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摘要：目的：探討β-環(huán)連蛋白在腎癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其變化機(jī)制。方法：采用免疫組織化學(xué)、蛋白印跡、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等方法對(duì)本院收治的26例腎癌患者手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了研究。結(jié)果：26例患者中有25例癌組織中細(xì)胞胞漿內(nèi)β-環(huán)連蛋白表達(dá)明顯高于正常組織，而且腫瘤分期越高，癌細(xì)胞內(nèi)β-環(huán)連蛋白的表達(dá)也越強(qiáng)，pT3和pT4期的腫瘤內(nèi)的表達(dá)明顯高于pT1和pT2期的腫瘤，P＜0.01，但β-環(huán)連蛋白mRNA的表達(dá)水平并無(wú)明顯變化。結(jié)論：細(xì)胞內(nèi)β-環(huán)連蛋白表達(dá)的增加與腎癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能是腎癌形成和發(fā)展的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：腎腫瘤癌β-環(huán)連蛋白

β-環(huán)連蛋白（β-catenin）作為細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，即是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要成分，又與細(xì)胞間黏附作用有關(guān)，這兩種作用都與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。目前，在大腸癌、肺癌等腫瘤的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞胞漿內(nèi)β－環(huán)連蛋白表達(dá)增加，但其在腎癌中的表達(dá)情況尚未見(jiàn)報(bào)道。為了探討β－環(huán)連蛋白與腎癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，我們采用免疫組織化學(xué)、蛋白印跡（westernblot）及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）方法對(duì)26例腎癌患者進(jìn)行了研究。

資料與方法

隨機(jī)選擇1996～1997年間本院腎癌手術(shù)標(biāo)本26例，病理證實(shí)為腎細(xì)胞癌，其中男性20例，女性6例，年齡19～77歲，平均59.3歲。透明細(xì)胞癌18例，顆粒細(xì)胞癌4例，混合細(xì)胞癌4例。按臨床分期：T1期7例，T2期13例，T3期5例，T4期1例。每份標(biāo)本為2份，癌組織1份，相應(yīng)的正常腎組織1份，經(jīng)10％福爾馬林固定，石蠟包埋，癌組織切片2～3張，正常腎組織切片2張，分別做病理檢查和免疫組化檢驗(yàn)。留取部分新鮮標(biāo)本于液氮內(nèi)用于提取胞漿蛋白和mRNA。

1．免疫組織化學(xué)方法：β-catenin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santacruz公司，免疫組化采用鏈菌素抗生物素蛋白-生物素酶標(biāo)法（LSAB），其主要操作步驟：（1）石蠟切片脫蠟入水；（2）3％過(guò)氧化氫酸甲醇室溫下孵育30min，封閉過(guò)氧化物酶；（3）枸櫞酸鹽緩沖液（0.01mol,pH6.0）中92～98℃10min修復(fù)抗原；（4）加2％牛血清白蛋白（BSA）約50μl室溫下孵育30min以阻斷非特異性抗原的反應(yīng)；（5）加β-環(huán)連蛋白抗體（1∶100）約50μl于濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜;（6）加生物素標(biāo)記的二抗（1∶300）約50μl室溫下孵育60min;（7）加鏈菌素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶液（1∶500）50μl，室溫下孵育60min;（8）DAB顯色，蘇木素復(fù)染及中性樹(shù)脂封片，各步之間用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5min，3次。陰性對(duì)照用PBS替代一抗，其它相同。結(jié)果分析采用半定量方法，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，切片內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于20%計(jì)為陽(yáng)性，小于20%計(jì)為陰性，陽(yáng)性結(jié)果又根據(jù)染色深淺分為陽(yáng)性（＋）和強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋）。正常腎組織和癌組織以及腫瘤不同分期之間的染色結(jié)果比較采用直接概率法檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。

2．Westernblot:應(yīng)用單去污劑裂解緩沖液從組織中提取胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)，加等量蛋白提取物于10％聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中電泳，用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加1%～3%BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，再加β-環(huán)連蛋白抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素。最后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，利用Molecularanalyst圖象分析軟件分析條帶灰度值，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差別用t檢驗(yàn)。

3．RT-PCR：應(yīng)用異硫氰酸胍一步法［1］提取組織mRNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqmDNA聚合酶購(gòu)自promega公司。Thermalcycler1型PCR儀，美國(guó)PE公司。IBM586計(jì)算機(jī)控制的Geldoc1000成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。步驟：（1）逆轉(zhuǎn)錄：25μl反應(yīng)體系中加入等量的變性后的RNA（3μg）及OligodT0.1μl、AMV0.5μl（20U/μl）、5×Buffer10μl、RNsin100u及無(wú)RNA酶的水，混勻、離心5s，42℃孵育1h，95℃5至7min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活后立即置冰浴，待用或－20℃保存。（2）PCR反應(yīng)：參照文獻(xiàn)［2］設(shè)計(jì)β-catenin引物，上游引物為：5′GCTaCTTGTGAGTGAAG3′，下游引物為：5′ATGGAACCAGACAGAAAAGC3′，共200bp。以β-actin為對(duì)照，上游引物為：5′CTGTCTGGCGGCACCACCAT3′，下游引物為：5′GCAaCTAAGTCATAGTCCGC3′，共254bp。引物由北京生物制品研究所合成，反應(yīng)體系為10×Buffer5μl、25mmolMgCI24μl、dNTP1μl（各10mmol/μl）、Taq酶0.3μl（5U/μl）、逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板2μl、上下游引物各0.5μl（50pmmol/μl）、加水至50μl?；靹?、加入50μl石蠟油覆蓋液面，離心10s。將反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，先95℃7min變性，再接95℃變性1min30s、54℃復(fù)性1min、72℃延伸1min30s，共35個(gè)循環(huán)后接72℃延伸10min。反應(yīng)終止后置－20℃保存。(3)PCR產(chǎn)物定量：PCR擴(kuò)增結(jié)束后，β-catenin和β-actin各取10μl樣品于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳60min，電壓為5～7V/cm，每毫升凝膠內(nèi)含0.5μg的溴化已啶（EB），用電腦照膠儀分析各條帶的灰度值，比較腫瘤與正常組織樣品的β-環(huán)連蛋白與β-actin的比值，應(yīng)用秩和檢驗(yàn)方法對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

結(jié)果

1．免疫組織化學(xué)：26例腎癌患者癌組織細(xì)胞漿內(nèi)β-環(huán)連蛋白染色強(qiáng)陽(yáng)性者9例，陽(yáng)性16例，陰性1例，相應(yīng)正常腎組織中陽(yáng)性2例，其余均為陰性。β-環(huán)連蛋白在腎癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)主要集中在胞漿內(nèi),核內(nèi)也有染色，腫瘤間質(zhì)未見(jiàn)陽(yáng)性染色。β-環(huán)連蛋白在腎癌中的表達(dá)較正常腎組織中的表達(dá)明顯增加，差異有顯著性意義（χ2=21.74，P＜0.01）。

在癌組織中的表達(dá)與病理類(lèi)型及年齡無(wú)關(guān)，與臨床分期有關(guān)，20例pT1和pT2期的腫瘤中強(qiáng)陽(yáng)性者4例，陽(yáng)性者15例，陰性1例；6例pT3和pT4期的腫瘤中5例為強(qiáng)陽(yáng)性，1例陽(yáng)性。臨床分期為pT3、pT4期的腫瘤較pT1、pT2期腫瘤β-環(huán)連蛋白的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。

2．Westernblot:β-環(huán)連蛋白在腎癌癌細(xì)胞漿內(nèi)的表達(dá)比其在正常腎組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）。

3．RT-PCR：以每例標(biāo)本癌組織和正常腎組織中β-環(huán)連蛋白與β-actin灰度值的比值，經(jīng)秩和檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,說(shuō)明癌組織中β-環(huán)連蛋白基因的表達(dá)并無(wú)增加

討論

β-環(huán)連蛋白在細(xì)胞內(nèi)具有兩種功能［3］：其一是參與細(xì)胞間黏附作用；其二是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的重要成分，這兩種作用均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，特別是在Wnt信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，近年來(lái)不斷受到人們的關(guān)注。正常組織中細(xì)胞內(nèi)由于結(jié)腸腺性息肉基因（APC）、哺乳動(dòng)物糖元合成激酶3(GSK3β)等的作用，游離的β-環(huán)連蛋白很快即被降解，一般不會(huì)出現(xiàn)聚集。在癌組織中由于多種原因使癌細(xì)胞胞漿內(nèi)β-環(huán)連蛋白增加、聚集，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF形成復(fù)合物、進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與DNA結(jié)合，促進(jìn)靶基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄。靶基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。有報(bào)告3個(gè)大腸癌細(xì)胞系中均有β-環(huán)連蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，認(rèn)為大腸癌癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化與β-環(huán)連蛋白靶基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄關(guān)系密切，β-環(huán)連蛋白的靶基因可能就是大腸癌的癌基因［4］。Xingpei等［5］報(bào)告了65例大腸癌患者細(xì)胞核內(nèi)有β-環(huán)連蛋白的高表達(dá)，且與腫瘤的分期分級(jí)有關(guān)。在對(duì)6例進(jìn)行性纖維瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)有β-環(huán)連蛋白表達(dá)的增加［6］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果從定性和定量?jī)蓚€(gè)方面都證明在腎癌癌細(xì)胞胞漿內(nèi)有β-環(huán)連蛋白的高表達(dá)，提示在腎癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有β-環(huán)連蛋白的參與，而且其高表達(dá)的程度與腫瘤的分期分級(jí)有關(guān)。腫瘤的分期越高其表達(dá)量相對(duì)也高，說(shuō)明由β-環(huán)連蛋白引起的靶基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄與腎癌癌細(xì)胞的增殖與發(fā)展也密切相關(guān)。

關(guān)于癌細(xì)胞胞漿內(nèi)β-環(huán)連蛋白表達(dá)增加的原因，目前的看法主要是其降解減緩，而非生成增加。有研究顯示發(fā)現(xiàn)盡管腫瘤細(xì)胞內(nèi)β-環(huán)連蛋白的表達(dá)量增加，而其mRNA水平并無(wú)變化［6，7］，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與上述結(jié)果一致，再一次證實(shí)β-環(huán)連蛋白基因在腫瘤中的表達(dá)無(wú)明顯增加，β-環(huán)連蛋白的高表達(dá)并非其本身合成增加所致。影響β-環(huán)連蛋白降解的因素有Wnt信號(hào)的增強(qiáng)，APC的突變以及β-環(huán)連蛋白本身的突變等。在對(duì)大腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)β-環(huán)連蛋白的高表達(dá)主要與APC的突變有關(guān)，突變后APC不能降解β－環(huán)連蛋白。在Rubinfeld等［8］對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)β-環(huán)連蛋白的增加主要與其本身的突變有關(guān)，β-環(huán)連蛋白突變后可增加其穩(wěn)定性，使其不被降解。Wnt信號(hào)的增強(qiáng)可以抑制APC對(duì)β-環(huán)連蛋白的降解作用［9］。β-環(huán)連蛋白在腎癌癌細(xì)胞胞漿內(nèi)高表達(dá)的原因目前研究尚少。至于β-環(huán)連蛋白本身的突變尚有待進(jìn)一步研究。

總之，β-環(huán)連蛋白作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的重要成分，在腎癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一定有其重要的作用，相信進(jìn)一步的研究對(duì)揭示腎癌的發(fā)病機(jī)制及指導(dǎo)臨床治療有重要的意義。

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