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摘要：目的：建立簡(jiǎn)便有效的人腹膜間皮細(xì)胞（HPMC）的體外培養(yǎng)方法。方法：用0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2消化人大網(wǎng)膜組織，細(xì)胞懸液經(jīng)100目篩網(wǎng)濾過后進(jìn)行培養(yǎng)。用形態(tài)學(xué)、免疫組化（SP法）鑒定細(xì)胞。結(jié)果：分離培養(yǎng)的細(xì)胞光鏡下呈鋪路鵝卵石狀。免疫組化鑒定顯示角蛋白、波形蛋白抗原陽(yáng)性，第Ⅷ因子、白細(xì)胞CD45抗原陰性，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞的確是HPMC。結(jié)論：胰蛋白酶消化法是一種簡(jiǎn)單實(shí)用的分離HPMC的方法。

關(guān)鍵詞：腹膜間皮細(xì)胞；胰蛋白酶；大網(wǎng)膜

腹腔粘連是腹部手術(shù)后常見的并發(fā)癥，常引起腸梗阻、慢性腹痛，以及不孕、不育等，而且粘連很難通過再次手術(shù)加以改善[1]。近年來(lái)對(duì)腹腔粘連的形成機(jī)制有了較深入的研究，認(rèn)為腹腔粘連的形成與多種因素有關(guān)，其中腹膜間皮細(xì)胞的完整性及功能正常與否是腹腔粘連形成的關(guān)鍵因素[2]。因此，建立人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)體系，為體外研究人腹膜間皮細(xì)胞生理功能及其在腹腔粘連防治中的作用提供了有效手段。

早在20世紀(jì)80年代初，Wu等[3]通過直接從患者腹水中獲取腹膜間皮細(xì)胞的方法，成功地培養(yǎng)出人腹膜間皮細(xì)胞。此后Kern[4]和Stylianou[5]等分別采用膠原酶消化組織法和直接種植法，培養(yǎng)出人腹膜間皮細(xì)胞，Stylianou并完整地闡述了人腹膜間皮細(xì)胞的鑒定方法。雖然目前人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)方法很多，但由于培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞的條件苛刻且易受成纖維細(xì)胞污染等原因，要獲得大量、高純度的人腹膜間皮細(xì)胞仍為實(shí)驗(yàn)研究中的難題。我們綜合文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)，建立了人腹膜間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。

1材料與方法

1.1取材

無(wú)菌取自江蘇省中醫(yī)院普外科、肛腸科腹部手術(shù)切除的大網(wǎng)膜。

1.2主要儀器設(shè)備

眼科剪、鑷，培養(yǎng)皿，50mL培養(yǎng)瓶，吸管，10mL尖底離心管，CO2培養(yǎng)箱，超凈臺(tái)，離心機(jī)，倒置相差顯微鏡，100目不銹鋼篩，0.22濾膜過濾器。

1.3主要試劑

1.3.1PBS液氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.56g，磷酸二氫鉀0.2g溶于1000mL三蒸水中，過濾滅菌分裝，室溫保存。

1.3.21640培養(yǎng)基InvitrogenCorporation公司產(chǎn)品，按說明配制，并使其含有青鏈霉素各100U/mL，小牛血清20%。

1.3.3細(xì)胞消化液胰蛋白酶（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）2.5g，EDTA二鈉鹽0.16g溶于1000mLPBS液中，過濾除菌，分裝于小瓶?jī)?nèi)，-20℃保存。

1.3.4免疫組化抗體波形蛋白抗體，第8因子抗體，CD45抗體均為福建邁新公司產(chǎn)品。

1.4腹膜間皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)

無(wú)菌摘取腹部手術(shù)切除的大網(wǎng)膜，剪取血管脂肪相對(duì)少的網(wǎng)膜組織，大小約3cm×3cm，將剪取的網(wǎng)膜組織置于含500U/mL青霉素和500L/mL鏈霉素的無(wú)菌生理鹽水中浸泡20min，然后用生理鹽水流動(dòng)沖洗5min，將漂洗后的網(wǎng)膜組織平鋪于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再用PBS反復(fù)漂洗至沒有油珠漂浮，同時(shí)剪除血管及脂肪，將洗凈的網(wǎng)膜組織剪成1cm×1cm大小，加入0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTA細(xì)胞消化液20mL，用吸管反復(fù)吹打均勻，裝于50mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化25min，每5min振搖1次，最后5min保持靜止。消化結(jié)束后將消化液用100目不銹鋼篩過濾于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入等量含20%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液終止消化。用移液器分裝于10mL尖底離心管，1000r/min，離心10min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)液溶解細(xì)胞沉淀，分裝于50mL培養(yǎng)瓶，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.5腹膜間皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后，鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，貼壁良好的以等體積的新鮮完全培養(yǎng)液替換瓶?jī)?nèi)全部陳舊培養(yǎng)液，貼壁情況差的以等體積的新鮮完全培養(yǎng)液替換瓶?jī)?nèi)一半的陳舊培養(yǎng)液，此后每3d全換液1次。約培養(yǎng)5~8d細(xì)胞生長(zhǎng)融合，可以首次傳代。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液2mL，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化15min。鏡下觀察細(xì)胞消化情況，細(xì)胞脫落變形后，加入4mL完全培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞懸液分裝于離心管內(nèi)1000r/min，離心10min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)液溶解細(xì)胞沉淀，傳代于6孔板（將蓋玻片裁成4片，泡酸，洗凈，烘干，在盛有多聚賴氨酸的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)浸泡5~10min，取出，在干燥箱內(nèi)60℃烘干1h，高壓滅菌。將滅菌后的蓋玻片放置于6孔板內(nèi)，每孔3片）內(nèi)，加入適量完全培養(yǎng)液。繼續(xù)在37℃，5%CO2，濕度95%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，至細(xì)胞完全貼壁伸展。

1.6腹膜間皮細(xì)胞的鑒定

1.6.1免疫組化鑒定①吸去6孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS（pH7.2~7.4）洗2次，每次3min，將細(xì)胞爬片取出，用生理鹽水洗2遍，隨即放入10%中性福爾馬林固定30min；蒸餾水洗4次，每次3min。②加入0.1%TritonX100（PBSpH7.4配制），室溫10min，PBS洗3次。③抗原修復(fù)，根據(jù)不同一抗的要求進(jìn)行（CD45無(wú)須修復(fù)，波形蛋白和第8因子用檸檬酸緩沖液高壓加熱修復(fù)。滴加即用型一抗、室溫下孵育60minBPS洗3次每次5min，去除PBS。每張蓋玻片滴加50LElivision試劑盒中的試劑A，室溫下20min，PBS洗3次，每次3min。每張蓋玻片滴加50LElivision試劑盒中的試劑B，室溫下30min，BPS洗4次，每次5min）。④DAB顯色，每張蓋玻片滴加新鮮配置的DAB顯色溶液，在顯微鏡下觀察3~10min；自來(lái)水洗5min，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗，PBS返藍(lán)。⑤脫水，逐級(jí)脫水：過70%、80%、90%、95%酒精各1次，100%酒精2次，每次1min；透明，過二甲苯溶液3次，每次3min。⑥封片，將有細(xì)胞的一面向下，用中性樹膠封片。自然通風(fēng)干燥。普通光學(xué)顯微鏡觀察，拍照。

1.6.2掃描電鏡鑒定①細(xì)胞準(zhǔn)備：同間皮細(xì)胞傳代，取出細(xì)胞爬片浸入PBS中漂洗細(xì)胞表面；②固定：將細(xì)胞爬片放入青霉素小瓶中，加入4℃預(yù)冷的3%的戊二醛，4℃過夜。吸出固定液，用PBS浸洗2次，每次10min。再加入4℃預(yù)冷的1%的四氧化鋨，在4℃固定1h。PBS浸洗2次，每次10min。③脫水：用30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精逐級(jí)脫水，各10min。④置換：將樣品放入醋酸異戊醋:丙酮=l:1的混合液中10min，然后放入醋酸異戊酯中2次，各10min；⑤臨界點(diǎn)干燥：預(yù)冷臨界點(diǎn)干燥室的樣品室，使其溫度降到0℃，將玻片放入樣品籃，樣品籃的上下兩面事先鋪好濾紙，在保證細(xì)胞被醋酸異戊醋浸潤(rùn)的情況下，將樣品籃放入樣品室。擰緊室蓋，充入液態(tài)CO2，同時(shí)緩慢排出CO2氣體，反復(fù)3次，使液態(tài)CO2置換出細(xì)胞中的醋酸異戊醋，加熱樣品室，使CO2達(dá)到臨界狀態(tài)。緩慢的排出CO2，待樣品室壓力降為零，取出樣品。⑥離子濺射鍍膜：從樣品籃中取出玻片，用銀膠將干燥樣品粘到樣品托上。

導(dǎo)電膠干燥后，將樣品托放入離子濺射儀的真空罩內(nèi)，抽真空。當(dāng)真空度達(dá)0.1托后，加高壓1000V，離子濺射鍍膜。⑦電鏡觀察：?jiǎn)?dòng)掃描電鏡，安裝樣品，觀察細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，拍照。

1.6.3透射電鏡鑒定①消化間皮細(xì)胞，1000r/min，離心5min，3%戊二醛固定，PBS洗滌2次，每次20min；②1%鋨酸固定30min，PBS浸洗2次，每次10min；③脫水：用30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精逐級(jí)脫水，各10min；④100%丙酮固定10min；Epon812浸泡、包埋；⑤LKB-V型超薄切片機(jī)切片（70m）；H-600透射電鏡（日本）下觀察、拍片。

2結(jié)果

剛從大網(wǎng)膜消化下來(lái)的間皮細(xì)胞在倒置顯微鏡下為葡萄串狀，50%的間皮細(xì)胞大約24h左右貼壁，個(gè)別細(xì)胞伸展。72h所有貼壁細(xì)胞均伸展，呈多形性（梭形、橢圓形、多角形等），邊緣不整，細(xì)胞呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀生長(zhǎng)，與相鄰的細(xì)胞相互連接。以后細(xì)胞拉網(wǎng)生長(zhǎng)現(xiàn)象減少，生長(zhǎng)融合呈多角形，大小較為一致，似鋪路鵝卵石樣外觀。細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，2~4代細(xì)胞的形態(tài)與生長(zhǎng)方式與原代細(xì)胞基本無(wú)異。5代開始間皮細(xì)胞增殖明顯緩慢。

2.1免疫組化鑒定

光鏡下觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的波形蛋白染色為陽(yáng)性，是間皮細(xì)胞的特征。波形蛋白抗原陽(yáng)性，CD45、第8因子抗原陰性可排除成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞。

2.2超微結(jié)構(gòu)

掃描電鏡下細(xì)胞完全鋪展，與周圍對(duì)比不強(qiáng)烈。細(xì)胞呈橢圓形或多角形，胞核圓形，位于細(xì)胞中央、較小，有核處細(xì)胞隆起較厚。細(xì)胞表面大量密集的微絨毛，細(xì)胞周圍高密度的絨毛在背景中形成高密度的暈圈。透射電鏡檢查：細(xì)胞表面存在大量多少不等的微絨毛，細(xì)胞漿內(nèi)豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，未見Weibelpalade小體。

3討論

間皮細(xì)胞培養(yǎng)中要注意以下幾點(diǎn)：①正確確定首次換液時(shí)間，避免換液過早，首次換液越晚越好，最好第3天進(jìn)行，動(dòng)作輕柔，減少振蕩。原代培養(yǎng)頭3天盡量勿動(dòng)培養(yǎng)液，以免干擾間皮細(xì)胞貼壁，換液越早丟失的間皮細(xì)胞數(shù)目越多；②胰蛋白酶消化后，消化液中的間皮細(xì)胞不要，因?yàn)樽钕认聛?lái)的往往是活力不好的細(xì)胞。終止消化后用培養(yǎng)液吹打下來(lái)的細(xì)胞活力好，生長(zhǎng)快；③注入培養(yǎng)瓶中的間皮細(xì)胞要具備一定細(xì)胞密度，不要太稀。生長(zhǎng)良好的細(xì)胞可提供“化學(xué)信使”去促進(jìn)其它細(xì)胞生長(zhǎng)，因此細(xì)胞密集時(shí)它們彼此能提供和接受該“化學(xué)信使”越長(zhǎng)越好；假若過稀，則可因缺乏該化學(xué)信使而停止生長(zhǎng)、死亡。此外，腹膜供體的年齡越年輕越好。

雖然目前國(guó)內(nèi)、外的文獻(xiàn)已介紹了多種間皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，但這些培養(yǎng)方法均較為復(fù)雜且重復(fù)性不高，不能滿足科學(xué)研究的需要。本實(shí)驗(yàn)所建立的體外人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)模型，操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)迅速，4~7d即可傳代，可重復(fù)性強(qiáng)。

【參考文獻(xiàn)】

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