duì)KivD與AdhA酶活的影響按照方法1.2.3分別制備E.coli-K、E.coli-A、E.coli-X的KivD或/與AdhA粗酶液。按照方法1.2.6進(jìn)行KivD和AdhA的酶活性質(zhì)研究,溫度和pH對(duì)KivD和AdhA酶活的影響結(jié)果見(jiàn)圖411。

2.2.1溫度對(duì)KivD酶活的影響:溫度對(duì)酶活的影響分為兩部分:隨著溫度的升高,(1)瞬時(shí)酶反應(yīng)速率提高,對(duì)酶活為正影響;(2)酶失活速率升高,對(duì)酶活為負(fù)影響。因此,溫度對(duì)酶活的影響取決于二者的強(qiáng)弱。由圖4和圖5發(fā)現(xiàn),隨著溫度的上升,瞬時(shí)反應(yīng)速率的提高對(duì)酶活的正影響逐漸被高溫引起酶失活的負(fù)影響所掩蓋,而且隨著體系溫度升高,酶反應(yīng)完成程度也逐漸下降,因此較低的溫度有利于酶較長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)。由圖可知,25°C、30°C、35°C的反應(yīng)體系最終酶反應(yīng)完成程度相差不大,但是鑒于25°C反應(yīng)體系中初始酶活較低以及當(dāng)環(huán)境溫度太高時(shí)(≥35°C)細(xì)胞老化較快,不利于長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵,因此之后的酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)以及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均采用30°C。

2.2.2pH對(duì)KivD酶活的影響:根據(jù)圖6和圖7,pH變化對(duì)KivD酶活有較大影響,pH6.5為KivD酶的最適pH,而且酸性pH對(duì)KivD酶活的影響比堿性pH更為顯著。

2.2.3溫度對(duì)AdhA酶活的影響:圖8和圖9結(jié)果顯示,隨著溫度的上升,瞬時(shí)反應(yīng)速率的提高對(duì)酶活的正影響逐漸被高溫引起酶失活的負(fù)影響所掩蓋,而且隨著體系溫度升高,酶反應(yīng)完成程度也逐漸下降,因此較低的溫度有利于酶較長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)。由于25°C和30°C的酶反應(yīng)速率差不大以及體系反應(yīng)程度的微小差異,考慮到較高的溫度有利于菌體的生長(zhǎng)代謝,因此之后實(shí)驗(yàn)的酶反應(yīng)溫度以及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均采用30°C。

2.2.4pH對(duì)AdhA酶活的影響:圖10和圖11結(jié)果表明,pH對(duì)AdhA酶活有較大影響,pH6.5為AdhA酶的最適pH,而且堿性pH對(duì)AdhA酶活的影響比酸性pH更為顯著。

2.3粗酶液中蛋白含量測(cè)定與蛋白電泳結(jié)果按照方法1.2.6測(cè)定了粗酶液中蛋白含量,結(jié)果見(jiàn)表2,粗酶液蛋白電泳結(jié)果見(jiàn)圖12。由圖12發(fā)現(xiàn)KivD在E.coli-K中成功表達(dá),AdhA在E.coli-A中成功表達(dá),KivD和AdhA在E.coli-X中成功表達(dá),但是由酶蛋白條帶的亮度可以看出KivD的表達(dá)量明顯低于AdhA。

2.4發(fā)酵產(chǎn)物及殘?zhí)菧y(cè)定結(jié)果按方法1.2.5測(cè)定發(fā)酵液中異丁醛與異丁醇的產(chǎn)量和殘?zhí)橇?結(jié)果見(jiàn)表3。由表3發(fā)現(xiàn)只有串聯(lián)克隆表達(dá)kivD和adhA基因的菌株E.coli-X才能夠合成異丁醇。菌株E.coli-K由于缺少將異丁醛還原成異丁醇的醇脫氫酶,其發(fā)酵液中只有痕量的異丁醛但沒(méi)有異丁醇。異丁醛產(chǎn)量低有可能是因?yàn)橛捎诋惗∪┑姆e累對(duì)KivD乃至宿主自身造成了抑制,使得異丁醛不再繼續(xù)積累。

3討論

雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠天然發(fā)酵產(chǎn)異丁醇的微生物,但通過(guò)合成生物學(xué)手段改造的代謝工程菌株已經(jīng)可以在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模初步實(shí)現(xiàn)這一目的。如UCLA的研究小組在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)了纈氨酸合成路線上游的3個(gè)基因(alsS、ilvC、ilvD),并敲除了相關(guān)代謝旁路的關(guān)鍵基因(adhE、ldhA、frdAB、fnr和pta)后,通過(guò)112h的長(zhǎng)時(shí)間補(bǔ)料發(fā)酵,異丁醇最終產(chǎn)量可達(dá)到22g/L[5],證明了利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇具有潛在的工業(yè)化前景。本研究構(gòu)建的基因工程菌株E.coli-K(含有表達(dá)質(zhì)粒pZY507-kivD)、E.coli-A(含有表達(dá)質(zhì)粒pZY507-adhA)和E.coli-X(含有表達(dá)質(zhì)粒pZY507-kivD-adhA)分別表達(dá)了KivD、AdhA和KivD與AdhA酶活力,表明質(zhì)粒pZY507中tac啟動(dòng)子下的單、雙順?lè)醋酉到y(tǒng)可單獨(dú)或共同表達(dá)kivD與adhA基因。與表達(dá)的酶活相對(duì)應(yīng),E.coli-K只產(chǎn)微量的中間體異丁醛,E.coli-A不產(chǎn)異丁醛與異丁醇,只有E.coli-X發(fā)酵24h異丁醇產(chǎn)量為0.12g/L。雖然E.coli-X的異丁醇產(chǎn)量與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果有較大差距,但本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了這條合成路線具有可實(shí)行性,并為下一階段的研究奠定了基礎(chǔ)。酶活測(cè)定中粗酶液添加量的不同和SDS-PAGE結(jié)果證實(shí),異丁醇產(chǎn)量不高的原因是KivD的酶量表達(dá)遠(yuǎn)低于AdhA,此現(xiàn)象是否由基因串聯(lián)表達(dá)所引起有待于進(jìn)一步研究,但該實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了KivD的表達(dá)量成為合成異丁醇的瓶頸。今后如能采用源自高酶活菌株的kivD基因重新構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒,或大幅度提高現(xiàn)有kivD基因的表達(dá),并結(jié)合性能優(yōu)良的大腸桿菌宿主與優(yōu)化培養(yǎng)條件等措施,則異丁醇產(chǎn)量應(yīng)有較大提高。